Summary
폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.
Abstract
주사 생체 물질은 액체로 몸에 도입하고 현장에서 응고 될 수 이식 물질로 정의된다. 이러한 물질은 최소 침습적으로 쉽게 불규칙 모양의 결함에 공간을 채우는 고체를 형성 이식되는 임상 적 이점을 제공합니다. 주사 생체 재료 널리 조직 공학을위한 발판으로 조사되었다. 그러나 본문에 특정로드 베어링 영역의 수리를 들면, 추간판로, 비계는 접착 성을 소유해야합니다. 이 힘의 적절한 전송을 제공하는 운동 중에 전위의 위험을 최소화하고 주변 조직에 밀착되도록한다. 여기, 우리는 열에 민감한 폴리 (N- 이소 프로필)로 이루어진 지지체의 제조 및 특성 -graft - 콘드로이틴 황산 (PNIPAAM-g-CS) 및 알지네이트 미세 입자를 설명합니다. PNIPAAm-g-CS 공중 합체 alginat로 RT 중의 점성 용액을 형성즉 입자의 밀착성을 향상시키기 위해 정지된다. 30 ° C의 주위 하부 임계 용액 온도 (LCST) 위의 공중 합체 미립자 주위에 단단한 겔을 형성한다. 우리는 계정에 PNIPAAm-g-CS의 가역적 상전이을 표준 생체 재료 특성화 절차를 적용했다. 결과는 5 %로 50 또는 75 ㎎ / ㎖ 알긴산 입자의 혼입 (/ w를 V) PNIPAAm-g-CS 용액 단독 PNIPAAm-GCS의 접착 인장 강도 (p <0.05) 네 배로 것을 나타낸다. 알지네이트 미세 입자의 결합도 크게 조직 결함 내에서 공간을 채우는 젤을 유지하는 데 도움 PNIPAAm-g-CS의 붓기 용량 (P <0.05) 증가한다. 마지막으로, 2,3- 비스 관내 독성 분석 키트의 결과 (2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨 -5- carboxanilide (XTT) 및 라이브 / 죽은 생존력 분석법는 것을 나타 접착제 생존 캡슐화 인간 배아 신장 증식을 지원할 수있다 (HEK) 293 C오일 이상 ELL 학생.
Introduction
주사 가능한 생체 물질 편리 액체로 체내에 전달 반응계에서 고화 될 수들이다. 이러한 물질은이 셀 (5)을위한 3 차원 임시 외 기질로서 해당 사이트 1-4 행위 캡슐화 세포 전달하기 위해 사용되는 재생 의료에 광범위하게 적용되고있다. 주입 수술 절차와 최소 침습있는 고상 불규칙 정의 크기 임플란트에 대한 필요성을 제거, 조직 결손 형 채울 수 있기 때문에 환자의 경우, 주사 가능한 생체 물질이 유리하다.
입성는 다양한 메커니즘을 통해 달성 될 수있다. 외부 요인은 pH를 원한다면, 세포 및 생체 활성 분자를 캡슐화 6-8 겔의 형성을위한 트리거로 조사되었다. 그러나, pH는 모든 생리적 환경에서 사용하기 가장 편리한 트리거하지 않을 수 있습니다. 또 다른 전통 알터입성을 달성적인 시츄 화학 중합 또는 가교 결합에 사용된다. 그룹은 암모늄 및 N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine 이루어지는 수용성 산화 환원 시스템을 개발하여 폴리에틸렌 글리콜과 폴리 (프로필렌) 9,10 글리콜 이루어지는 거대 단량체의 반응을 위해 사용했다. ZAN 외. 11 개발 주사 키토산 폴리 비닐 네트워크는 글루 타르 알데히드와 가교 결합. 이러한 시스템에서, 반응성 성분의 세포 독성은 세포, 특히 밀봉에 관련된 애플리케이션에 고려되어야한다. 또한, 발열 중합은 고분자 뼈 (12, 13)를 시멘트에 대해보고 된 주변 조직을 손상 충분히 높은 온도를 생성 할 수 있습니다.
또 다른 주사 가능한 중합체 시스템은 트리거로 온도를 고체 상태로부터 액체의 변화를 나타내는 개발되었다. thermogelling 시스템으로 알려진 이들은 aqueo 있습니다우리 현장 형성 (14)에 달성하기 위해 화학적 자극, 단량체 또는 가교제를 필요로하지 않는 폴리머 솔루션을 제공합니다. 오히려 보통 생리 온도 근처에서 발생하는 위상 변화는 물리적으로 가교 된 3 차원 네트워크의 형성을 유도한다. 이러한 플루로 닉 F127과 같은 폴록 사머은 약물 전달 15-17 세포 캡슐화 (18, 19)를 thermogelling에 가장 널리 연구 폴리머 중입니다. 그러나, 물론 이러한 겔이 생리적 조건에서 안정성이 부족한 것이 허용된다. 연구 사슬 연장 제 (20) 또는 화학적 가교제 (21, 22)를 사용하여 향상된 안정성을 증명하고있다. 그럼에도 불구하고,이 시약의 사용은 전지 밀봉 용 재료의 가능성을 제한 할 수있다.
폴리 (N- 이소 프로필)은 조직 공학 및 약물 전달 (14)에 상당한 관심을 받았다 합성 thermogelling의 중합체이다. 폴리의 수용액 (N-isoprop아크릴 아미드) (PNIPAAm)는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 나타내는 일반적으로 약 32 발생 - 34 ° C (23, 24)를. LCST 아래, 물 PNIPAAm 체인 수분을. 전이 온도 이상의 중합체 독성 모노머 또는 가교 결합제를 사용하지 않고 극적인 상분리 25-27 고체 겔의 형성을 초래 소수성된다. 그러나 PNIPAAm 단독 중합체는 가난한 탄성 특성을 나타낸다 의한 소수성 (28)에 생리적 온도에서 약간의 물을 개최합니다. 본 연구에서는 효소 분해성 29 항 염증 활성 (30, 31), 및 증가 된 물 및 영양소 흡수 (32)에 대한 가능성을 제공 PNIPAAm 네트워크에 공유 콘드로이틴 설페이트를 포함하도록 선택. CS와 PNIPAAm 공중 합체는 그래프트 공중 합체 (PNIPAAm-g-CS)를 형성하는 메타 크릴 레이트 - 기능화 CS의 존재하에 단량체를 중합하여 NIPAAm 우리 실험실에서 제조 하였다. 벡공중 합체의 낮은 가교 밀도의 ause는 PNIPAAm-g-CS 인해 LCST 29 RT 중의 점성 용액 및 생리 온도에서 탄성 겔을 형성한다. 중합체 용액 인해 전환 가역성 다시 LCST보다 냉각시 유동성이된다.
