Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

פיגום הנדסת רקמות בזריקות מורכב פולי (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAm-ז-CS) microparticles אלגינט המכילים הוכן. כוחו הדבק, נפיחות נכסים ב biocompatibility במבחנה מנותח במחקר זה. טכניקות האפיון שפותחו כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

Abstract

Biomaterials בזריקות מוגדרים כחומרים מושתלים כי יכול להיות מוחדרת לגוף כנוזל וכן לגבש באתרו. חומרים אלה מציעים את היתרונות הקליניים של להיות מושתל מינימאלי פולשני ובקלות להרכיב מוצקים ממלאי חלל פגמים בצורה סדירה. biomaterials בזריקות נחקר נרחב כמו פיגומים להנדסת רקמות. עם זאת, עבור התיקון של אזורים מסוימים נושאת עומס בגוף, כגון הדיסק הבין החולייתי, פיגומים צריכים להחזיק תכונות דבקות. זה יהיה למזער את הסיכון של נקע בזמן התנועה ולהבטיח מגע אינטימי עם הרקמה שמסביב, מתן שידור נאות של כוחות. כאן, אנו מתארים את הכנת ואפיון של פיגום מורכב פולי רגישים תרמית (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAM-ז-CS) ו microparticles אלגינט. קופולימר PNIPAAm-ז-CS יוצר פתרון צמיג במים ב RT, שלתוכו alginatחלקיקי דואר מושעים כדי לשפר את הידבקות. מעל טמפרטורת הפתרון הקריטית הנמוך (LCST), כ -30 מעלות צלזיוס, קופולימר יוצר ג'ל מוצק סביב microparticles. יש לנו את נהליו אפיון biomaterials תקן לקחת בחשבון את המעבר לשלב הפיך של PNIPAAm-ז-CS. תוצאות המחקר מראות כי שילוב של 50 או 75 מ"ג / מ"ל ​​חלקיקים אלגינט לתוך 5% (w / v) פתרונות PNIPAAm-ז-CS לרבע את חוזק מתיחה דבק של PNIPAAm-GCS לבד (p <0.05). השילוב של microparticles אלגינט גם מגביר באופן משמעותי קיבולת נפיחות של PNIPAAm-ז-CS (p <0.05), ובכך מסייע לשמור על ג'ל ממלא חלל בתוך פגמי רקמות. לבסוף, תוצאות של ערכת assay טוקסיקולוגיה חוץ גופית, 2,3-בשדרת (2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) ו- Live / assay הכדאיות המלח עולה כי דבק הוא תומך להישרדות ושגשוגם של כליה עוברית האנושי כמוסה (HEK) 293 גאמות מעל 5 ימים.

Introduction

Biomaterials בזריקות הם אלה שיכולים להיות מועברים בצורה נוחה הגוף כנוזל וכן לגבש באתרו. חומרים אלה יושמו בהרחבה ברפואת רגנרטיבית, שם הם משמשים כדי לספק תאים כמוסים לאתר הנגוע 1-4 ולהתנהג כמו מטריקס זמנים תלת ממדי עבור התאים 5. עבור המטופל, בביו-חומרים להזרקה הם יתרון משום הניתוחים להשתלה הם פולשנית ואת השלב המוצק יכול למלא צורה אסימטרית פגמי רקמות, ביטול צורך שתלים בגודל מותאם אישית.

Injectability יכול להיות מושג באמצעות מגוון של מנגנונים. גורמים חיצוניים, כמו pH, נחקרו כמפעיל ליצירת ג'לים לתמצת תאים ומולקולות ביו 6-8. עם זאת, ה- pH לא יכול להיות על ההדק הקל ביותר לשימוש בכל הסביבות הפיזיולוגיות. עוד alterna המסורתיתמגני אוזניים להשגת injectability משתמשות פילמור כימי באתרו או crosslinking. קבוצת פיתחה מערכת חיזור מסיסים במים מורכב persulfate אמוניום N, N, N -tetramethylethylenediamine ', N' והשתמש בו במשך מגיבים macromers מורכב פוליאתילן גליקול ו פולי (פרופילן) גליקול 9,10. זאן et al. 11 רשתות polyvinylalcohol chitosan בזריקות מפותחות crosslinked עם glutaraldehyde. במערכות כאלה, cytotoxicity של רכיבים תגובתי חייב להיחשב, במיוחד עבור יישומים הכוללים אנקפסולציה התא. כמו כן, פילמור אקסותרמית יכול לייצר טמפרטורות גבוהות מספיק כדי להתפשר הרקמה שמסביב, אשר דווחה על עצם פולימריים מכתיר 12,13.

עדיין מערכות פולימר הניתן להזרקה אחרות פותחו כי התערוכה שינוי מן הנוזל למצב מוצק עם טמפרטורה כמו ההדק. המכונה מערכות thermogelling, אלה הם aqueoלנו פתרונות פולימר שאינו דורשים גירוי כימי, מונומרים, או crosslinkers להשיג היווצרות באתרו 14. במקום זאת, המעבר לשלב בדרך כלל מתרחש ליד טמפרטורה פיזיולוגית גורם להיווצרות של רשת תלת ממדים crosslinked פיזית. Poloxamers כגון Pluronic F127 הם בין פולימרים למד נרחב ביותר עבור thermogelling אנקפסולציה 15-17 ותא משלוח סמים 18,19. עם זאת, מקובל גם כי ג'לי אלה היעדר יציבות בתנאים פיסיולוגיים. מחקרים הוכיחו יציבות מוגברת באמצעות מרחיבי שרשרת 20 או crosslinkers כימי 21,22. עם זאת, השימוש ריאגנטים אלה עלולים להגביל את הפוטנציאל של החומרים אנקפסולציה תא.

Midi (N-isopropylacrylamide) הוא פולימר סינתטי thermogelling כי זכה לתשומת לב משמעותית משלוח הנדסת רקמות סמים 14. תמיסות מימיות של פולי (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) להפגין טמפרטורת פתרון קריטית נמוך (LCST), בדרך כלל מתרחש כ -32 - 34 ° C 23,24. מתחת LCST, מים נוזלים שרשראות PNIPAAm. מעל טמפרטורת המעבר, הפולימר הופך הידרופובי, וכתוצאה מכך הפרדת פאזות דרמטית 25-27 היווצרות של ג'ל מוצק ללא שימוש מונומרים או crosslinkers רעילים. עם זאת, homopolymers PNIPAAm להפגין תכונות עניות אלסטי והחזק מעט מים בטמפרטורה פיזיולוגית בשל הידרופוביות 28. בעבודה זו, אנו בוחרים לשלב כונדרואיטין סולפט קוולנטית לרשת PNIPAAm, אשר מציעה את הפוטנציאל של פריקות האנזימטית 29, פעילות אנטי דלקתית 30,31, ו מים מוגברים מזין קליטה 32. קופולימרים PNIPAAm עם CS הוכנו במעבדה שלנו על ידי polymerizing מונומר NIPAAm בנוכחות CS-פונקציונלי methacrylate לגבש קופולימר מורכב (PNIPAAm-ז-CS). Because של צפיפות crosslinking הנמוכה של קופולימר, PNIPAAm-ז-CS יוצר פתרון צמיג במים ב RT ו ג'ל אלסטי בטמפרטורה פיזיולוגית בשל LCST 29. הפתרונות פולימר להיות flowable שוב בקירור מתחת LCST בשל הפיכות של המעבר.

אנחנו הוכחנו כי PNIPAAm-ז-CS יש הפוטנציאל לתפקד כמו פיגום להנדסת רקמות, בגלל תכונות מכאניות כי ניתן להתאים, פריקות, ו cytocompatibility עם הכליה עוברית אנושית (HEK) 293 תאים 29. עם זאת, באזורים מסוימים הנושאת עומס, כגון הדיסק הבין חולייתי, פיגומים להנדסת רקמות צריך את היכולת ליצור ממשק משמעותי עם רקמת הדיסק שמסביב כדי למנוע את הסיכון של נקע 33. ממשק זה הוא גם הכרחי השידור הנאות של כוח על פני הממשק בין השתל והרקמה 33. בעבודה שלנו, יש לנו הושעהmicroparticles lginate בתמיסות מימיות של PNIPAAm-ז-CS ומצא כי gelation מתאימה את microparticles, המספקים הידבקות עם הרקמה הסובבת 34. במאמר זה, אנו נתאר את שלבי ההכנה של thermogelling, פולימר דבק. טכניקות סטנדרטיות לאפיון חומרים ביולוגיים, הדמית תא, מבחני כדאיות הותאמו לקחת בחשבון את הרגישות לטמפרטורה של פולימר ההפיכות של המעבר לשלב. הפולימר בזריקות המתואר במאמר זה יש פוטנציאל רחב עבור יישומי הנדסה משלוח סמים ורקמות מחוץ לאלה המתוארים במאמר זה. יתר על כן, שיטות האפיון המתוארות כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. midi (N-isopropylacrylamide) -G-כונדרואיטין סולפט סינתזה

  1. לפני הסינתזה של הידרוג'ל bioadhesive, לטהר N-isopropylacrylamide (NIPAAm) מונומר כונדרואיטין סולפט methacrylate (CS).
    1. תשקול לפחות 10 גרם של NIPAAm ו לפזר את מונומר ב 400 מיליליטר של הקסאן n ב 60 ° C. מערבבים את מיכל מעת לעת עד המסה מלאה. Recrystallize הפתרון במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    2. הסר את מונומר התגבש ממסנן מיכל ואקום את הקסאן n באמצעות משפך בוכנר. מניח את מונומר בתנור ואקום ב RT למשך 24 שעות כדי להסיר כל n-הקסאן נותר. אחסן את מונומר במקפיא -20 ° C לשימוש מאוחר יותר (ראה שלב 1.2).
    3. תשקלו לפזר 2.0 גרם של כונדרואיטין סולפט ב 8.0 מיליליטר של מים ללא יונים. בעדינות לחמם הפתרון 60 ° C.
    4. התאם את ה- pH של התמיסה עד 10 באמצעות כ 10 עד 40 μl של 50% (w / w) NaOH.
    5. הוספת 0.298 מ"ל של אנהידריד methacrylic (MA). ריפלוקס במשך 24 שעות, תוך ערבוב ב 60 ° C.
    6. יוצקים 400 מ"ל של תמיסת אצטון לתוך O צנצנת ומקררים / N במקפיא -20 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר 24 שעות חלפו, לאט לשפוך את CS methacrylated כולו (MCS) פתרון לתוך 400 מ"ל של אצטון קר, תוך ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי.
    8. הסר את MCS מן אצטון למקם את המשקע לתוך תנור ואקום. בצע פעולה זו במהירות כדי לשמור על מדינה ללא פגע ומלוכד עבור MCS. אפשר אצטון שיורית להתאדות תחת ואקום במשך שעה 24 לפחות.
  2. Co-לפזר 10 גרם של NIPAAm מטוהרים 2.209 גרם של MCS ב 232 מ"ל מים ללא יונים.
  3. טהר את הפתרון של חמצן באמצעות גז חנקן אינרטי. יש לשמור על קצב זרימת גז נמרץ, עדיין נמוך כדי למנוע את הפתרון מן המבעבע מעל במשך 15 דקות.
  4. המשך טיהור הפתרון עם גז חנקן ולהוסיף 0.976 מ"ל של tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. לאחר מכן, ליזום את התגובה פילמור על ידי ערבוב 97.6 מ"ג של persulfate אמוניום (APS).
  6. מערבבים את הפתרון עבור כ 20 שניות ובמהירות לאטום הפתרון למנוע אוויר מלהיכנס כלי. אפשר הפתרון לפלמר תחת אור הניאון למשך 24 שעות.
  7. לאחר 24 שעות, מניחים את כלי התגובה לתוך תנור 37 מעלות צלזיוס. אפשר הידרוג'ל מעבר מנוזל למצב דמוי ג'ל. להטביע את הידרוג'ל polymerized מלוח פוספט שנאגר 1X (PBS) עבור סכום כולל של 7 ימים כדי לאפשר דיפוזיה של מונומר unreacted מתוך הידרוג'ל.
  8. בעזרת זוג מספריים, לחתוך את הידרוג'ל למספר חלקים קטנים, לא יותר מ 5 ס"מ קוטר. כדי למנוע את הידרוג'ל מ מעבר ממצב דמוי ג'ל לנוזל, קוביות הפולימר בתוך הפתרון 37 ° C PBS. מעבירים את מנות לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל.
  9. להכין את דגימות lyophilization ידי לפפה צמרותהצינורות עם Kimwipes וגומיות. להקפיא את הצינורות ב -70 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 2 שעות.
  10. מניח את צינורות חרוטים על מייבש ההקפאה להסיר את כל המים מן הידרוג'ל. לפני הוצאות תפעול, מייבש ההקפאה צריך להגיע בטמפרטורה ובלחץ של כ -40 ° C ו- 0.04 mbar, בהתאמה. מינימום של 7 ימים נדרש ייבוש מלא.
  11. טוחנים את הקפאת יבשים פולימר לאבקה דקה ולאחסן במקרר 4 ° C לשימוש מאוחר יותר (ראה שלב 3.1).