우리는 PNIPAAm-g-CS 인해 기계 맞출 수있는 특성, 분해성, 인간 배아 신장 (HEK)와 cytocompatibility 293 세포 (29), 조직 공학 발판 역할을 할 수있는 잠재력을 가지고 있음을 증명하고있다. 그러나, 추간판 등의 특정 부하지지 영역에서, 조직 공학 골격은 탈구 (33)의 위험을 제거하기 위해 디스크 주변 조직과 상당한 계면을 형성 할 수있는 능력을 가져야한다. 이 인터페이스는 임플란트와 조직 (33) 사이의 인터페이스를 통해 힘의 적절한 전송을 위해 필요하다. 우리의 작업에서 우리는 중단 가지고lginate PNIPAAm-g-CS의 수용액에서의 미세 입자 및 겔화 조직 (34) 주변에 접착 성을 제공하는 미세 입자를 지역화 것을 발견했다. 본 논문에서는 thermogelling, 접착제 폴리머의 준비 단계를 설명합니다. 생존율의 표준 생체 재료 특성 세포 이미징을위한 기술 및 분석은 고려 중합체의 온도 감도와 위상 천이의 가역성을 취하도록 하였다. 이 문서에 설명 된 주사 중합체는이 문서에서 설명 된 이외의 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 다양한 가능성이있다. 또한, 여기에 설명 된 특성화 방법 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.
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Protocol
1. 폴리 (N- 이소 프로필) -g-콘드로이틴 황산 합성
- 바이오 부착 하이드로 겔의 합성하기에 앞서, N- 이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAAm) 단량체 및 메타 크릴 레이트 콘드로이틴 설페이트 (CS) 정제.
- NIPAAm 적어도 10g을 칭량하고, 60 ℃에서 n- 헥산 400 ㎖ 중의 단량체를 용해. 완전히 용해 될 때까지 정기적으로 컨테이너를 저어. 24 시간에 대해 -20 ° C에 냉동 용액을 재결정.
- 용기 및 진공 필터로부터 흐너 깔때기를 사용하여, n- 헥산을 결정 성 단량체를 제거한다. 나머지 n- 헥산을 제거하기 위해 24 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 단량체를 놓는다. 나중에 사용하기 위해 -20 ° C 냉장고에있는 단량체를 저장 (단계 1.2 참조).
- 칭량하고 탈 이온수 8.0 ㎖에 콘드로이틴 설페이트 2.0 g을 용해. 조심스럽게 60 ℃로 용액을 가열한다.
- (w / w)의 50 %의 약 10 내지 40 μL를 사용하여 (10) 용액의 pH를 NaOH를 조절.
- 메타 크릴 산 무수물 (MA)의 0.298 ML을 추가합니다. 24 시간 동안 환류하에 60 ℃에서 교반하면서.
- -20 ℃로 냉장고에 항아리 냉각 O / N에 아세톤 용액 400ml를 붓는다.
- 24 시간 경과 후, 자기 교반 막대로 교반하면서 천천히 차가운 아세톤 400 mL를 메타 크릴 레이트로 전체 CS (MCS) 용액을 붓는다.
- 아세톤에서 MCS를 제거하고 진공 오븐에 침전물을 배치합니다. MCS에 대한 손상 및 응집 상태를 유지하기 위해 신속하게이 단계를 수행합니다. 잔류 아세톤은 최소 24 시간 동안 진공 상태에서 증발하도록 허용합니다.
- 정제 NIPAAm 10 g 및 탈 이온수 232 ㎖ 중의 2.209 g의 MCS 동시 - 녹인다.
- 불활성 질소 가스를 이용하여 산소를 제거 용액. 15 분에 걸쳐 버블 링에서 용액을 방지하기위한 활발한 아직 낮은 가스 유량을 유지한다.
- 질소 가스로 퍼징 용액을 계속 tetramethylet의 0.976를 가하여hylenediamine (TEMED).
- 이어서,과 황산 암모늄 (APS)의 97.6 mg을 혼합하여, 중합 반응을 개시.
- 약 20 초 동안 용액을 혼합하고 신속하게 용기에 유입하는 공기를 예방하기 용액을 밀봉. 이 솔루션은 24 시간 동안 형광등 아래에서 중합 할 수 있습니다.
- 24 시간 후, 37 ° C 오븐에 반응 용기를 놓습니다. 하이드로 겔은 겔 상태로, 액체에서 전환 할 수있다. 하이드로 겔 중에서 미 반응 모노머의 확산을 허용 7 일의 총 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 중합 된 하이드로 겔을 담근다.
- 가위를 사용하여, 직경 5 ㎝보다 크지 않은 여러 개의 작은 조각으로 하이드로 겔을 절단. 액체에 겔 상태로부터 천이에서 하이드로 겔을 방지하기 위해, 37 ° C PBS 용액 내의 중합체 주사위. 50 ML 원뿔 튜브에 부분을 전송합니다.
- 의 상단을 포장하여 동결 건조에 대한 샘플을 준비매직 잉크를 킴 와이프와 고무 밴드와 튜브. 1 내지 2 시간 동안 -70 ℃에서 튜브를 고정.
- 하이드로 겔에서 물을 모두 제거하는 동결 건조기에 원뿔 튜브를 놓습니다. 사용하기 전에 동결 건조기는 각각 대략의 온도 및 압력 -40 C 0.04 밀리바 °에 도달 할 필요가있다. 칠일의 최소 완전 건조가 필요합니다.
- 나중에 사용 (단계 3.1 참조) 4 ° C 냉장고에 미세 분말 및 저장에 폴리머를 건조 동결을 갈기.
2. 칼슘 알지네이트 가교 미세 입자 합성
- 2 % 준비 (/ w를 V)를 탈 이온수 20 ㎖에 400 mg의 용해 알지네이트 용액. 용해를 용이하게하기 위해 약 60 ℃로 용액을 가열한다.
- 탈 이온수 20 ㎖에 400 mg을 첨가하여 (w / v)의 염화칼슘 용액을 2 %를 준비한다.
- 카놀라유 100 ㎖, 트윈 20의 1.0 ㎖, 20 ㎖의 물을 조합하여 혼합물을 오일 만들기2 % (w / v)의 알긴산. 15,000 rpm에서 균질화기로 10 분간 혼합 유화. 또한, 각각 크고 작은 미립자를 생성하기 위해 200 rpm으로 2,000 rpm으로 자기 교반 막대로 혼합한다.
- 2 %를 대기음 18 G 바늘 팁 주사기를 사용하여 염화칼슘 용액 (/ V w). 천천히 적가 에멀젼에 염화칼슘을 추가합니다.