2. סידן-אלגינט סינתזה Crosslinked microparticle

  1. כן 2% (w / v) פתרון אלגינט על ידי המסת 400 מ"ג ב 20 מיליליטר של מים ללא יונים. מחממים את הפתרון כ 60 ° C כדי להקל על פירוק.
  2. כן% 2 (w / v) פתרון כלוריד סידן על ידי הוספת 400 מ"ג ל 20 מ"ל מים ללא יונים.
  3. צור שמן בתערובת מים על ידי שילוב 100 מיליליטר של שמן קנולה, 1.0 מיליליטר של Tween 20, ו -20 מיליליטרשל 2% (w / v) אלגינט. חלב את התערובת במשך 10 דקות עם homogenizer ב 15,000 סל"ד. בנוסף, מערבבים עם בר ומערבבים מגנטי בסל"ד 200 או 2,000 סל"ד ליצור microparticles גדול או קטן, בהתאמה.
  4. לשאוב 2% (w / v) פתרון כלוריד סידן באמצעות מזרק עם קצה המחט 18 G. לאט להוסיף את כלוריד סידן חכם ירידה לתוך אמולסיה.
  5. לאחר 20 מ"ל של סידן כלורי מוצו, לאפשר microparticles בתוך אמולסיה כדי crosslink במשך 10 דקות.
  6. שווה להפיץ את אצווה של microparticles לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל כתרים צנטריפוגות לכוח של 1,400 XG למשך 2 דקות כדי להסיר את השכבה הראשונית של שמן קנולה.
  7. ברציפות לשטוף, מערבולת, ו צנטריפוגות microparticles עם isopropanol בסך הכל שלוש פעמים ב 1,400 גרם במשך 2 דקות כדי להסיר כל שמן קנולה שיורית. בטל supernatant isopropanol לאחר כל שלב צנטריפוגה ולשטוף עם isopropanol הטרי.
  8. לאחר אויl הוסר, לחזור על תהליך הכביסה שלוש פעמים נוספות עם מים ללא יונים כדי להסיר כל isopropanol שיורית. בטל supernatant המים ללא יונים לאחר כל שלב צנטריפוגה ולשטוף עם מים ללא יונים טריים. הסר כ 100 מ"ג של microparticles ולאחסן הרטובים בבקבוקון. Microparticles הרטוב ישמש כדי למדוד את הקוטר הממוצע של המנה על ידי מיקרוסקופ אור.
    1. באמצעות מיקרוסקופ אור, לפזר מדגם קטן של microparticles רטוב במים deionized בשקופית מיקרוסקופ. בהתאם לגודל של microparticles, להשתמש מטרת 10X או 20X, ולהתאים את הצמצם המספרי עד החלקיקים נכנסים להתמקד. ודא מיקרוסקופ הוא מכויל עבור המטרה הנכונה ולהתאים את הבהירות של מקור האור לפי הצורך. השתמש בכלי קו כדי למדוד את הקוטר הארוך יותר של 50 microparticles אלגינט האקראי לקבל גודל ממוצע עבור אצווה.
  9. הכן את microparticles לכוורו lyophilizationy עטיפתם עם Kimwipes ואבטחת אותם בגומיות. להקפיא את microparticles ב -70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  10. מניחים את microparticles על lyophilizer ולאפשר מדגם להתייבש במשך שעה 24 לפחות. טוחן את ההקפאה microparticles היבש לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי ולאחסן במקרר 4 ° C לשימוש מאוחר יותר (ראה שלב 3.3).

3. הכנה של דבקים

  1. באמצעות אבקת פולימר מיובש בהקפאה, ליצור% 5 (w / v) פתרון PNIPAAm-ז-CS ידי המסת 50 מ"ג של אבקת הידרוג'ל ב 1 מ"ל של 1x PBS.
  2. מערבבים את הפתרון בעזרת מערבולת ומקררים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. לאחר צורות פתרון הצמיגות, ליצור מרוכבים הומוגנית על ידי הוספת 25 או 50 מ"ג של microparticles אלגינט מיובש בהקפאה לפתרון הידרוג'ל המערבולת. אחסן את מרוכבים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר (ראה צעדים 4.3 ו -4.8).

4. Bioadhesive Mechבדיקות מתיחה anical

  1. לפני ביצוע בדיקות מתיחות, לחלץ מצע סחוס מתוך אוזן חזירית.
    1. הפשר אוזן חזירית 0.9% חמים (w / v) פתרון NaCl; זה יעזור כדי לשחרר את הרקמה.
    2. באמצעות אזמל, לבודד סעיף בין אזור שטוח, מלבני על ידי חיתוך אנכי כי שכבת אפידרמיס, הרקמה התת עורית, וסחוס. הימנע חיתוך הרכסים המעוקלים של האוזן החזירית.
    3. הפרד את שכבת האפידרמיס של העור מן הסחוס על ידי חיתוך במקביל דרך הרקמה התת עורית. הסחוס הוא רקמה קשה, לבנים הנמצאים מתחת לעור החזירי.
    4. בזהירות לגרד את הרקמה התת עורית מחובר הסחוס עם הצד של סכין המנתחים. הימנע חיתוך לתוך רקמת הסחוס עם להב סכין המנתחים.
    5. ודא כי רק צד אחד של הסחוס חשוף ושטוח במהלך בדיקה מתיחה. במידת הצורך, לשטח את הסחוס על ידי ניתוק עור לא אחיד על החלק התחתון.
    6. חותכים את רקמת סחוס למספר חלקים עם ממדים של 1 ס"מ x 1 ס"מ. אחסן את רקמת סחוס צינורות חרוטים מלאים 0.9% (w / v) פתרון NaCl ב -20 ° C במקפיא.
  2. כן 2.0 L של 0.9% (w / v) פתרון NaCl. טרום לחמם את תמיסת המלח ל -37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה של פתרון זה צריכה להישמר לאורך בדיקה.
  3. הפשר הסחוס הקפוא. יש להחזיק את הסחוס החזירי הדגימות הידרוג'ל במכל קלקר עם שקיות קרח.
  4. הצמד את מד כוח הזרוע של עמדה במבחן. מניחים פלטה חשמלית על גבי דוכן כוח ולהגדיר את הטמפרטורה ל 50 מעלות צלזיוס.
  5. להטביע חתיכת ס"מ 1 ס"מ x 1 של סחוס לבלוק נירוסטה עם דבק cyanoacrylate ו פינצטה. מדביק חתיכה נוספת של סחוס צילינדר Delrin ולצרף את גליל מד הכח. חשוב מאוד ששני משטחי סחוס פנים זה לזה וליצור קשר עם הידרוג'ל.
  6. מקוםבאמבט המים פרספקס על גבי הצלחת החמה והכנס את בלוק הנירוסטה עם מצע הסחוס בתוך האמבטיה.
  7. מנמיך את הזרוע של העמדה במבחן וליישר הוא מצעי סחוס אחד עם השני. הרם את היד ולהשאיר מספיק מקום להחיל את הידרוג'ל.
  8. עם טפטף תזוזה חיובית, לוותר 200 μl של הידרוג'ל bioadhesive אל היצירה התחתונה של סחוס.
  9. מנמיכים את הזרוע של עמדה בתוקף 1 מ"מ / דקה עד המגעים הידרוג'ל את פיסת סחוס העליון מפעיל כוח preload של 0.001 נ
  10. יוצקים את תמיסת מלח 37 ° C לאמבטיה עד נפח מגיע לרמה מים המיועד. בדוק את הטמפרטורה של הפתרון עם תרמי.
  11. אפשר הידרוג'ל להגדיר עבור סכום כולל של 5 דקות. לאחר ג'ל יש הקרושה, הרם את היד במהירות של 2 מ"מ / דקה. המבחן יושלם ברגע bioadhesive מנתק מן מצע הסחוס או כאשר ירידה משמעותית בכוח מתרחשת,איתות כישלון.
  12. אסוף את הנתונים שנרשמו ולהעלות את הזרוע של עמדה במבחן. הסר את גליל Delrin מן מד כוח. יוצקים את תמיסת מלח לתוך מיכל הקודם שלה לחמם ל -37 מעלות צלזיוס.
  13. חישוב מתחים על ידי הפחתת הכח המופעל על ידי פולימר המחיל הקליל של "ריק", את הקובץ מצורף Delrin ללא סחוס או דבק, העלה באותו הקצב, על ידי חלוקת שטח האג"ח.