- 염화칼슘의 20 ㎖이 소진 된 후에 에멀젼 내의 미립자가 10 분 동안 가교 결합 할 수있다.
- 균등 카놀라유의 초기 층을 제거하기 위해 2 분 동안 1,400 XG의 힘으로 덮인 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 미세 입자의 배치를 배포 할 수 있습니다.
- 연속적으로 세척, 소용돌이, 그리고 원심 분리기 이소프로판올로 미세 입자는 2 분 동안 1,400g 3 회 총 잔류 카놀라 기름을 제거합니다. 각 원심 분리 단계 후 이소프로판올 뜨는을 취소하고 신선한 이소프로판올로 세척한다.
- Oi의 일단리터가 제거 된, 잔류 이소프로판올을 제거하는 탈 이온수로 세척 절차에 세 추가 번 반복합니다. 각 원심 분리 단계 후 탈 이온수 뜨는을 취소하고 신선한 탈 이온수로 세척한다. 유리 병에 젖은 미립자 및 저장의 약 100 밀리그램을 제거합니다. 습식 미립자를 광학 현미경에 의해 배치의 평균 직경을 측정하는 데 사용된다.
- 광학 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드를 탈 이온수에 젖은 미립자의 작은 샘플을 분산. 미립자의 크기에 따라 10 배 또는 20 배 대물 렌즈를 사용하고, 입자가 초점이 될 때까지의 개구를 조정한다. 현미경 올바른 목적을 위해 조정되어 있는지 확인하고 필요에 따라 광원의 밝기를 조정합니다. 50 임의 알지네이트 미세 입자의 가장 긴 직경을 측정하고 일괄 처리의 평균 크기를 얻기 위해 줄 도구를 사용합니다.
- 동결 건조 (B)의 미세 입자를 준비Y는 매직 잉크를 킴 와이프로 포장 및 고무 밴드로 고정. 1 시간 동안 -70 ℃에서 동결 미립자.
- 동결 건조기의 미립자를 놓고 샘플이 최소 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 4 ° C 냉장고에 동결에게 박격포와 유 봉 저장소를 사용하여 미세 분말로 건조 된 미세 입자를 갈기 (단계 3.3 참조).
접착제 3. 준비
- 동결 건조 중합체 분말을 사용하여, 1X PBS 1 ㎖에 겔 분말을 50mg 용해시켜 PNIPAAm-g-CS 용액 (V / w) 5 %를 생성한다.
- 24 시간 동안 4 ℃의 냉장고에 와류와 냉기를 이용하여 용액을 혼합한다.
- 점성 용액을 형성하면, 하이드로 겔 용액 와류 동결 건조 알지네이트 미립자의 25 또는 50 mg을 첨가하여 균질 한 복합체를 만든다. 나중에 사용하기 위해 (단계 4.3 및 4.8 참조) 4 ° C에서 냉장고에 복합을 저장합니다.
4. 생체 접착 메크anical 인장 시험
- 이전 인장 시험을 수행하기 위해, 돼지 귀에서 연골 기질의 압축을 풉니 다.
- 따뜻한 0.9 %에서 돼지 귀 제상 (w / v)의 염화나트륨 수용액; 이 조직을 완화하는 데 도움이 될 것입니다.
- 메스를 사용하여, 표피층, 피하 조직 및 연골 비록 수직 절단 평평한 직사각형 영역 떨어져 분리하고 부. 돼지의 귀 곡선 능선을 절단하지 마십시오.
- 피하 조직을 평행 절단함으로써 연골에서 피부의 표피 층을 분리한다. 연골은 돼지의 피부 아래에 볼 수있는 하드, 흰색 조직이다.
- 조심스럽게 메스의 측면 연골에 부착 된 피하 조직을 긁어. 메스 블레이드와 연골 조직으로 절단하지 마십시오.
- 연골의 한쪽 만이 노출되고, 인장 시험 중 평탄한 것을 확인. 필요한 경우, 하부에 요철 피부를 절단함으로써 연골 평탄화.
- 1cm X 1cm의 크기와 여러 조각으로 연골 조직을 잘라. C 냉동고 °에서 -20 0.9 % (w / v)의 염화나트륨 용액으로 채워진 원뿔 튜브의 연골 조직을 저장합니다.
- 0.9 % (w / v)의 염화나트륨 용액 2.0 L를 준비합니다. 37 ° C로 식염수를 예열. 이 용액의 온도를 테스트 동안 유지 될 필요가있다.
- 얼어 붙은 연골을 해동. 돼지의 연골과 얼음 팩과 스티로폼 용기의 하이드로 겔 샘플을 모두 유지합니다.
- 테스트 스탠드의 팔에 힘 게이지를 부착합니다. 힘 스탠드 상단에 핫 플레이트를 놓고 50 ° C까지 온도를 설정합니다.
- 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 스테인레스 스틸 블록과 핀셋에 연골의 1cm X 1cm 조각을 붙입니다. 델린 실린더에 연골의 추가 조각을 접착제와 힘 게이지에 실린더를 연결합니다. 모두 연골 표면이 서로 마주하고 하이드로 겔에 문의하는 것이 매우 중요합니다.
- 장소핫 플레이트의 상단에있는 플렉시 유리 물을 욕조 및 목욕 내부의 연골 기판과 스테인리스 스틸 블록을 삽입합니다.
- 테스트 스탠드의 팔을 내리고 서로 모두 연골 기판을 맞 춥니 다. 팔을 올리고 하이드로 겔을 적용 할 충분한 공간을 확보합니다.
- 용적 피펫 연골의 바닥 부분에 생체 접착 성 하이드로 겔을 200 μL 분주.
- 1mm의 힘 스탠드의 아암 상 / 분 하이드로 겔 콘택트 연골 상부 조각까지 0.001 N.의 프리로드 힘을가
- 볼륨이 지정 수위에 도달 할 때까지 수조에 37 ℃의 생리 식염수를 부어. 열전대를 가진 용액의 온도를 확인한다.
- 하이드로 겔 5 분 총 설정할 수 있습니다. 겔이 고체화되면, 2mm / 분의 속도로 암을 올린다. 바이오 부착이 연골 기질에서 분리 후 또는 강제의 상당한 저하가 발생하면 테스트가 완료고장 신호.
- 기록 된 데이터를 수집하고 테스트 스탠드의 팔을 올립니다. 힘 게이지에서 델린 실린더를 제거합니다. 이전 용기에 식염수를 붓고 37 ° C로 재가열.
- 동일한 속도로 승온없는 연골 또는 접착제와 함께 "빈"을 델린 부착 부력의 중합체에 의해 가해지는 힘을 감산하고, 접착 면적으로 나누어 응력을 계산한다.
알긴산 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 5. 붓기 연구
- 깨끗한 유리 병을 준비하고 시점, 샘플 타입, 샘플 번호를 적절하게 레이블을 붙입니다. 전술 한 바와 같이, 접착제는 또한 생성 될 수있다. 시점에 따라 각각의 샘플 유형에 대해 5 개의 샘플 (N = 5)의 총을 준비합니다.
- 모든 유리 병을 미리 무게 RT에서 초기 질량을 기록한다.
- 주사기를 사용하여 다섯 개의 튜브 각각에 준비된 접착제 샘플의 약 0.4 mL로 분배.모든 테스트 시점에서 각각의 샘플 유형에 대해이 단계를 반복합니다.
- 체중 및 RT에서 접착제 샘플 타입 바이알의 질량을 기록한다.
- 궤도 인큐베이터와 37 ° C에 1X PBS 용액 1 L를 미리 따뜻하게.
- 랙에 유리 병을 모두 정리하고 인큐베이터에 랙을 삽입합니다. 접착제는 약 5 ~ 10 분 동안 겔에 액체에서 전환 할 수 있습니다.
- 각 바이알에 1X PBS의 5.0 ML을 추가합니다. 신중하게 떨어져 파손 하이드로 겔 디스크를 방지하기 위해 유리 병의 측면을 따라 PBS 솔루션을 추가해야합니다.
- PBS를 용액의 증발을 방지하고, 37 ° C의 배양기의 내부 온도를 유지하기 위해 각각의 바이알을 캡핑. 하이드로 겔 디스크의 각 세트는 시간의 지정된 기간 동안 PBS에 잠긴 상태로 유지해야한다.
- 7 일간의 시점에 도달 한 후, 바이알의 뚜껑을 벗기다 세트를 각 바이알로부터의 PBS 용액을 제거한다. RT에서 다시 접착 샘플 각 유리 병의 무게를.
- PNIPAAm-g-CS와 라이브 / 죽은 분석을 수행하기 전에, 인간 배아 신장 80 %의 합류에 293 세포 (HEK-293)을 성장.
- 이어서 15ml의 원뿔형 튜브에 5 분 동안 39 ° C에서 400 XG에서 세포를 원심 분리하여, 37 ° C의 물을 용기에 cryovial 배치하여 고정 된 HEK-293 세포 현탁액을 급속 해동.
- 제 1 통로 세포 성장 배지하려면 (4.5 g / L) 둘 베코 변형 20 %의 최종 농도 및 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액에 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)과 이글 배지 (DMEM) (높은 포도당 결합 펜 연쇄상 100 IU / ml의 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신을 최종 농도). 다른 모든 통로를 들어, 10 % FBS 및 1X 펜 연쇄상 구균과 DMEM로 전환합니다.
- 성장 배지 10 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁 한 100mm 직경의 배양 접시에, 현탁액을 전송. 균등 D부드럽게 백업하는 요리 앞을 기울여 세포를 istribute과 몇 번 각 방향을 왼쪽에서 오른쪽.
- 배양 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포. 필요한 경우, 매 2 일 매체를 변경합니다.
- 세포가 80 % 포화 상태에 도달하면, 여러 요리에 문화를 복제합니다. 플레이트에서 매체를 제거합니다.
- 접시에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
- 문화 1:10, 분할의 경우 트립신 세포에 정규 성장 배지 (DMEM 10 % FBS)의 9를 가하여 부드럽게 접시를 기울여 섞는다.
- 각각의 새 접시에 희석 세포 현탁액 1 ㎖를 분배 및 성장 매체의 9를 가하여. 조심스럽게 접시를 기울여 섞는다.
- 배양 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포. 필요한 경우, 어느 매체를 변경y를 셀 때까지 이틀 80 %의 합류에 도달합니다.
- 80 %의 합류로 성장이 배양 접시에서 용지를 제거합니다.
- 각각의 판에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
- 배 성장 매체 3 ㎖와 함께 접시에 HEK-293 세포를 씻으과 같은 15 ML 원뿔 튜브에 모두 현탁액을 추가합니다.
- 4 ° C에서 400 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고로 pipetting 아래로 매체의 3 ㎖의 세포 펠렛을 resuspend.
- 피펫으로 혈구 세포 현탁액 10 μL 및 세포 밀도를 결정하는 세포 수를 수행한다. 농도가 너무 낮 으면, 목표 승낙을 보존하기 위해, 볼륨 감소 반대로 초기 세포 농도가 너무 높으면 중간의 서스펜션 부피를 증가시키고,1 × 106 세포 / ml의 배급. 원심 분리기는 HEK-293 400 XG에 세포 따라 미디어 보정 부피 세포 펠렛을 재현 탁.
- 부드럽게 세포 현탁액 와동 균등 다음 시험 조건에 대해 네 개의 개별 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 혼합물을 분산 : PNIPAAm-g-CS에서 양성 대조군 단층 마이너스 살해 제어 (V / V) 메탄올 70 %를 사용하여 HEK-293 알지네이트 미세 입자로 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 된 세포 및 HEK-293 세포.
- 4-6 복제 샘플을 생성하기 위해 24 웰 플레이트 세포 믹스 여러 300 μL 부피 피펫 팅하여 양성 대조군 단일 층을 생성한다.
- 알지네이트 미세 입자로 사망 제어, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS에 관한 원뿔 튜브에서 용지를 제거합니다.
- 400 XG에 5 분 동안 원뿔 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
- ㄴ을 재현 탁하여 동일한 세포 농도를 유지제거 된 미디어로 PNIPAAm-g-CS의 같은 볼륨에서 ELL 학생. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 폴리머 전지 믹스를 피펫.
- 알긴산 미립자로 시딩되면 35 mm dish에 (6.10.2에 기술 된 바와 같이 수득)을 PNIPAAm-g-CS 세포 현탁액을 전달하고 혼합으로 입자를 소개한다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
- 6 복제 샘플 - 혈청 학적 피펫을 사용하여, 사망 제어를위한 각 웰에 폴리머 전지 믹스의 여러 300 μl를 분배, PNIPAAm-g-CS 및 알지네이트 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 4를 생성합니다.
- (중합체가 불투명 한 흰색 디스크를 형성) 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어과 PNIPAAm-g-CS는 겔 액체에서 전환 할 수 있습니다.