5. לימוד נפיחות של PNIPAAm-ז-CS עם אלגינט microparticles

  1. הכן צלוחיות זכוכית נקיות לתייג אותם כראוי עם נקודת זמן, סוג המדגם, ומספר מדגם. דבקים יכול גם להיווצר, כפי שתואר לעיל. כן כולל של חמש דגימות (n = 5) לכל סוג מדגם לכל נקודת זמן.
  2. טרום לשקול כל צלוחיות הזכוכית ולהקליט ההמוני הראשוני שלהם ב RT.
  3. באמצעות מזרק, לוותר כ 0.4 מיליליטר של מדגם הדבק המוכן לתוך כל אחד מחמשת הבקבוקונים.חזור על שלב זה עבור כל סוג מדגם על פני כל נקודות הזמן שנבדקו.
  4. לשקול ולהקליט את המסה של כל בקבוקון עם סוג המדגם הדבק ב RT.
  5. טרום לחמם באינקובטור מסלולית 1 ליטר של פתרון 1x PBS ל -37 מעלות צלזיוס.
  6. לארגן את כל הצלוחיות על מדף והכנס את מתל לתוך החממה. אפשר דבקים המעבר מנוזל כדי ג'ל למשך כ 5 עד 10 דקות.
  7. להוסיף 5.0 מ"ל של 1x PBS בקבוקון אחד. הקפד להוסיף את הפתרון PBS בזהירות בצד של הבקבוקון כדי למנוע את הדיסק הידרוג'ל לפרוץ בנפרד.
  8. כיסוי או בקבוקון אחד כדי למנוע אידוי של פתרון PBS ולשמור על הטמפרטורה הפנימית של החממה ב 37 מעלות צלזיוס. כל ערכה של תקליטורי הידרוג'ל יצטרכו להישאר תחת המים ב PBS למשך פרק זמן מוגדר.
  9. לאחר נקודת זמן 7 יום הושג, uncap הסט של צלוחיות להסיר את הפתרון PBS מכל בקבוקון. לשקול כל בקבוקון עם המדגם הדבק שוב ב RT.
<p class = "jove_title"> 6. כדאיות התא איכותי באמצעות Assay Live / Dead

  1. לפני ביצוע assay Live / Dead עם PNIPAAm-ז-CS, לגדול כליה עוברית אנושית 293 תאים (HEK-293) עד 80% מפגש.
    1. Quick-להפשיר את ההשעיה תא קפוא HEK-293 על ידי הנחת cryovial באמבט מים 37 ° C, ואז צנטריפוגות התאים ב 400 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. כדי להפוך את מדיום גידול תא המעבר הראשון, לשלב ב גלוקוז גבוהה (4.5 גר '/ ל') Dulbecco של Modified הבינוני של הנשר (DMEM) עם סרום שור עובר חום מומת (FBS) לריכוז סופי של 20% ופתרון 100x סטרפטומיצין פניצילין ( עט סטרפטוקוקוס) לריכוז סופי של 100 IU / פניצילין מ"ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל. עבור כל הקטעים האחרים, לעבור DMEM עם 10% FBS ו-סטרפטוקוקוס עט 1x.
    3. Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום הגידול ולהעביר את ההשעיה לתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. שווה דistribute התאים על ידי הטיית מול צלחת בעדינות לגבות ומשמאל לימין מספר פעמים לכל כיוון.
    4. תרבות תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. במידת הצורך, לשנות את המדיום פעם ביומיים.
    5. כאשר התאים מגיעים 80% confluency, לשכפל את התרבות לתוך מנות מרובות. סר הבינוני מהצלחת.
    6. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.5% לצלחת. אפשר הצלחות כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בדוק אם התאים לנתק מפני השטח על ידי מתערבל את הצלחת בעדינות.
    7. עבור פיצול התרבות 1:10, להוסיף 9 מ"ל של מדיום הגידול רגיל (DMEM עם 10% FBS) אל התאים trypsinized ומערבבים בעדינות על ידי הטיית המנה.
    8. לוותר על 1 מ"ל של השעיה התא מדולל לתוך כל מנה חדשה ולהוסיף 9 מ"ל של מדיום הגידול. לערבב בעדינות על ידי הטיית המנה.
    9. תרבות תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. במידת הצורך, לשנות את המדיום פעםy יומי עד תאים מגיע 80% מפגש.
  2. הסר את התקשורת בין שני כלי התרבות גדלו עד 80% מפגש.
  3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.5% על כל צלחת. אפשר הצלחות כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בדוק אם התאים לנתק מפני השטח על ידי מתערבל את הצלחת בעדינות.
  4. שוטפים את התאים HEK-293 על צלחת עם 3 מ"ל של מדיום הגידול פעמיים מוסיפים שתי השעיות אל צינור חרוטי 15 מ"ל אותו.
  5. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל במשך 10 דקות ב 400 XG ב 4 ° C..
  6. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של המדיום על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  7. פיפטה 10 μl של השעיה התא לתוך hemocytometer ולבצע ספירת תאים כדי לקבוע את צפיפות התאים. הגבר את עוצמת הקול של ההשעיה בינונית אם את ריכוז התא הראשוני הוא גבוה מדי, ומנגד להחליש את עוצמת הקול אם הריכוז נמוך מדי, על מנת לשמור על concent יעדמנה של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. צנטריפוגה התאים HEK-293 ב 400 XG ו resuspend התא גלולה בהיקף מתוקן של התקשורת בהתאם.
  8. בעדינות מערבולת השעית התא ולהפיץ תמהיל התא שווה לארבעה צינורות חרוטים 15 מיליליטר נפרדים על תנאי הבדיקה הבאות: בשכבת בקרה חיובית, שליטה נהרגת שלילית PNIPAAm-ז-CS באמצעות 70% (v / v) מתנול, HEK-293 תאים גלומים PNIPAAm-ז-CS, ו HEK-293 תאים גלומים PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט.
  9. צור monolayers בקרה חיובית על ידי pipetting מספר 300 כרכים μl של תמהיל התא לתוך צלחת 24 גם לייצר 4-6 דגימות לשכפל.
  10. הסר את המדיה מן הצינורות חרוטי הנוגעים לשליטה נהרג, PNIPAAm-ז-CS, ו PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט.
    1. צנטריפוגה צינורות חרוטים במשך 5 דקות ב 400 XG ולהסיר את supernatant.
    2. לשמור על אותו ריכוז התא על ידי resuspending גאמות ב הנפח הזהה של PNIPAAm-ז-CS כמו תקשורת הסיר. פיפטה לערבב תא הפולימר למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגיות עד הומוגניות.
      1. אם זריעה עם microparticles אלגינט, להעביר את השעית PNIPAAm-ז-CS התאים (שהושגה כמתואר עבור 6.10.2) לתוך צלחת 35 מ"מ תרבות ולהציג את החלקיקים לתערובת. פיפטה לערבב התא למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגיות עד הומוגניות.
    3. בעזרת פיפטה סרולוגיות, לוותר מספר 300 μl של תמהיל התא הפולימר לתוך כל הבארות לבקרה נהרג, PNIPAAm-ז-CS, ו PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט כדי ליצור 4 - 6 דגימות לשכפל.
  11. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות ולאפשר PNIPAAm-ז-CS המעבר מן נוזל ג'ל (הפולימר יוצר דיסק אטום, לבן).
  12. מקם בשקופית חמה על מכסה המנוע לקבוע את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. השתמש בשקופית חמה לשמור צלחת היטבטמפרטורת פיפטה 600 μl של תקשורת מחוממת מראש לתוך כל אחד. כדי להמשיך למנוע במעבר של הפולימר למצב נוזלי, למקם מנורה עם נורת פלורסנט מעל הצלחת כדי לחמם את האוויר שמעליה.
  13. דגירת התאים למשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  14. לאחר חמישה ימים חלפו, להכין את התערובת לצבוע Live / Dead באמצעות homodimer ethidium (EthD-1) ו- AM calcein. חומרי שניהם רגישים לאור והכין ביום שימוש.
    1. הפשירו AM calcein ו EthD-1 מתוך הערכה ב RT.
    2. הוסף 5 מ"ל של PBS 1x סטרילי כדי צינור חרוטי ועוטפים אותו בנייר אלומיניום.
    3. להוסיף 6.67 μl של 2 מ"מ EthD-1 אל צינור חרוטי. וורטקס את תערובת הפתרון ביסודיות.
    4. לאחר מכן, להוסיף 2.5 μl של AM 4 מ"מ calcein אל צינור חרוטי. וורטקס את התערובת היטב.
  15. הסר את המדיה מבארות בשכבה (בקרה חיובית), PNIPAAm-ז-CS, ושנינות PNIPAAm-ז-CSmicroparticles אלגינט h. לשטוף את כל הבארות ביסודיות, אך בעדינות, עם PBS להסיר את PBS.
  16. אפשר דיסקים הידרוג'ל המכיל microparticles אלגינט להנזלת ב RT ומוסיפים 2 מ"ל של נתרן ציטרט 50 מ"מ לכל הבארות.
  17. הסר את המדיה מבאר תא ההרוג (שליטה שלילית). אפשר דיסקים הידרוג'ל להנזלת ב RT ולהוסיף 300 μl של 70% (v / v) מתנול היטב כל אחד.
  18. דגירה הצליחה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  19. הסר את נתרן ציטרט ופתרונות מתנול מבאר פיפטה כל אחד ההשעיות הידרוג'ל לתוך צינורות microcentrifuge פרט. בצנטריפוגה צינורות ב 2000 XG במשך 10 דקות כדי להפריד את התאים מן ההשעיה הידרוג'ל.
  20. מוציאים בזהירות את ההשעיה על ידי pipetting הפתרון מהצינור חרוטי ולהשאיר מאחורי תא גלולה. Resuspend גלולה ב 300 μl של PBS ולהעביר את הצלחת היטב המקורית.
  21. הוספת 300 μl של tהוא חי / תערובת צבע מלח לכל הבארות. לעטוף את הצלחת היטב בנייר אלומיניום דגירה במשך 45 דקות על כיסא נדנדה ב RT.
  22. תמונה כל הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מטרת 10X. תאי חיים ותאים נהרגו יציג פלואורסצנטי ירוק ואדום, בהתאמה.

7. כדאי תא כמוני שימוש Assay XTT

  1. לגדל תאי HEK-293 עד 80% מפגש. הסר את תקשורת הצמיחה משתי מנות תרבות.
  2. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.5% על כל צלחת. אפשר הצלחות כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בדוק אם התאים לנתק מפני השטח על ידי מתערבל את הצלחת בעדינות.
  3. שוטפים את התאים HEK-293 על צלחת עם 3 מ"ל של התקשורת פעמיים מוסיפים שתי השעיות אל צינור חרוטי 15 מ"ל אותו.
  4. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל במשך 10 דקות ב 400 XG ב 4 ° C..
  5. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של התקשורתעל ידי pipetting למעלה ולמטה.
  6. פיפטה 10 μl של השעיה התא לתוך hemocytometer ולבצע ספירת תאים כדי לקבוע את צפיפות התאים. כפי שתואר קודם לכן, לשמור על ריכוז היעד של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. צנטריפוגה התאים HEK-293 ב 400 XG ו resuspend התא גלולה בהיקף מתוקן של התקשורת בהתאם.
  7. בעדינות מערבולת השעית התא ולהפיץ תמהיל התא שווה לארבעה צינורות חרוטים 15 מיליליטר נפרדים על תנאי הבדיקה הבאות: בשכבת בקרה חיובית, שליטה נהרגת שלילית PNIPAAm-ז-CS באמצעות 70% (v / v) מתנול, HEK-293 תאים גלומים PNIPAAm-ז-CS, ו HEK-293 תאים גלומים PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט.
  8. צור monolayers בקרה חיובית על ידי pipetting 300 μl של תמהיל התא לתוך צלחת 24 גם כדי ליצור 4 - 6 דגימות לשכפל.
  9. הסר את המדיה מן צינורות חרוטים הנוגעים לשליטה נהרגת, PNIPAAm-ז-CS, ו PNIPAAm-G-CS עם microparticles אלגינט.
    1. צנטריפוגה צינורות חרוטים במשך 5 דקות ב 400 XG ולהסיר את supernatant.
    2. לשמור על אותו ריכוז התא על ידי resuspending תאי הנפח הזהה של PNIPAAm-ז-CS כמו תקשורת הסיר. פיפטה לערבב התא למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגיות עד הומוגניות.
      1. אם זריעת עם microparticles אלגינט, להעביר את ההשעיה PNIPAAm-ז-CS תאים לתוך צלחת 35 מ"מ תרבות ולהציג את חלקיקי לתערובת. פיפטה לערבב התא למעלה ולמטה בעזרת פיפטה סרולוגיות עד הומוגניות.
    3. בעזרת פיפטה סרולוגיות, לוותר 300 μl של תמהיל התא הפולימר לתוך כל הבארות לבקרה נהרג, PNIPAAm-ז-CS, ו PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט כדי ליצור 4 - 6 דגימות לשכפל.
  10. לאחר כל דגימות המכילות תאים נוספו לצלחת 24 גם, לוותר מספר 300 כרכים μl של PNIPAAm-ז-ו CS PNIPAAm-G-CS עם microparticles אלגינט ללא תאי בארות סמוכות כדי ליצור 4 - 6 דגימות לשכפל.
  11. דגירת צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות ולאפשר PNIPAAm-ז-CS מעבר מן נוזל ג'ל (הפולימר יוצר דיסק אטום, לבן).
  12. מקם בשקופית חמה על מכסה המנוע לקבוע את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. השתמש בשקופית חמה לשמור μl טמפרטורת פיפטה 600 צלחת היפה של DMEM מחומם מראש ברור לבאר כל אחד. כדי להמשיך למנוע במעבר של הפולימר למצב נוזלי, למקם מנורה עם נורת פלורסנט מעל הצלחת כדי לחמם את האוויר שמעליה.
  13. דגירת התאים למשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  14. לאחר חמישה ימים חלפו, להכין את מגיב 2,3-בשדרת (2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) מהיצרן. מגיב XTT אור רגיש מוכן ביום שימוש.
    1. הסר את בקבוק הענבר מכילing אבקת XTT מהמקרר. באמצעות מזרק ומחט סטרילית, להזריק 5 מ"ל של DMEM ברור (לא אדום פנול) דרך מחצה גומי לבקבוק ענבר.
    2. מחמם את מגיב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות או עד שהיא נמסה.
    3. בהמשך לדלל מגיב XTT עד 20% (v / v) בצינור חרוטי 15 מ"ל כשהם עטופים ברדיד אלומיניום. Aliquot מגיב XTT עודף צינורות microcentrifuge ומניחים אותם במקפיא -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
  15. הסר את המדיה מבאר תא ההרוג (שליטה שלילית) ולהוסיף 300 μl של 70% (v / v) מתנול היטב כל אחד. דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולהסיר את מתנול מהבארות.
  16. הסר את התקשורת מן הבארות הנותרות של monolayer (בקרה חיובית), PNIPAAm-ז-CS, ו PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט. לשטוף את כל הבארות ביסודיות, אך בעדינות, עם PBS ולאחר מכן להסיר את PBS.