- 후드에서 슬라이드 따뜻한 놓고 37 ° C까지 온도를 설정합니다. 웰 플레이트를 유지하기 위해 따뜻한 슬라이드를 사용하여온도와 피펫 각 웰에 미리 예열 미디어 600 μL. 또한 액체 상태의 중합체의 전이를 방지하기 위해, 위의 공기를 따뜻하게 접시 위에 형광 전구 램프를 배치합니다.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 5 일 동안 세포를 품어.
- 오일이 경과 한 후, 에티 디움 호모 다이머 (EthD-1)과 칼 세인의 AM을 사용하여 라이브 / 죽은 색소 믹스를 준비합니다. 두 물질은 빛에 민감하고 사용 당일에 준비가되어 있습니다.
- RT에서 키트에서 칼 세인의 AM과 EthD-1을 해동.
- 원뿔 관에 멸균 1X PBS의 5 ML을 추가하고 알루미늄 호일에 포장.
- 원뿔 튜브에 2 mM의 EthD-1의 6.67 μl를 추가합니다. 완전히 혼합 용액을 소용돌이.
- 다음으로, 원뿔 튜브에 4 MM의 칼 세인의 AM 2.5 μl를 추가합니다. 철저하게 혼합물을 소용돌이.
- 단일 층 (양성 대조군), PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS 지혜의 우물에서 용지를 제거H 알긴산 미립자. PBS로, 철저하게, 조심스럽게 우물을 모두 세척하고 PBS를 제거합니다.
- 알긴산 미립자를 함유하는 하이드로 겔 디스크 RT에서 액화하고, 각 웰에 50 mM의 시트르산 나트륨 2 ㎖를 추가 할 수있다.
- 살해 세포 우물에서 미디어 (음성 대조군)를 제거합니다. 하이드로 겔 디스크는 실온에서 액화 및 각 웰에 70 % (v / v)의 메탄올 300 μl를 추가 할 수 있습니다.
- 37 ° C에서 45 분 동안 접시를 품어.
- 웰에서 시트르산 나트륨 메탄올 용액을 제거하고 개별적인 마이크로 원심 튜브에 하이드로 겔 현탁액 각각의 피펫. 하이드로 겔 현탁액으로부터 세포를 분리하기 위해 10 분 동안 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 원뿔 튜브에서 솔루션을 피펫 팅하여 세포 펠렛 뒤에 남겨 정지를 제거합니다. PBS 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 원래 잘 판에 전송할 수 있습니다.
- t의 300 μl를 추가그 / 웰의 각각에 죽은 염료 혼합 라이브. 알루미늄 호일에 잘 판을 싸서 실온에서 로커에 45 분 동안 품어.
- 이미지 10X 목적으로 반전 형광 현미경 모든 샘플. 살아있는 세포 살해 세포는 각각 녹색과 빨간색 형광 표시됩니다.
XTT의 분석을 사용하여 7 양적 세포 생존
- 80 %의 합류에 HEK-293 세포를 성장. 두 개의 배양 접시에서 성장 용지를 제거합니다.
- 각각의 판에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
- 두 미디어의 3 ㎖와 함께 접시에 HEK-293 세포를 씻으과 같은 15 ML 원뿔 튜브에 모두 현탁액을 추가합니다.
- 4 ° C에서 400 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
- 상등액을 제거하고 용지 (3)를 가하여 세포 펠렛을 재현 탁로 pipetting 아래로.
- 피펫으로 혈구 세포 현탁액 10 μL 및 세포 밀도를 결정하는 세포 수를 수행한다. 전술 한 바와 같이, 1 × 106 세포 / ml의 목표 농도를 유지. 원심 분리기는 HEK-293 400 XG에 세포 따라 미디어 보정 부피 세포 펠렛을 재현 탁.
- 부드럽게 세포 현탁액 와동 균등 다음 시험 조건에 대해 네 개의 개별 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 혼합물을 분산 : PNIPAAm-g-CS에서 양성 대조군 단층 마이너스 살해 제어 (V / V) 메탄올 70 %를 사용하여 HEK-293 알지네이트 미세 입자로 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 된 세포 및 HEK-293 세포.
- 6 복제 샘플 - (4)를 생성하기 위해 24 웰 플레이트에 세포 믹스 300 μl를 피펫 팅에 의해 긍정적 인 제어 단일 층을 만듭니다.
- 살해 제어에 관한 원뿔 튜브에서 용지를 제거, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-G-알지네이트 미세 입자와 CS.
- 400 XG에 5 분 동안 원뿔 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
- 제거 매체와 같은 PNIPAAm-g-CS와 동일한 부피의 세포를 재현 탁하여 동일한 세포 농도를 유지한다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
- 알지네이트 미세 입자로 시드 경우 35mm 배양 접시에 PNIPAAm-g-CS-세포 현탁액을 전송하고 혼합으로 입자를 소개합니다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
- 6 복제 샘플 - 혈청 학적 피펫을 사용하여, 사망 제어를위한 각 웰에 폴리머 전지 믹스 300 μl를 분배, PNIPAAm-g-CS 및 알지네이트 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 4를 생성합니다.
- 일단 세포 함유 시료 모두 24 웰 플레이트에 첨가되고, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPA 여러 300 μL 부피를 분배6 복제 샘플 - AM-g-CS 인접 우물에서 세포없이 알지네이트 미세 입자와 4를 생성합니다.
- (중합체 불투명 백색 디스크를 형성하는) 10 내지 15 분 동안 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 인큐베이션하고 PNIPAAm-g-CS는 겔에 액체에서 전환 할 수있다.
- 후드에서 슬라이드 따뜻한 놓고 37 ° C까지 온도를 설정합니다. 각 웰에 미리 예열 분명 DMEM의 웰 플레이트 온도와 피펫 600 μl를 유지하기 위해 슬라이드 따뜻한을 사용합니다. 또한 액체 상태의 중합체의 전이를 방지하기 위해, 위의 공기를 따뜻하게 접시 위에 형광 전구 램프를 배치합니다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 5 일 동안 세포를 인큐베이션.
- 오일이 경과 한 후, 제조에서 2,3- 비스 - (2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨 -5- carboxanilide (XTT) 시약을 준비한다. XTT 시약은 사용 당일 빛에 민감하고 준비가되어 있습니다.
- 황색 병이 포함 제거냉장고에서 XTT 분말을 보내고. 멸균 주사기와 주사 바늘을 사용하여, 황갈색 병에 고무 격막을 통해 분명 DMEM (페놀 레드 없음) 5 ㎖를 주입.
- 10 분 동안 또는 용해 될 때까지 수조에서 56 ℃까지 반응물을 가열 하였다.
- 또한 알루미늄 호일에 싸서 15 ML 원뿔 튜브에 20 % (v / v)의에 XTT 시약을 희석. 마이크로 원심 튜브에 과잉 XTT 시약을 나누어지는 및 장기 저장을 위해 -20 ° C 냉장고에 넣습니다.
- 살해 세포 우물에서 미디어 (음성 대조군)을 제거하고 각 웰에 70 % (v / v)의 메탄올 300 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 45 분 동안 품어 우물에서 메탄올을 제거합니다.
- 단일 층 (양성 대조군), PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS 알지네이트 미세 입자와의 나머지 우물에서 용지를 제거합니다. PBS로, 철저하게, 조심스럽게 우물을 모두 세척 한 후 PBS를 제거합니다.
- 2 300 μl를 추가웰 각각 0 % XTT 시약. 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 싸서 실온에서 로커에 24 시간 동안 배양한다.
- 24 시간 후, 모든 웰을 50 mM의 시트르산 나트륨 200 μL를 추가 한 추가 시간 동안 로커에서 배양한다.
- RT에서 10 분 동안 2,000 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 중합체 현탁액 모두 옮긴다.
- 96 웰 플레이트에 각 microcentrifuge 관에서 상등액 200 μL를 옮긴다. 미세 적정 플레이트 판독기를 사용하여 690 nm에서 450 nm의 비특이적 흡광도 판독 값에 특정의 흡광도 판독 값을 얻었다.
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Representative Results
열적 반응 그래프트 공중 합체를 성공적으로 합성 및 생체 접착 강도를 특징으로, 속성을 팽창하고, 생체 외 cytocompatibility에 있었다. 우리는 인해 잘 설립 점막 부착 특성에 알긴산을 조사하기로 결정했습니다. 14.9 ± 59.7 μm의 평균 직경을 갖는 미립자는 알긴산, 5 % 배합 (W / V) 25, 50, 75 ㎎ / ㎖의 농도에서 PNIPAAm-g-CS. 이러한 농도는 동일 반, 및 수용액 PNIPAAm-g-CS의 두 배에 해당 건조 중량을 기준으로 하였다. 75 mg의 상기 미립자 농도 / ㎖ 과도한 점도를 나타내과 조사되지 않았다. 5 %의 최대 인장 접착 강도 (W / V) PNIPAAm-g-CS 알지네이트 미립자의 농도 변화 형 하이드로 겔과 비교되었다. (/ V W) PNIPAAm-g-CS가 4 배 INC 결과 (50) 75 mg을 첨가는 / 알긴산 미립자 ml의 5 %에 현탁인장 강도 (p에 rease <도 1에 도시 된 바와 같이 0.05). 25 ㎎ / ㎖의 미립자의 농도는 5 % (w / v)의 PNIPAAm-g-CS (p에 비해 인장 강도의 상당한 증가를 나타내지 않았다> 0.05). 5 %의 인장 강도에서 어떠한 유의 한 변화가 없었다 (/ w를 V) PNIPAAm-g-CS 알지네이트 미립자의 농도가 50 내지 75 밀리그램 / ㎖ (p> 0.05)로 증가 할 때.
바이오 부착 하이드로 겔의 팽창 특성은 37 ℃에서 PBS 다양한 제형 침지 특징 하였다. 25 및 50 밀리그램 / ㎖의 알긴산 미립자 농도 동작 팽윤의 차이를 식별하기 위해 시험 하였다. 알긴산 미립자를 광학 현미경을 사용하여 측정 및 25.0 ± 14.4 μm의 평균 직경을 가지고 있었다. 7 일 후, 기록했다 하이드로 겔 디스크의 초기 및 최종 습윤 질량과 질량의 변화는 접착제 formulatio 당 여러 개의 샘플에 대해 계산 하였다N (N = 5).도 2는 모든 제형 사이 질량의 변화의 급격한 변화를 나타낸다. 5 % (W / V) PNIPAAm-g-CS 질량 감소하면서 알지네이트 미세 입자 모두 25 및 50 ㎎ / ㎖를 포함하는 접착제는, 대량의 긍정적 인 변화를 보여 주었다. 모든 샘플은 하나 크게 다른 것으로 나타났다 50 밀리그램 / 최대 팽윤 효과를 나타내는 알지네이트 미립자의 용액을 함유하는 접착제가 다른 (p <0.05).
제안 된 접착제는 생체 적합성 / 라이브 데드 XTT 및 세포 독성 분석을 사용하여 정량적 조사 하였다. HEK-293 세포는 모두 5 %로 캡슐화 된 (w / v)의 PNIPAAm-g-CS 및 5 % (w / v)의 PNIPAAm-g-CS는 59.7 ± 14.9 μm의 평균 직경이 50 밀리그램 / 알긴산 미립자의 용액을 포함 . 70 % 메탄올로 사망 PNIPAAm-g-CS 세포와 캡슐화 된 세포의 단일 층은 양극과 NEGA 여겨졌다각각 컨트롤을 포지티브,. 셀 시드 제제는 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 성장 후에있어서 오일 하였다. 각 테스트는 PNIPAAm-g-CS 및 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 모두 좋은 세포 생존을 지적했다. 도 3의 이미지는 양성 대조군 (패널 C)로서, 모두 접착제 제제 (패널 A 및 B) 및 세포 단층에서 녹색 형광을 살아있는 세포를 나타낸다. 살해 세포 (패널 D)은 적색 형광을 세포 사멸을 나타낸다. XTT 세포 독성 시험 결과는 라이브 / 죽은 분석의 결과를 확인 하였다. 미립자의 50 ㎎ / ㎖를 함유하는 접착제의 상대적인 세포 생존율은도 4에 도시 된 바와 같이 PNIPAAm-g-CS와 비교하여 1.3 배 감소하지만, 감소 (p> 0.05) 통계적으로 유의하지 않았다. PNIPAAM-g-CS 및 미세 입자와 PNIPAAM-g-CS 모두는 세포 단층 (p> 0.05)에 비교 가능성을 가지고 있었다. 히드 록 사이드에 캡슐화 된 세포ogel 제제 및 세포 단층은 음성 대조군 (p <0.05)에 비해 크게 다른 것으로 나타났다. 전반적으로, 이러한 결과는 미세 입자를 함유하는 접착제가 아니라 전시품 접착력하지만 좋은 생체 적합성도 증가하는 것이 시사한다.
그림 1. PNIPAAm-g-CS (/ V 승) 5 %로 알긴산 미세 입자의 다양한 농도를 통합 한 후 인장 강도에 미치는 영향. PNIPAAm-g-CS의 인장 강도가 50, 75 밀리그램 / 알긴산 미립자 (p <0.5)의 용액을 첨가하여 배로. 오차 막대는 계산 된 95 % 신뢰 구간을 나타내는 (N = 5). 알긴산 미세 입자는 ± 14.9 μm의 59.7의 평균 크기를 가지고 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 5 %의 팽창 용량에 알긴산 미세 입자의 다양한 농도의 효과 (/ V 승) PNIPAAm-g-CS가. 37 ° C PBS 7 일 침지 한 후, PNIPAAm-g-CS 인해에 젖은 질량 감소 LCST 위에 PNIPAAm의 소수성. PNIPAAm-g-CS 25 또는 50 밀리그램 / 기능을 붓기 전시 알지네이트 미세 ml의와. 미립자의 농도가 매우 수분 흡수에 기인 한 (p <0.05) 7 일간 하이드로 겔의 질량 변화를 증가 증가시킨다. 오차 막대는 계산 된 95 % 신뢰 구간을 나타낸다. 알긴산 미세 입자는 ± 14.4 μm의 25.0의 평균 크기를 가지고 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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5 일의 기간 동안 배양 HEK-293 세포의 그림 3. 대표 라이브 / 죽은 형광 이미지는. 세포는 알긴산의 50 ㎎ / ㎖와 (A) PNIPAAm-g-CS와 (B) PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 된 미세 입자. 세포는 각각 양성 및 음성 대조군을 나타내는 PNIPAAm-g-CS에 메탄올 살해 (C)과 단일 층 (D)에서 재배 하였다. 라이브 / 죽은 생존력 실험 실험 당 세 개의 복제로 3 회 반복 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 알긴산 미세 입자는 ± 14.9 μm의 59.7의 평균 크기를 가지고 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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와 알지네이트 미세없이 PNIPAAm-g-CS 내에서 캡슐화 된 HEK-293 세포의 알긴산 미세 입자. 생존과 PNIPAAm-g-CS의 HEK-293 세포의 그림 4. 단기 생존 능력을 평가, 5 일 후에 XTT를 사용하여 비교 하였다. 70 % 메탄올로 사망 PNIPAAm-g-CS에서 세포 단층 및 캡슐화 된 세포는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용 하였다. 두 PNIPAAm-g-CS 및 알지네이트 미립자와 PNIPAAm-g-CS는 세포 단층에 비해 세포 생존율의 유의 한 감소 (p> 0.05) 없음 아직 사망에 비해 세포 생존 능력의 상당한 감소 (p <0.05) 세포. 알긴산 미립자의 첨가는 대폭 PNIPAAm-g-CS (p> 0.05)의 세포 생존율을 손상하지 않는다. 오차 막대는 계산 된 95 % 신뢰 구간을 나타내는 (N = 3, 실험에 6 회 반복). 알긴산 미립자 59.7 ± 14.9 μm의 평균 크기를 가졌다.심판 = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
하이드로 겔 미세 입자 복합체를 합성하고 접착 강도를 평가, 능력 및 세포 생체 적합성을 붓기 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. PNIPAAm-g-CS의 자유 라디칼 중합은 콘드로이틴 설페이트 성공적 메타 크릴 단량체 성분을 완전히 용해 및 무산소 반응 조건을 필요로한다. 이 네이티브 추간 원판 조직 (29)과 유사한 기계적 특성을 갖는 공중 합체를 생성하기 위해, 우리의 이전 연구에서 입증 되었기 때문에, 반응 혼합물 중 메타 크릴 레이트 콘드로이틴 설페이트 NIPAAm 단량체의 비율은 선택되었다. 하이드로 겔 콘드로이틴 설페이트의 양을 늘리면 겔화 중에 수분 손실을 감소시키고, 따라서 겔의 압축 강성이 감소한다. 수용액에 용해 될 때 메타 크릴 화의 선택도는도 18 G 바늘을 통하여 입성 유리한 처리 특성을 갖는 하이드로 겔을 제조하는 것으로 입증 된 <SUP> 29. LCST 아래 증가 용액 점도를 일으키고 기능을 팽윤 겔을 감소 고분자 네트워크의 가교 밀도를 증가 할 CS의 크릴 교체 증가 정도. 기타는 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP) 35 또는 역방향 부가 분열의 연쇄 이동 (RAFT) (36)로 PNIPAAm 하이드로 겔의 합성에 다른 방법을 연구 하였다. ATRP 중합을 통해 비 이니시에이터 단량체를 변경하여 튜닝 순화 분자량 좁은 다 분산 하이드로 겔의 개발을 유도 하였다. 관능기 따라서 중합체 사슬 얽힘 및 상 분리에 영향을 미치는, RAFT 중합하여 빗살 형상으로 그래프트 될 수있다.
균질 유 중수 혼합물을 균일 한 가교 결합 된 알기 네이트 미립자를 만드는 것이 필요하다. 유화 방법은, 그러나 둘 micropa 수행 간단하고 유해한 화학 물질의 사용을 요구하지 않는다rticle 모양과 분포를 제어하기가 어렵다. 미립자 크기에 따라서 작은 입자와 반대를 생성 에멀젼 교반 속도를 증가시킴으로써 변경 될 수있다. 이 특정 연구에서, 알지네이트 미립자의 크기는 부종, 기계, 또는 세포 생존 능력에 영향을 미칠 수있는 잠재적 인 속성으로 조사 하였다. 광산란 또한 평균 미립자 크기를 측정하는 대신 이용 될 수있다. 이러한 계면 활성제의 종류 및 알긴산 농도와 같은 다른 유화 특성은 미세 입자의 크기와 골재 형성 (37)에 영향을 미칠 것입니다. 미립자 크기를 줄이는 것이다 알긴산의 농도를 감소하지만 응집이 형성되기 더 쉽다. 계면 활성제의 친수성과 소수성의 변동 때문에 에멀젼 내의 액적 크기 변경, 오일 및 물 상 사이의 표면 장력에 영향을 미칠 것이다. 알긴산 미립자는 다르게 균일 particl 허용하는 미세 유체 소자를 사용하여 제조 될 수있다E 형상과 좁은 입도 분포 38. 이 기술은 채널을 통해 흐르고, 염화칼슘 욕 입사 연속 오일 상 내에 분산 알긴산 위상 포함한다. 스프레이 draying는 아주 작은 미세 입자 (39)를 생성하는 또 다른 기술이다. 그 알긴산 단백질 또는 성장 인자와 함께로드 될 수 있고, 가교 아연 또는 바륨과 같은 다른 가의 이온이 될 수 주목하는 것도 중요하다.
이 작품에서 우리는 조직 공학의 잠재적 인 응용 프로그램과 접착 시스템을 특징. 우리의 인장 시험시 특히 돼지 연골 접촉 복합체의 접착 강도를 정량화하는 것이다. 기판의이 유형은 추간판의 연골 단부 판에 하이드로 겔 복합체의 접착 성을 모방하기 위해 선택되었다. 이러한 돼지 피부와 같은 다른 조직 기재는, 접착제 (40)의 강도를 정량화하는 대안으로서 사용될 수 있지만, 티슈 타입 것의도 된 용도에 따라 다양하다. 식염수 수조 사용하기 전에 복합 미리 냉각 적합한 온도 제어를 유지 정확한 기계적 특성을 측정하는 데 중요하다. 37 ℃ 이상의 상승 된 수욕 온도는 37 ° C 기계적 이하 시험 복합 의한 상 분리의 부족으로 인장 강도를 나타낼 것이다 감소 동안 하이드로 겔이 급격히 수축 뻣뻣하게됩니다. 현재, 우리는 다양한 주사 접착 제제의 전단 접착 강도를 조사하는 방법을 개발하고있다. 향후 연구는 접착제가 환상의 결함을 통해 압출 저항 및 척추 운동 분절에 생체 역학적 기능을 복원 여부를 결정하는 돼지의 사후 관리와 생체 기계적인 테스트를 수행 포함됩니다.
감소 된 질량 이상의 결과, 32 ° C 이상, PNIPAAm-g-CS는 축소 인해 PNIPAAm의 LCST 동작으로 하이드로 겔 매트릭스에서 물을 추방PBS에서 7 일 동안 (도 2). 반대로, 알긴산 미립자의 첨가는 미립자의 25 밀리그램 / m의 농도가 더욱 더 50 ㎎ / ㎖에서 유의 적으로 증가 질량 팽윤 효과 접착제 (p <0.05)를 부여한다. PNIPAAm-g-CS는 효소 (29)의 존재하에 선택적으로 분해 가능한 것으로 도시되어 있기 때문에 본 연구에서 팽윤 하이드로 겔 습윤 질량의 변화는 환경과 환수로 인한 것 같다. 팽창 연구를 위해 개발 된 프로토콜 단계의 대부분은 적응 PNIPAAm-g-CS의 thermoreversibility 기반으로했다. 하이드로 겔 디스크는 완전히 다르게 겔은 분산되며, 미리 가온 된 PBS 용액을 첨가하기 전에 37 ℃에서 전환한다. 하이드로 겔은 다시 액체와 같은 상태로 복귀하기 전에 일주일 동안 팽창 한 후, PBS 솔루션은 신속하고 신중하게 유리 병에서 제거해야합니다. 이 문서에 설명 된 붓기 프로토콜을 완벽하게 시뮬레이션하지 않음을 유의해야한다기본 IVD의 생체 내 환경입니다. 생체 내에서 지지체의 팽창 특성은 주변 조직 (41)과 겔의 열화 거동의 삼투압에 의존 할 것이다. 그러나, 일반적으로, 알지네이트 미립자 혼입으로 증가 붓기 용량은 생리적 온도에서 공간 충전을 유지하기 위해 주사 하이드로 겔 도움이 될 것으로, 유리한 간주됩니다. 예컨대 팽윤 율 및 물 함량과 같은 특성을 추가 건조 질량을 측정하여 계산 될 수있다. 미래 팽창 연구는 삼투압을 적용하고 IVD의 생체 내 환경을 모방하는 폴리에틸렌 글리콜 (MW = 20,000g / mol)의 욕조에 대한 하이드로 겔 디스크 침지 포함한다.
이외에도 기계적 팽창 특성에서, 접착제는 적절한 지지체로서 간주되기 위해서는 세포 생체 적합성을 나타내는한다. 이전 연구는 encapsula의 생존을 증명하고있다42, 43 알긴산 및 PNIPAAm 기반 자료 44, 45에서 테드 세포. 은 / 실시간 데드하고 XTT 분석 모두의 결과 (도 3 및 4) 오일 걸쳐 적절한 세포 생존을 제안 이러한 선행 연구 결과와 일치한다. 우리 연구소는 또한 긴 시간 코스 (이십일일)를 통해 생존의 예비 조사를 실시하고 비슷한 동작을 관찰했다. 일반적으로, PNIPAAm-g-CS와 미세 입자의 흑자는 피펫 전송 중에 재료 손실을 설명 할 준비를해야한다. 일단 다시, 37 ℃에서 적절한 온도 조건을 유지하여 골격 구조를 유지하는 것이 매우 중요하다. 발판 네트워크는 액체와 같은 상태, 세포 부착과 생존에 젤에서 복귀하면 손상된 될 수 있습니다. 라이브 / 죽은 분석에 관해서, 시트르산 나트륨 알지네이트 미립자의 제거 및 해체에 중요한 역할을한다. 구연산 나트륨은 calci 사이의 가교 행동을 역전UM 알긴산 및 (46)을 형성하는 슬러리를 야기한다. PBS로 추가 세척을 PNIPAAm-g-CS를 제거 또는 알긴산은 이미지의 품질을 향상시키기 위해 수행 될 수있다. XTT 분석하는 동안, 어떤 세포를 포함하지 않는 폴리머 샘플은 웰 플레이트에서 생성됩니다. 이러한 복제는 빈 기준 역할을하고 정확한 흡광도 값을 계산해야한다. 우리의 예비 생존 연구는 엄격히 HEK-293 세포를 사용을 기반으로합니다. 앞으로의 연구에서, 추간판 세포로 캡슐화 된 지방 유래 중간 엽 줄기 세포의 분화 (AD-MSC)를 증명한다. NP-같은 표현형을 향해 AD-MSC 차별화 동적 압축 47 저산소증 48, 49을 사용하여 증명되었다.
전반적으로, 제안 된 접착제는 재생 전략의 성공은 입술에 발판 능력에 따라 달라집니다 추간 디스크로로드 베어링 분야에서 조직 공학 응용 프로그램에 대한 약속을 보여줍니다모션 및로드하는 동안 전위를 인도 표준시. 이 시스템은 잠재적으로 원하는 애플리케이션 특정 세포 외 매트릭스 단백질 또는 성장 인자를 방출하도록 구성 될 수 있다는 매우 다재다능하다. 중요한 것은, 여기 기재된 방법은 thermogelling 중합체 어떠한 특성화 연구에 적용 할 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 감사 접착 인장 시험 프로토콜의 개발에 박사 제니퍼 Kadlowec의 도움을 인정하고 싶습니다.
이 책에서보고 된 연구는 관절염 및 근골격계 및 피부 질환의 국립 연구소와 보너스 번호 1R15의 AR 063920-01에서 바이오 메디컬 이미징 및 국립 보건원의 생물의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1x | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 ml |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37 °C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
References
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