  17. הוספת 300 μl של 20% מגיב XTT לכל הבארות. עוטפים את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום דגירה במשך 24 שעות על כיסא נדנדה ב RT.
  18. לאחר 24 שעות, להוסיף 200 μl של נתרן ציטרט 50 מ"מימ לכל בארות דגירה על הנדנדה במשך שעה נוספת אחת.
  19. להעביר את כל השעיות פולימר צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגות XG ב 2000 במשך 10 דקות ב RT.
  20. העבר 200 μl של supernatant מצינור כל microcentrifuge לצלחת 96-היטב. באמצעות קורא צלחת microtiter, לקבל קריאות ספיגה ספציפית ב -450 קריאות ספיגות ננומטר הלא ספציפיות ב 690 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מורכבים תרמית תגובה שיתוף פולימר היה מסונתז בהצלחה ומאופיינת כוח bioadhesive שלה, נפיחות נכסים, ובשנת cytocompatibility במבחנה. בחרנו לחקור אלגינט בשל המאפיינים mucoadhesive והמבוססים שלה. microparticles אלגינט, עם קוטר ממוצע של 59.7 ± 14.9 מיקרומטר, היו מעורבב עם 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS בריכוזים של 25, 50, ו -75 מ"ג / מ"ל. ריכוזים אלו התבססו על מחצית, שווה, וכמות כפולה של משקל יבש המקבילה של PNIPAAm-ז-CS בתמיסה מימית. ריכוזי microparticle מעל 75 מ"ג / מיליליטר הציגו צמיגות מוגזמת ולא נחקרו. כוחו דבק מתיחה מקסימלית של 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS עם ריכוזים שונים של microparticles אלגינט הושוו הידרוג'ל לבד. תוספת של 50 או 75 מ"ג / מ"ל ​​של microparticles אלגינט המרחפים 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS הביא inc פי ארבעהrease ב חוזק מתיחה (p <0.05), כפי שמוצג באיור 1. ריכוז microparticle של 25 מ"ג / מ"ל לא הראו עלייה משמעותית חוזק מתיחה לעומת 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS (p> 0.05). לא חל שינוי משמעותי חוזק מתיחה של 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS כאשר ריכוז של microparticles אלגינט הוגדל מ 50 ל- 75 מ"ג / מ"ל ​​(p> 0.05).

המאפיינים הנפיחות של הידרוג'ל bioadhesive התאפיינו טבילת ניסוחים שונים ב PBS על 37 מעלות צלזיוס. ריכוזים microparticle אלגינט של 25 ו -50 מ"ג / מ"ל ​​נבדקו לזהות את כל ההבדלים נפיחות התנהגות. microparticles אלגינט נמדד באמצעות מיקרוסקופ אור היה קוטר ממוצע של 25.0 ± 14.4 מיקרומטר. לאחר 7 ימים, המסה הרטובה התחלתי וסופי של הדיסקים הידרוג'ל הוקלטו שינוי במסת חושב עבור דגימות מרובות לכל formulatio הדבקn (n = 5). איור 2 מראה הבדל דרסטי את השינוי במסה בין כל הניסוחים. דבקים המכילים הן 25 ו -50 מ"ג / מ"ל ​​של microparticles אלגינט הפגינו שינויים חיוביים המונית, תוך 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS ירד במסה. כל הדגימות נמצאו להיות שונה באופן מהותי אחד מהשני (p <0.05) עם הדבק המכיל 50 מ"ג / מיליליטר של microparticles אלגינט מראה את השפעת הנפיחות הגדולה.

התאמה ביולוגית של דבק המוצע נחקר הן מבחינה איכותית וכמותית דרך השימוש assay cytotoxicity Live / המלח XTT. תאים HEK-293 היו ארוזים ב 5% הן (w / v) PNIPAAm-ז-CS ו -5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS המכיל 50 מ"ג / מ"ל ​​של microparticles אלגינט עם קוטר ממוצע של 59.7 ± 14.9 מיקרומטר . בשכבה של תאים ותאי הגלום PNIPAAm-ז-CS נהרג עם 70 מתנול% נחשבו חיוביים נגהtive שולטת, בהתאמה. פורמולציות זורעים עם תאים התאפיינו לאחר 5 ימים של צמיחה בתוך חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. כל בדיקה הצביעה כדאיויות תא טובות לשני PNIPAAm-ז-ו CS PNIPAAm-ז-CS עם microparticles. תמונות מתוך איור 3 להמחיש תאי חיים הקורנים ירוק בשני ניסוחים הדבקים (לוחות A ו- B) ואת monolayer התא, אשר מהוות את הביקורת החיובית (לוח ג). תאים נהרגים (לוח ד ') לזרוח בצבע אדום ולהראות מוות של תאים. תוצאות בדיקות cytotoxicity XTT אשרו את התוצאות של assay Live / Dead. הכדאיות התא היחסי של דבק המכיל 50 מ"ג / מ"ל של microparticles ירד 1.3 לקפל לעומת PNIPAAm-ז-CS כפי שמודגם באיור 4, אבל הירידה לא היה מובהק סטטיסטית (p <0.05). שניהם PNIPAAM-ז-ו CS PNIPAAM-ז-CS עם microparticles גם הכדאיות להשוות את monolayer תאים (p> 0.05). תאים גלומים hydrניסוחי ogel ואת monolayer התא נמצאו לעומת שונה באופן משמעותי השליטה השלילית (p <0.05). ככלל, תוצאות אלו מצביעות על כך הדבק המכיל microparticles לא מייצג רק גדל כוח דבק, אבל biocompatibility הטוב גם כן.

איור 1
איור 1. השפעות על חוזק מתיחה לאחר שילוב ריכוזים שונים של אלגינט microparticles אל 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS. חוזק מתיחה של PNIPAAm-ז-CS ארבעה בתוספת 50 או 75 מ"ג / מ"ל ​​של microparticles אלגינט (p <0.5). ברי שגיאה מייצגים 95% מחושבים (n = 5). Microparticles אלגינט היה בגודל ממוצע של 59.7 ± 14.9 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. a>

איור 2
איור 2. השפעת הריכוזים השונים של אלגינט microparticles על קיבולת הנפיחות של 5% (w / v) PNIPAAm-ז-CS. לאחר טבילת 7 ימים ב -37 ° C PBS, PNIPAAm-ז-CS ירד במסה רטובה עקב המאפיינים הידרופובי של PNIPAAm מעל LCST. PNIPAAm-ז-CS עם 25 או 50 מ"ג / מ"ל ​​של microparticles אלגינט הציג נפיחות יכולת. הגדלת הריכוז של microparticles גדל באופן משמעותי (p <0.05) השינוי המסה של הידרוג'ל מעל 7 ימים, המיוחס ספיגת מים. ברי שגיאה מייצגים 95% מחושבים. Microparticles אלגינט היה בגודל ממוצע של 25.0 ± 14.4 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

gether.within-page = "1"> איור 3
איור 3. נציג חי / תמונות הקרינה המלח של מתורבתות HEK-293 תאים על פני תקופה של 5 ימים. תאים היו ארוזים ב (א) PNIPAAm-ז-CS ו- (ב) PNIPAAm-ז-CS עם 50 מ"ג / מ"ל של אלגינט microparticles. תאים גם גדלו בשכבה (ג) ו- (ד) נהרג עם מתנול PNIPAAm-ז-CS לייצג שליטה חיובית ושלילית, בהתאמה. הניסוי הכדאי Live / Dead חזר על עצמו שלוש פעמים עם שלושה משכפל לכל ניסוי. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. Microparticles אלגינט היה בגודל ממוצע של 59.7 ± 14.9 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ftp_upload / 53,704 / 53704fig4.jpg "/>
איור 4. הכדאיות לטווח קצר של תאים HEK-293 ב PNIPAAm-ז-CS עם אלגינט microparticles. הישרדות של תאי HEK-293 כמוסות בתוך PNIPAAm-ז-CS עם ובלי microparticles אלגינט הוערכה ולעומת באמצעות XTT לאחר 5 ימים. Monolayer תא ותאי הגלום PNIPAAm-ז-CS נהרג עם 70% מתנול שימשו שולטת חיוביות ושליליות, בהתאמה. שניהם PNIPAAm-ז-ו CS PNIPAAm-ז-CS עם microparticles אלגינט לא הראו ירידה משמעותית (p <0.05) כדאיות התא לעומת monolayer התא, עדיין הראו ירידה משמעותית (p <0.05) כדאיות התא לעומת נהרג תאים. התוספת של microparticles אלגינט אינו משמעותי לפגוע כדאיות התא של PNIPAAm-ז-CS (p> 0.05). ברי שגיאה מייצגים 95% מחושבים (n = 3, שש משכפל לכל ניסוי). microparticles אלגינט היה בגודל ממוצע של 59.7 ± 14.9 מיקרומטר.נ"צ = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים ב סינתזה של מרוכבים הידרוג'ל-microparticle והערכת כוח דבק בו, נפיחות היכולת, התאמה ביולוגית הסלולר. פילמור רדיקלים החופשי של PNIPAAm-ז-CS דורש methacrylation מוצלח של כונדרואיטין סולפט, פירוק מוחלט של רכיבי מונומר, ותנאי תגובה חסר חמצן. יחס של מונומר NIPAAm כדי כונדרואיטין סולפט methacrylated בתערובת התגובה נבחר משום שהוא כבר הוכיח, בעבודה הקודמת שלנו, כדי ליצור קופולימרים עם תכונות מכניות דומה רקמת הדיסק הבין חולייתי יליד 29. הגדלת כמות של כונדרואיטין סולפט הידרוג יהיה להפחית את אובדן המים במהלך gelation ובכך להקטין את קשיחות דחיסה של הג'ל. מידת נבחרי methacrylation גם הודגמה לייצר הידרוג'ל עם מאפייני טיפול נוחים injectability באמצעות מחט 18 G כאשר מומסים בתמיסה מימית <sup> 29. תואר מוגבר תחלופת methacrylate של CS תגביר את צפיפות crosslink של רשת הפולימר, גרימת צמיגות פתרון גדלה מתחת LCST והפחתת ג'ל נפיחות יכולת. אחרים חקרו גישות שונות סינתזה הידרוג PNIPAAm כגון פילמור רדיקלי העברת אטום (ATRP) 35 או להפוך העברת שרשרת בנוסף הפיצול (רפסודה) 36. פלמור באמצעות ATRP הוביל להתפתחות של הידרוג צר, polydisperse עם משקל מולקולרי מכוון נקנס על ידי שינוי מונומר יוזם יחס. קבוצות פונקציונליות יכולות להיות מורכבות באופן מַסרְקִי באמצעות פילמור רפסודה, וכך משפיעות לרעה הסתבכות שרשרת פולימר הפרדת פאזות.

תערובת מים ב-שמן הומוגנית יש צורך ביצירה האחיד, microparticles אלגינט הצולב. טכניקת אמולסיה היא פשוטה לביצוע ואינה דורשת שימוש בכימיקלים מסוכנים, אולם הן micropaצורה והפצת rticle קשה לשלוט. גודל microparticle ניתן לשנות על ידי הגדלת מהירות אמולסיה והמערבבת, ובכך ליצור חלקיקים קטנים ולהיפך. במחקר המסוים הזה, גודל microparticle אלגינט נחקר כמאפיין אפשרי שעשויות להשפיע על נפיחות, מכניקה, או כדאיות הסלולר. אור פיזור עשוי לשמש גם כתחליף מדידת גודל microparticle הממוצע. מאפייני אמולסיה אחרים כגון הסוג הפעיל השטח וריכוז אלגינט ישפיעו גודל microparticle היווצרות המצרפי 37. הקטנת ריכוז אלגינט יקטין את גודל microparticle, אולם אגרגטים נוטים יותר טופס. וריאציות אופי הידרופילי ו הידרופובי של פעילי שטח תשפענה על מתח הפנים בין שלבי שמן ומים, ומכאן שינוי גודל הטיפה בתוך אמולסיה. microparticles אלגינט יכול לחילופין להיות מיוצר באמצעות מכשיר microfluidic, המאפשר particl אחידצורת דואר והפצת גודל צר 38. טכניקה זו כרוכה בפיזור שלב אלגינט בתוך שלב נפט רציף שזורם דרך ערוץ ונכנס אמבטית כלוריד סידן. ריסוס draying הוא טכניקה נוספת אשר מייצרת microparticles קטנה מאוד 39. כמו כן, חשוב לציין כי אלגינט ניתן לטעון עם חלבונים או גורמי גדילה יכול להיות צולב עם יוני divalent אחרים כגון אבץ או בריום.

בעבודה זו, אנו לאפיין מערכת דבק עם יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות. מבחן המתיחה שלנו במיוחד שואף לכמת את חוזק ההדבקה של מרוכבים כאשר במגע עם סחוס חזירי. סוג של מצע זו נבחרה לחקות הידבקות של מרוכבים הידרוג'ל אל צלחות סוף סחוס של הדיסק הבין חולייתי. מצעי רקמות אחרים, כגון עור חזירי, ניתן להשתמש כחלופה לכמת את הכח של 40 דבק, אבל את סוג הרקמהלהשתנות בהתאם ליישום המיועד. השמירה על שליטת טמפרטורה נאותה של באמבטיה המלוחה מים טרום קירור מרוכבים לפני השימוש הם קריטיים במדידת התכונות המכאניות במדויק. טמפרטורות באמבט מים מוגבהות מעל 37 מעלות צלזיוס תגרומנה הידרוג'ל להתכווץ במהירות להקשיח, בעוד מרוכבים כי נבדקים מכאניים מתחת 37 ° C יפגינו ירד חוזק מתיחה בשל חוסר הפרדת פאזות. נכון לעכשיו, אנו מפתחים שיטות לחקור את כוח דבק הגזירה של ניסוחים דבקים בזריקות שונות. עבודה עתידית תכלול ביצוע בדיקות מכאניות vivo לשעבר עם IVDs החזירי כדי לקבוע אם הדבק מתנגד שחול באמצעות פגם טבעתי ומשחזר את הפונקציונליות ביומכנית למגזר תנועת השדרה.

מעל 32 מעלות צלזיוס, PNIPAAm-ז-CS מתכווץ מגרשת מים מן מטריקס הידרוג'ל בשל התנהגות LCST של PNIPAAm, וכתוצאה מכך ירד מסה עלתקופה של 7 ימים ב PBS (איור 2). לעומת זאת, תוספת של microparticles אלגינט מקנה השפעה נפיחות דבק גדל באופן משמעותי במסת (p <0.05) בריכוז microparticle של 25 מ"ג / מ 'ועל אחת כמה וכמה בגיל 50 מ"ג / מ"ל. במחקר נפיחות זו, השינויים במסת הרטוב של הידרוג'ל צפויים המיוחס תחלופת המים עם הסביבה, מאז PNIPAAm-ז-CS הוכח להיות מתכלה סלקטיבי בנוכחות אנזימים 29. רבים מן הצעדים פרוטוקול שפותח לחקר נפיחות מותאם התבססו על thermoreversibility של PNIPAAm-ז-CS. דיסקים הידרוג'ל חייבים לעבור באופן מלא ב 37 ° C לפני הוספת הפתרון מחומם מראש PBS, אחרת הג'ל יתפזר. לאחר נפיחות במשך שבוע אחד, הפתרון PBS חייב להיות במהירות ובזהירות יוסר צלוחיות לפני הידרוג לחזור למצב דמוי נוזל. יצוין כי פרוטוקול נפיחות המתואר במאמר זה לא לגמרי לדמות אתבסביבת vivo של IVD הילידים. המאפיינים הנפיחות של הפיגום in vivo יהיו תלויים הלחץ האוסמוטי של הרקמות הסובבות 41 והתנהגות השפלה של ג'ל. עם זאת, באופן כללי, את יכולת הנפיחות המוגברת עם התאגדות microparticle אלגינט נחשבת חיובית, כפי שהוא יעזור הידרוג בזריקות להישאר מילוי חלל בטמפרטורה פיזיולוגית. מאפיינים כגון תוכן יחס ומי נפיחות ניתן לחשב עם מדידות מסה יבשות נוספות. מחקרים עתידיים נפיחות יכללו טבילת דיסקים הידרוג'ל נגד פוליאתילן גליקול (MW = 20,000 g / mol) אמבטיה, שיחול לחץ האוסמוטי לחקות את סביבת vivo של IVD.

מלבד התכונות המכאניות ונפיחות, הדבק חייב להפגין biocompatibility הסלולר כדי להיחשב פיגום מתאים. מחקרים קודמים הדגימו את ההישרדות של encapsulaתאים טד אלגינט 42,43 וחומרים מבוססי PNIPAAm 44,45. תוצאות משני המבחנים החיים / מלח XTT עולות בקנה אחד עם ממצאים הקודמים אלה, דבר המצביעים על כדאיויות תא מתאימות על פני תקופה של 5 ימים (איורים 3 ו -4). המעבדה שלנו גם בצעה חקירות מקדימות של כדאיות מעל קורס זמן רב יותר (21 ימים) וצופה התנהגות דומה. באופן כללי, עודף PNIPAAm-ז-ו CS microparticles צריך להיות מוכן לתת דין וחשבון על כל הפסד מהותי במהלך העברת פיפטה. שוב, זה מאוד קריטי לשמר אדריכלות פיגום על ידי שמירה על תנאי טמפרטורה נכונים על 37 מעלות צלזיוס. אם רשת הפיגום חוזרת מן ג'ל למצב נוזל דמוי, מצורף תא ואת הכדאיות עלולה להיות בסיכון. באשר אל assay Live / Dead, נתרן ציטרט ממלא תפקיד חשוב בסילוק ופירוק של microparticles אלגינט. ציטראט נתרן הופך את הפעולה cross-linking בין calciאממ ו אלגינט וגורם סלארי לטופס 46. שטיפות נוספות עם PBS להסיר PNIPAAm-ז-CS או אלגינט ניתן לבצע כדי לשפר את איכות התמונות. במהלך assay XTT, דגימות פולימר המכילות לא תאים נוצרות בתוך הצלחות היטב. משכפל אלו משמשים סטנדרטים ריקים כמו ונדרש לחשב ערך ספיג מדויק. המחקרים הכדאיים הראשוניים שלנו מבוססים אך ורק על שימוש בתאי HEK-293. במחקרים עתידיים, הבידול של תאי גזע mesenchymal שומן נגזר כמוסים (AD-MSC) לתאי pulposus גרעין יהיה הפגין. בידול AD-MSC כלפי פנוטיפ דמוי NP הודגם באמצעות דחיסה דינמית 47 היפוקסיה 48,49.

בסך הכל, דבק המוצע מדגים הבטחה עבור יישומים הנדסת רקמות באזורים נושאת עומס, כגון הדיסק הבין חולייתי, שבו ההצלחה של אסטרטגיית התחדשות יהיה תלוי ביכולת פיגום כדי מילist נקע בזמן תנועה וטעינה. מערכת זו היא מאוד צדדית כי זה יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי לשחרר חלבונים תאים מטריקס או גורמי גדילה ספציפיים ליישום הרצוי. חשוב לציין, השיטות שתוארו כאן ניתן להתאים לכל מחקר ואפיון עם פולימרים thermogelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות סיוע בהכרת תודה של ד"ר ג'ניפר Kadlowec בפיתוח פרוטוקול הבדיקה המתיחה הדבקה.

מחקר מדווחים בפרסום זה מומן על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים השלד והשרירים ועל מחלות עור לבין המכון הלאומי של הדמיה ביו Bioengineering של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת AR מספר פרס 1R15 063,920-01. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Bioengineering גיליון 116 הידרוג'ל bioadhesive הנדסת רקמות הנדסה ביו-רפואית פיגום thermogelling להזרקה
סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter