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Bioengineering

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Abstract

Biomateriales inyectables se definen como materiales implantables que se pueden introducir en el cuerpo como un líquido y se solidifican in situ. Tales materiales ofrecen las ventajas clínicas de ser implantado mínimamente invasiva formando y fácilmente sólidos que llenan el espacio en defectos de forma irregular. biomateriales inyectables han sido ampliamente investigado como andamios para la ingeniería de tejidos. Sin embargo, para la reparación de ciertas áreas de soporte de carga en el cuerpo, tales como el disco intervertebral, andamios deben poseer propiedades adhesivas. Esto minimizará el riesgo de dislocación durante el movimiento y asegurar un contacto íntimo con el tejido circundante, proporcionando la transmisión adecuada de las fuerzas. Aquí, se describe la preparación y caracterización de un andamio compuesto de poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) y micropartículas de alginato. El copolímero PNIPAAm-g-CS forma una solución viscosa en agua a temperatura ambiente, en el que alginatpartículas e se suspenden para mejorar la adherencia. Por encima de la temperatura de solución crítica inferior (LCST), alrededor de 30 ° C, el copolímero forma un gel sólido alrededor de las micropartículas. Hemos adaptado procedimientos biomateriales de caracterización de tener en cuenta la transición de fase reversible de PNIPAAm-g-CS. Los resultados indican que la incorporación de partículas de alginato / ml 50 o 75 mg en 5% (w / v) soluciones PNIPAAm-g-CS cuadruplicar la resistencia a la tracción adhesiva de PNIPAAm-GCS sola (p <0,05). La incorporación de micropartículas de alginato también aumenta significativamente la capacidad de hinchamiento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), lo que ayuda a mantener un gel llena espacios dentro de los defectos del tejido. Por último, los resultados de la vitro kit de ensayo en toxicología, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) 2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT) y ensayo de viabilidad Live / Dead indican que la adhesivo es capaz de soportar la supervivencia y la proliferación de encapsulado de riñón embrionario humano (HEK) 293 cells más de 5 días.

Introduction

Biomateriales inyectables son aquellos que pueden ser convenientemente presentadas en el cuerpo como un líquido y solidificar in situ. Tales materiales se han aplicado ampliamente en la medicina regenerativa, en el que se utilizan para entregar células encapsuladas para el sitio afectado 1-4 y actuar como una matriz extracelular provisional en tres dimensiones para las células 5. Para el paciente, biomateriales inyectables son ventajosas debido a que los procedimientos quirúrgicos para la implantación son mínimamente invasivos y la fase sólida puede llenar de forma irregular defectos de los tejidos, eliminando la necesidad de implantes de tamaño personalizado.

La inyectabilidad se puede lograr mediante una variedad de mecanismos. Factores externos, como pH, se han investigado como un disparador para la formación de geles que encapsulan las células y moléculas bioactivas 6-8. Sin embargo, el pH no puede ser el desencadenante más conveniente para su uso en todos los ambientes fisiológicos. Otra alterna tradicionaltivo para lograr inyectabilidad está utilizando en la polimerización química in situ o la reticulación. Un grupo desarrolló un sistema redox soluble en agua compuesto de persulfato amónico y N, N, N -tetrametiletilendiamina ', N' y lo utilizó para la reacción de compuestos macrómeros de polietilenglicol y poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano alcohol polivinílico inyectables desarrollados reticuladas con glutaraldehído. En tales sistemas, la citotoxicidad de componentes reactivos se debe considerar, especialmente para aplicaciones que implican la encapsulación de células. Además, la polimerización exotérmica podría producir temperaturas suficientemente altas como para poner en peligro el tejido circundante, que se ha informado para el hueso polimérico cementos 12,13.

Todavía otros sistemas de polímeros inyectables se han desarrollado que exhiben un cambio del estado líquido al estado sólido con la temperatura como el gatillo. Conocido como sistemas termogelificantes, estos son aqueonos soluciones de polímero que no requieren estímulo químico, monómeros, agentes de reticulación o para lograr la formación in situ 14. Más bien, una transición de fase que ocurre generalmente cerca de la temperatura fisiológica induce la formación de una red tridimensional físicamente reticulado. Poloxámeros, tales como Pluronic F127 son algunos de los polímeros más ampliamente estudiados para la administración de fármacos termogelificante 15-17 y encapsulación celular 18,19. Sin embargo, es bien aceptado que estos geles carecen de estabilidad en condiciones fisiológicas. Los estudios han demostrado un aumento de la estabilidad usando alargadores de cadena o reticulantes químicos 20 21,22. Sin embargo, el uso de estos reactivos puede limitar el potencial de los materiales para la encapsulación de células.

El poli (N-isopropilacrilamida) es un polímero termogelificante sintético que ha recibido una atención significativa en la ingeniería de tejidos y la entrega de drogas 14. Las soluciones acuosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) presentan una temperatura de solución crítica inferior (LCST), que se produce normalmente alrededor del 32 - 34ºC 23,24. Por debajo de la LCST, agua hidrata cadenas PNIPAAm. Por encima de la temperatura de transición, el polímero se convierte en hidrófobo, lo que resulta en una separación de fases dramático 25-27 y la formación de un gel sólido sin el uso de monómeros tóxicos o agentes de reticulación. Sin embargo, homopolímeros PNIPAAm exhiben propiedades elásticas pobres y tienen poca agua a temperatura fisiológica debido a la hidrofobicidad 28. En este trabajo, hemos decidido incorporar el sulfato de condroitina covalente en la red PNIPAAm, que ofrece la posibilidad de degradabilidad enzimática 29, la actividad anti-inflamatoria 30,31, y el aumento de agua y la absorción de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm con CS se prepararon en el laboratorio mediante la polimerización de la NIPAAm monómero en presencia de CS metacrilato funcionalizado para formar copolímero injertado (PNIPAAm-g-CS). because de la densidad de reticulación baja del copolímero, PNIPAAm-g-CS forma una solución viscosa en agua a RT y un gel elástico a temperatura fisiológica debido a la LCST 29. Las soluciones de polímero se convierten en capaz de fluir de nuevo al enfriar por debajo de la LCST, debido a la reversibilidad de la transición.

Hemos demostrado que PNIPAAm-g-CS tiene el potencial de funcionar como un andamio ingeniería de tejidos, debido a las propiedades mecánicas que se pueden adaptar, degradabilidad, y citocompatibilidad con riñón embrionario humano (HEK) 293 células 29. Sin embargo, en ciertas áreas de soporte de carga, tales como el disco intervertebral, andamios de ingeniería de tejidos deben tener la capacidad de formar una interfaz sustancial con el tejido del disco circundante para eliminar el riesgo de dislocación 33. Esta interfaz también es necesario para la transmisión adecuada de la fuerza a través de la interfaz entre el implante y el tejido 33. En nuestro trabajo, hemos suspendido unamicropartículas lginate en soluciones acuosas de PNIPAAm-g-CS y encontraron que la gelificación localiza las micropartículas, que proporcionan la adherencia con el tejido circundante 34. En el presente trabajo se exponen los pasos para la preparación de la termogelificante, polímero adhesivo. Las técnicas estándar para la caracterización de biomateriales, imágenes de células, y ensayos de viabilidad se adaptaron a tener en cuenta la sensibilidad a la temperatura del polímero y la reversibilidad de la transición de fase. El polímero inyectable se describe en este documento tiene gran potencial para aplicaciones de administración de fármacos y la ingeniería tisular fuera de los descritos en este documento. Por otra parte, los métodos de caracterización descritos aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

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Protocol

1. El poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntesis

  1. Antes de la síntesis del hidrogel bioadhesiva, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) monómero y el sulfato de condroitina metacrilato (CS).
    1. Pesar al menos 10 g de NIPAAm y disolver el monómero en 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Se agita el recipiente periódicamente hasta disolución completa. Se recristaliza la solución en un congelador C -20 ° durante 24 hr.
    2. Retire el monómero se cristalizó en el filtro de recipiente y de vacío el n-hexano usando un embudo Buchner. Coloque el monómero en un horno de vacío a TA durante 24 horas para eliminar cualquier n-hexano restante. Almacenar el monómero en un congelador -20 ° C para su uso posterior (véase el paso 1.2).
    3. Pesar y disolver 2,0 g de sulfato de condroitina en 8,0 ml de agua desionizada. Calentar suavemente la solución a 60 ° C.
    4. Ajustar el pH de la solución a 10 utilizando aproximadamente 10 a 40 l de 50% (w / w) NaOH.
    5. Añadir 0,298 ml de anhídrido metacrílico (MA). Reflujo durante 24 horas, mientras se agita a 60 ° C.
    6. Verter 400 ml de solución de acetona en un frasco y el frío O / N en un congelador a -20 °.
    7. Después de haber transcurrido 24 horas, se vierte lentamente toda la solución metacrilado CS (MCS) en 400 ml de acetona fría, mientras se agita con una barra de agitación magnética.
    8. Retire el MCS de la acetona y el precipitado colocar en un horno de vacío. Realice este paso rápidamente para mantener un estado intacto y cohesivo para MCS. Deje que la acetona residual se evapore al vacío durante al menos 24 horas.
  2. Co-disolver 10 g de NIPAAm purificada y 2.209 g de MCS en 232 ml de agua desionizada.
  3. Purgar la solución de oxígeno mediante el uso de gas inerte de nitrógeno. Mantener un caudal de gas vigorosa, pero baja para evitar que la solución rebosante durante 15 minutos.
  4. Continuar purgar la solución con gas de nitrógeno y añadir 0,976 ml de tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. A continuación, iniciar la reacción de polimerización mediante la mezcla de 97,6 mg de persulfato de amonio (APS).
  6. Mezclar la solución durante aproximadamente 20 segundos y sellar rápidamente la solución para evitar cualquier entrada de aire en el recipiente. Deje que la solución se polimeriza con luz fluorescente durante 24 horas.
  7. Después de 24 horas, colocar el recipiente de reacción en un horno de 37 ° C. Permitir que el hidrogel a la transición de líquido a un estado similar a un gel. Sumergir el hidrogel polimerizado en 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS) para un total de 7 días para permitir la difusión de monómero sin reaccionar de la hidrogel.
  8. Con un par de tijeras, corte el hidrogel en varios trozos pequeños, no mayores de 5 cm de diámetro. Para evitar que el hidrogel de la transición de un estado de tipo gel en un líquido, dado el polímero dentro de la solución 37 ° C PBS. La transferencia de las porciones en tubos cónicos de 50 ml.
  9. Preparar las muestras para la liofilización, envolviendo la parte superior delos tubos con Kimwipes y bandas de goma. Congelar los tubos a -70 ° C durante 1 a 2 horas.
  10. Colocar los tubos cónicos en el secador por congelación para eliminar toda el agua del hidrogel. Antes de operar, el secador por congelación debe alcanzar una temperatura y presión de aproximadamente -40 ° C y 0.04 mbar, respectivamente. Se requiere un mínimo de 7 días para el secado completo.
  11. Triturar la congelación de polímero seco en un polvo fino y guardar en un refrigerador 4 ° C para su uso posterior (véase el paso 3.1).

2. El calcio-alginato reticulado de micropartículas Síntesis

  1. Preparar un 2% (w / v) solución de alginato disolviendo 400 mg en 20 ml de agua desionizada. Calentar la solución a aproximadamente 60 ° C para facilitar la disolución.
  2. Preparar un 2% (w / v) de solución de cloruro de calcio mediante la adición de 400 mg a 20 ml de agua desionizada.
  3. Crear un aceite en la mezcla de agua combinando 100 ml de aceite de canola, 1,0 ml de Tween 20, y 20 mlde 2% (w / v) de alginato. Emulsionar la mezcla durante 10 min con un homogeneizador a 15.000 rpm. Además, la mezcla con una barra de agitación magnética a 200 rpm o 2000 rpm para crear micropartículas grandes o pequeñas, respectivamente.
  4. Aspirar el 2% (w / v) de solución de cloruro de calcio con una jeringa con una punta de la aguja 18 G. Agregue lentamente el cloruro de calcio, gota a gota en la emulsión.
  5. Una vez que se han agotado los 20 ml de cloruro de calcio, permitir que las micropartículas dentro de la emulsión para reticular para 10 min.
  6. Distribuir uniformemente el lote de micropartículas en cubiertas de tubos de 50 ml cónicos y centrifugar a una fuerza de 1.400 xg durante 2 min para eliminar la capa inicial de aceite de canola.
  7. Consecutivamente de lavado, vórtice, y centrifugar las micropartículas con isopropanol un total de tres veces a 1.400 g durante 2 minutos para eliminar cualquier aceite de canola residual. Descartar el sobrenadante isopropanol después de cada etapa de centrifugación y se lava con isopropanol fresco.
  8. Una vez que la oil se ha eliminado, repetir el procedimiento de lavado tres veces más con agua desionizada para eliminar cualquier isopropanol residual. Descartar el sobrenadante agua desionizada después de cada etapa de centrifugación y se lava con agua desionizada fresca. Retire aproximadamente 100 mg de micropartículas húmedas y guardar en un frasco. Las micropartículas húmedas se utilizan para medir el diámetro medio del lote por microscopía de luz.
    1. El uso de microscopía de luz, dispersar una pequeña muestra de micropartículas mojadas en agua desionizada en un portaobjetos de microscopio. Dependiendo del tamaño de las micropartículas, utilice un objetivo de 10X o 20X, y ajustar la apertura numérica hasta que las partículas entran en foco. Asegúrese de que el microscopio está calibrado para el objetivo de corregir y ajustar el brillo de la fuente de luz, según sea necesario. Utilice una herramienta de línea para medir el diámetro más largo de 50 micropartículas de alginato al azar y obtener un tamaño promedio para el lote.
  9. Preparar las micropartículas para la liofilización by envolviéndolos con Kimwipes y asegurándolos con bandas de goma. Congelar las micropartículas a -70 ° C durante 1 hora.
  10. Coloque las micropartículas en el liofilizador y dejar que la muestra se seque durante al menos 24 horas. Triturar la congelación de micropartículas secas en un polvo fino utilizando un mortero y guardar en un refrigerador 4 ° C para su uso posterior (véase el paso 3.3).

3. Preparación de los adhesivos

  1. Utilizando el polvo de polímero liofilizado, crear un 5% (w / v) de solución PNIPAAm-g-CS mediante la disolución de 50 mg de polvo de hidrogel en 1 ml de 1x PBS.
  2. Mezclar la solución con un vórtice y enfriar en un refrigerador a 4 ° C durante 24 horas.
  3. Una vez que las formas de soluciones viscosas, crear una composición homogénea mediante la adición de 25 o 50 mg de liofilizados micropartículas de alginato a la solución de hidrogel y vórtice. Almacenar el material compuesto en un refrigerador a 4 ° C para su uso posterior (consulte los pasos 4.3 y 4.8).

4. bioadhesiva MechEnsayo de tracción mecánicos

  1. Antes de realizar ensayos de tracción, extraer sustrato cartílago de una oreja de cerdo.
    1. Descongelar un oído porcino en un ambiente cálido 0,9% (w / v) de solución de NaCl; esto ayudará a aflojar el tejido.
    2. El uso de un escalpelo, aislar y la sección fuera de un área plana, rectangular cortando verticalmente aunque la capa epidérmica, tejido subcutáneo, y el cartílago. Evitar cortar los cantos curvados de la oreja de cerdo.
    3. Se separa la capa epidérmica de la piel del cartílago mediante la reducción de paralelo a través del tejido subcutáneo. El cartílago es un tejido duro, blanco se encuentra debajo de la piel porcina.
    4. Con cuidado raspar el tejido subcutáneo que se adjunta en el cartílago con el lado del bisturí. Evitar el corte en el tejido de cartílago con la hoja de bisturí.
    5. Asegúrese de que sólo uno de los lados del cartílago está expuesto y plana durante el ensayo de tracción. Si es necesario, aplanar el cartílago cortando la piel desigual en la parte inferior.
    6. Cortar el tejido de cartílago en varias piezas con dimensiones de 1 cm x 1 cm. Almacenar el tejido de cartílago en tubos cónicos llenas de 0,9% (w / v) de solución de NaCl en un congelador a -20ºC.
  2. Preparar 2,0 L de 0,9% (w / v) solución de NaCl. Pre-calentar la solución salina a 37 ° C. tendrá que ser mantenida durante toda la prueba La temperatura de esta solución.
  3. Descongelar el cartílago congelado. Mantener tanto el cartílago porcina y las muestras de hidrogel en un recipiente de espuma de poliestireno con bolsas de hielo.
  4. Coloque el medidor de fuerza al brazo del banco de pruebas. Colocar una placa en la parte superior del soporte de la fuerza y ​​ajustar la temperatura a 50 ° C.
  5. Colocar un 1 cm x 1 cm pedazo de cartílago para el bloque de acero inoxidable con pegamento de cianoacrilato y un par de pinzas. Pegar una pieza adicional de cartílago para el cilindro de Delrin y adjuntar el cilindro al medidor de fuerza. Es muy importante que las dos superficies de cartílago se enfrentan entre sí y en contacto con el hidrogel.
  6. Lugarel baño de agua de plexiglás en la parte superior de la placa caliente e inserte el bloque de acero inoxidable con el sustrato cartílago dentro de la bañera.
  7. Bajar el brazo del banco de pruebas y alinear ambos sustratos de cartílago con otros. Levantar el brazo y deje espacio suficiente para aplicar el hidrogel.
  8. Con una pipeta de desplazamiento positivo, prescindir de 200 l de hidrogel bioadhesiva de la pieza inferior del cartílago.
  9. Bajar el brazo del soporte de la fuerza a 1 mm / min hasta que el hidrogel en contacto con la pieza superior del cartílago y ejerce una fuerza de precarga de 0.001 N.
  10. Verter la solución salina 37 ° C en el baño hasta que el volumen alcanza el nivel de agua designado. Compruebe la temperatura de la solución con un termopar.
  11. Deje que el hidrogel se asiente durante un total de 5 minutos. Una vez que el gel se ha solidificado, elevar el brazo a una velocidad de 2 mm / min. La prueba se completa una vez que el bioadhesivo se separa del sustrato de cartílago o cuando se produce una caída significativa de la fuerza,falta de señalización.
  12. Recoge los datos registrados y levante el brazo del banco de pruebas. Retire el cilindro Delrin desde el medidor de fuerza. Verter la solución salina en su recipiente anterior y volver a calentar a 37 ° C.
  13. Calcular las tensiones restando la fuerza ejercida por el polímero a partir de la fuerza de flotación de un "blanco", el archivo adjunto Delrin sin cartílago o adhesivo, levantado a la misma velocidad, y dividiendo por el área de unión.

5. Estudio Hinchazón de PNIPAAm-g-CS con alginato micropartículas

  1. Preparar viales de vidrio limpios y etiquetarlos adecuadamente con un punto de tiempo, tipo de muestra, y el número de la muestra. Los adhesivos también pueden ser creados, como se describió anteriormente. Preparar un total de cinco muestras (n = 5) para cada tipo de muestra por cada punto de tiempo.
  2. Pre-sopesar todos los viales de vidrio y registrar su masa inicial a temperatura ambiente.
  3. Usando una jeringa, prescindir de aproximadamente 0,4 ml de la muestra de adhesivo preparada en cada uno de los cinco viales.Repita este paso para cada tipo de muestra en todos los puntos temporales a prueba.
  4. Pesar y registrar la masa de cada vial con el tipo de muestra adhesiva a temperatura ambiente.
  5. Pre-calentar una incubadora orbital y 1 L de solución de 1x PBS a 37 ° C.
  6. Organizar todos los viales en un estante e insertar el bastidor en la incubadora. Permitir a los adhesivos para la transición de un líquido en un gel durante aproximadamente 5 a 10 minutos.
  7. Añadir 5,0 ml de 1x PBS a cada vial. Asegúrese de añadir cuidadosamente la solución de PBS a lo largo del lado del vial para evitar que el disco de hidrogel de romperse.
  8. Tapar cada vial para evitar la evaporación de la solución de PBS y mantener la temperatura interna de la incubadora a 37 ° C. tendrá que permanecer sumergido en PBS durante un periodo de tiempo determinado cada conjunto de discos de hidrogel.
  9. Una vez que se ha alcanzado un punto de tiempo de 7 días, destape el conjunto de viales y eliminar la solución de PBS de cada vial. Pesar cada vial con la muestra de adhesivo de nuevo a TA.
<p class = "jove_title"> 6. Cualitativa viabilidad celular usando un ensayo de Live / Dead

  1. Antes de realizar el ensayo Live / Dead con PNIPAAm-g-CS, crecer de riñón embrionario humano 293 (HEK-293) a 80% de confluencia.
    1. Quick-descongelar la suspensión de células HEK-293 congelado colocando el criovial en un baño de agua a 37 °, a continuación, centrifugar las células a 400 xg a 4 ° C durante 5 min en un tubo cónico de 15 ml.
    2. Para hacer que el medio de crecimiento celular primero paso, se combinan en alta glucosa (4,5 g / L) de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) con suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) a una concentración final de 20% y la solución 100x penicilina-estreptomicina ( pen-strep) a una concentración final de 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Para todos los otros pasajes, cambiar a DMEM con 10% de FBS y 1x pen-strep.
    3. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de crecimiento y transferir la suspensión en una placa de Petri de diámetro 100 mm. d uniformementeistribute las células inclinando suavemente la parte delantera plato hacia atrás y de izquierda a derecha varias veces cada dirección.
    4. Cultivar las células en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. Si es necesario, cambiar el medio cada dos días.
    5. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, replicar la cultura en múltiples platos. Retire el medio de la placa.
    6. Añadir 1 ml de 0,5% de tripsina a la placa. Dejar que las placas de incubar a 37ºC durante 10 min. Comprobar para ver si las células se separan de la superficie girando suavemente la placa.
    7. Para la división de la cultura 1:10, añadir 9 ml de medio de crecimiento regular (DMEM con 10% de FBS) a las células tratadas con tripsina y mezclar suavemente por la inclinación del plato.
    8. Dispensar 1 ml de la suspensión celular diluida en cada nuevo plato y añadir 9 ml de medio de crecimiento. Mezclar suavemente por la inclinación del plato.
    9. Cultivar las células en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. Si es necesario, cambiar el medio cada vezy dos días hasta que las células alcanzan el 80% de confluencia.
  2. Retire el papel de dos placas de cultivo cultivadas a 80% de confluencia.
  3. Añadir 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Dejar que las placas de incubar a 37ºC durante 10 min. Comprobar para ver si las células se separan de la superficie girando suavemente la placa.
  4. Lavar las células HEK-293 en la placa con 3 ml de medio de crecimiento dos veces y añadir tanto suspensiones al tubo cónico de 15 ml mismos.
  5. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml durante 10 min a 400 xga 4 ° C.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 3 ml de medio de la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
  7. Pipetear 10 l de la suspensión celular en un hemocitómetro y realizar un recuento de células para determinar la densidad celular. Aumentar el volumen de la suspensión de medio de si la concentración celular inicial es demasiado alta, y por el contrario disminuir el volumen si la concentración es demasiado baja, con el fin de preservar una concent objetivoración de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar las células HEK-293 a 400 xg y resuspender el sedimento celular en el volumen corregido de medios de comunicación en consecuencia.
  8. vórtice suavemente la suspensión celular y distribuir uniformemente la mezcla de células en cuatro tubos de 15 ml cónicos separados para las siguientes condiciones de ensayo: monocapa control positivo, control de matado negativa en PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas en PNIPAAm-g-CS y células HEK-293 encapsulados en PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato.
  9. Crear monocapas de control positivo pipeteando múltiple 300 volúmenes mu l de la mezcla de células en una placa de 24 pocillos para generar 4-6 muestras replicadas.
  10. Retire el papel de los tubos cónicos relacionadas con el control matado, PNIPAAm-g-CS, y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato.
    1. Centrifugar los tubos cónicos durante 5 minutos a 400 xg y eliminar el sobrenadante.
    2. Mantener la misma concentración de células resuspendiendo el cells en el mismo volumen de PNIPAAm-g-CS como los medios de comunicación eliminado. Pipetear la mezcla de células de polímero de arriba abajo con una pipeta serológica hasta que sea homogénea.
      1. Si la siembra con micropartículas de alginato, la transferencia de la suspensión de células--CS g PNIPAAm (obtenida como se describe para 6.10.2) en una placa de cultivo de 35 mm e introducir las partículas en la mezcla. Pipetear la mezcla de células arriba y abajo con una pipeta serológica hasta que sea homogénea.
    3. Usando la pipeta serológica, dispensar múltiples 300 l de la mezcla de células de polímero en cada uno de los pocillos para el control matado, PNIPAAm-g-CS, y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato para generar 4 - 6 muestras replicadas.
  11. Incubar la placa a 37 ° C durante 10 a 15 min y permitir que el PNIPAAm-g-CS para la transición de líquido a un gel (el polímero forma un disco opaco, blanco).
  12. Coloque una diapositiva más caliente en el capó y ajustar la temperatura a 37 ° C. Utilizar el calentador de portaobjetos para mantener la placa dela temperatura y la pipeta de 600 l de los medios de comunicación pre-calentado en cada pocillo. Para prevenir aún más la transición del polímero a un estado líquido, colocar una lámpara con una bombilla fluorescente por encima del plato para calentar el aire por encima de ella.
  13. Se incuban las células durante 5 días a 37 ° C con 5% de CO2.
  14. Después de que hayan transcurrido cinco días, preparar la mezcla de tinte Live / Dead utilizando homodímero de etidio (EthD-1) y calceína AM. Ambas sustancias son sensibles a la luz y se preparó en el día de uso.
    1. Descongelar el calceína AM y EthD-1 del kit a temperatura ambiente.
    2. Añadir 5 ml de PBS estéril 1x a un tubo cónico y se envuelve en papel de aluminio.
    3. Añadir 6,67 l de EthD mM-1 2 al tubo cónico. Agite la mezcla de solución de fondo.
    4. A continuación, añadir 2,5 l de calceína AM 4 mM al tubo cónico. Agite la mezcla a fondo.
  15. Retire el medio de los pocillos de la monocapa (control positivo), PNIPAAm-g-CS, y el ingenio PNIPAAm-g-CSmicropartículas h alginato. Lavar todos los pozos completamente pero con suavidad, con PBS y retire la PBS.
  16. Permitir que los discos de hidrogel que contienen micropartículas de alginato que se licúan a temperatura ambiente y añadir 2 ml de citrato de sodio 50 mM a cada uno de los pozos.
  17. Retire el papel de los pocillos de células muertas (control negativo). Permitir que los discos de hidrogel a licuan a TA y se añaden 300 l de 70% (v / v) de metanol a cada pocillo.
  18. Se incuba la placa durante 45 minutos a 37 ° C.
  19. Retire el citrato de sodio y soluciones de metanol de los pocillos y la pipeta cada una de las suspensiones de hidrogel en tubos de microcentrífuga individuales. Centrifugar los tubos a 2.000 xg durante 10 min para separar las células de la suspensión de hidrogel.
  20. Retire cuidadosamente la suspensión pipeteando la solución desde el tubo cónico y dejando atrás el sedimento celular. Resuspender el precipitado en 300 l de PBS y transferir a la placa de pozo original.
  21. Añadir 300 l de tél Live / Dead mezcla de tinte a cada uno de los pozos. Envolver la placa bien en papel de aluminio y se incuba durante 45 min en un agitador a temperatura ambiente.
  22. Imagen de todas las muestras bajo un microscopio invertido de fluorescencia con un objetivo de 10X. Las células vivas y células muertas mostrarán una fluorescencia verde y rojo, respectivamente.

7. cuantitativa viabilidad celular usando un ensayo de XTT

  1. Se cultivan las células HEK-293 a 80% de confluencia. Retire el medio de crecimiento a partir de dos placas de cultivo.
  2. Añadir 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Dejar que las placas de incubar a 37ºC durante 10 min. Comprobar para ver si las células se separan de la superficie girando suavemente la placa.
  3. Lavar las células HEK-293 en la placa con 3 ml de medio dos veces y añadir tanto suspensiones al tubo cónico de 15 ml mismos.
  4. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml durante 10 min a 400 xga 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 3 ml de mediola pipeta hacia arriba y hacia abajo.
  6. Pipetear 10 l de la suspensión celular en un hemocitómetro y realizar un recuento de células para determinar la densidad celular. Como se ha descrito anteriormente, preservar una concentración objetivo de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar las células HEK-293 a 400 xg y resuspender el sedimento celular en el volumen corregido de medios de comunicación en consecuencia.
  7. vórtice suavemente la suspensión celular y distribuir uniformemente la mezcla de células en cuatro tubos de 15 ml cónicos separados para las siguientes condiciones de ensayo: monocapa control positivo, control de matado negativa en PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas en PNIPAAm-g-CS y células HEK-293 encapsulados en PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato.
  8. Crear monocapas de control positivo pipeteando 300 l de la mezcla de células en una placa de 24 pocillos para generar 4 - 6 muestras replicadas.
  9. Retire el papel de los tubos cónicos relacionadas con el control matado, PNIPAAm-g-CS, y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato.
    1. Centrifugar los tubos cónicos durante 5 min a 400 xg y eliminar el sobrenadante.
    2. Mantener la misma concentración de células resuspendiendo las células en el mismo volumen de PNIPAAm-g-CS como los medios de comunicación eliminado. Pipetear la mezcla de células arriba y abajo con una pipeta serológica hasta que sea homogénea.
      1. Si la siembra con micropartículas de alginato, la transferencia de la suspensión de células--CS g PNIPAAm en una placa de cultivo de 35 mm e introducir las partículas en la mezcla. Pipetear la mezcla de células arriba y abajo con una pipeta serológica hasta que sea homogénea.
    3. Usando la pipeta serológica, prescindir de 300 l de la mezcla de células de polímero en cada uno de los pocillos para el control matado, PNIPAAm-g-CS, y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato para generar 4 - 6 muestras replicadas.
  10. Una vez que todas las muestras que contienen células se han añadido a la placa de 24 pocillos, prescindir de varios volúmenes de 300 l de PNIPAAm-g-CS y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato sin células en pocillos adyacentes para generar 4 - 6 muestras replicadas.
  11. Incubar la placa de 24 pocillos a 37 ° C durante 10 a 15 min y permitir que el PNIPAAm-g-CS para la transición de líquido a un gel (el polímero forma un disco opaco, blanco).
  12. Coloque una diapositiva más caliente en el capó y ajustar la temperatura a 37 ° C. Utilizar el calentador de portaobjetos para mantener así la temperatura del plato y la pipeta 600 l de DMEM clara pre-calentado en cada pocillo. Para prevenir aún más la transición del polímero a un estado líquido, colocar una lámpara con una bombilla fluorescente por encima del plato para calentar el aire por encima de ella.
  13. Se incuban las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO 2.
  14. Después de que han transcurrido cinco días, preparar el 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) 2H-tetrazolio-5-carboxanilida reactivo (XTT) del fabricante. El reactivo XTT es sensible a la luz y se preparó en el día de uso.
    1. Retire el frasco de color ámbar contieneing el polvo XTT de la nevera. El uso de una jeringa y aguja estériles, inyectar 5 ml de clara DMEM (sin rojo fenol) a través del tabique de caucho en la botella ámbar.
    2. Calentar el reactivo a 56 ° C en un baño de agua durante 10 min o hasta que se disuelva.
    3. a diluir el reactivo XTT a 20% (v / v) en un tubo cónico de 15 ml envuelto en papel de aluminio. Alícuota el exceso de reactivo XTT en tubos de microcentrífuga y colocarlos en el congelador a -20ºC para almacenamiento a largo plazo.
  15. Retire el papel de los pocillos de células muertas (control negativo) y añadir 300 l de 70% (v / v) de metanol a cada pocillo. Incubar durante 45 min a 37 ° C y separar el metanol de los pozos.
  16. Retire el papel de los pozos restantes de la monocapa (control positivo), PNIPAAm-g-CS, y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato. Lavar todos los pozos completamente pero con suavidad, con PBS y luego retirar el PBS.
  17. Añadir 300 l de la 20% reactivo XTT a cada uno de los pocillos. Envolver la placa de 24 pocillos en papel de aluminio y se incuba durante 24 horas en un agitador a temperatura ambiente.
  18. Después de 24 h, añadir 200 l de citrato de sodio 50 mM a todos los pocillos y se incuba en el eje de balancín durante una hora adicional.
  19. Transferir todos los suspensiones de polímeros a tubos de microcentrífuga y centrifugar a 2000 xg durante 10 min a TA.
  20. Transferir 200 l del sobrenadante de cada tubo de microcentrífuga a una placa de 96 pocillos. El uso de un lector de placa de microtitulación, obtener lecturas de absorbancia específicos a 450 lecturas de absorbancia nm y no específicos a 690 nm.

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Representative Results

Un co-polímero injertado térmicamente sensible se sintetizó con éxito y se caracteriza por su fuerza bioadhesiva, propiedades de hinchamiento, y en citocompatibilidad vitro. Elegimos para investigar alginato debido a sus propiedades mucoadhesivas bien establecidos. Las micropartículas de alginato, con un diámetro promedio de 59,7 ± 14,9 micras, se mezclaron con 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS a concentraciones de 25, 50, y 75 mg / ml. Estas concentraciones se basan en un medio, igual a, y dos veces el peso en seco equivalente de PNIPAAm-g-CS en solución acuosa. Las concentraciones de micropartículas por encima de 75 mg / ml exhiben viscosidad excesiva y no se investigaron. La resistencia máxima a la tracción de adhesivo 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS con concentraciones variables de las micropartículas de alginato se compararon con el hidrogel solo. La adición de 50 o 75 mg / ml de micropartículas de alginato en suspensión en 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS resultó en un inc cuatro vecesRease en resistencia a la tracción (p <0,05), como se muestra en la Figura 1. Una concentración de micropartículas de 25 mg / ml no mostró un aumento significativo de resistencia a la tracción en comparación con el 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). No hubo ningún cambio significativo en la resistencia a la tracción de 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS cuando la concentración de micropartículas de alginato se aumentó de 50 a 75 mg / ml (p> 0,05).

Las propiedades de hinchamiento del hidrogel bioadhesiva se caracterizaron mediante la inmersión de diversas formulaciones en PBS a 37 ° C. concentraciones de micropartículas de alginato de 25 y 50 mg / ml se ensayaron para identificar cualquier diferencia en comportamiento de hinchamiento. Las micropartículas de alginato fueron medidos usando microscopía de luz y tenía un diámetro medio de 25,0 ± 14,4 m. Después de 7 días, la masa húmeda inicial y final de los discos de hidrogel se registraron y un cambio en la masa se calculó para múltiples muestras por formulatio adhesivan (n = 5). La Figura 2 muestra una diferencia drástica en el cambio en la masa entre todas las formulaciones. Adhesivos que contienen tanto 25 y 50 mg / ml de micropartículas de alginato demostraron cambios positivos en masa, mientras que 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS disminuyó en masa. Se encontró que todas las muestras a ser significativamente diferentes entre sí (p <0,05) con el adhesivo que contiene 50 mg / ml de micropartículas de alginato que muestran el mayor efecto de hinchamiento.

La biocompatibilidad del adhesivo propuesto se investigó tanto cualitativa como cuantitativamente mediante el uso de un ensayo de citotoxicidad Live / Dead y XTT. células HEK-293 se encapsulan en tanto 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS y 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS que contiene 50 mg / ml de micropartículas de alginato con un diámetro medio de 59,7 ± 14,9 micras . Una monocapa de células y células encapsuladas en PNIPAAm-g-CS muertos con 70% de metanol se consideraron positivos y negaTIVE controles, respectivamente. Las formulaciones sembrada con células se caracterizaron después de 5 días de crecimiento en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. Cada prueba indicó una buena viabilidad celular tanto para PNIPAAm-g-CS y PNIPAAm-g-CS con micropartículas. Las imágenes de la Figura 3 ilustran células vivas verde fluorescentes en ambas formulaciones de adhesivo (Paneles A y B) y la monocapa de células, que sirve como control positivo (Panel C). células muertas (Grupo D) son fluorescentes de un color rojo y muestran la muerte celular. Los resultados de las pruebas de citotoxicidad XTT confirmaron los resultados del ensayo Live / Dead. La viabilidad celular relativa del adhesivo que contiene 50 mg / ml de micropartículas disminuyó 1,3 veces en comparación con PNIPAAm-g-CS como se ilustra en la Figura 4, pero la disminución no fue estadísticamente significativa (p> 0,05). Tanto PNIPAAm-g-CS y PNIPAAm-g-CS con micropartículas también tenían viabilidad comparable a la monocapa de células (p> 0,05). células encapsuladas en hidrSe encontraron formulaciones OGEL y la monocapa de células a ser significativamente diferente en comparación con el control negativo (p <0,05). En general, estos resultados sugieren que el adhesivo que contiene micropartículas no sólo exhibe una mayor resistencia adhesiva, pero buena biocompatibilidad también.

Figura 1
Figura 1. Los efectos sobre la resistencia a la tracción después de incorporar diferentes concentraciones de alginato micropartículas en 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. La resistencia a la tracción de PNIPAAm-g-CS cuadruplicado con la adición de 50 o 75 mg / ml de micropartículas de alginato (p <0,5). Las barras de error representan el intervalo de confianza calculado 95% (n = 5). Las micropartículas de alginato tenían un tamaño medio de 59,7 ± 14,9 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. El efecto de concentraciones variables de alginato de micropartículas en la capacidad de hinchamiento de 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. Después de 7 días de inmersión en 37 ° C PBS, PNIPAAm-g-CS disminuyó en masa húmeda debido a las propiedades hidrófobas de PNIPAAm por encima de la LCST. PNIPAAm-g-CS con 25 o 50 mg / ml de micropartículas de alginato expuestas capacidad de hinchamiento. El aumento de la concentración de micropartículas se incrementó significativamente (p <0,05) el cambio en la masa del hidrogel de más de 7 días, que se atribuye a la absorción de agua. Las barras de error representan el intervalo de confianza calculado 95%. Las micropartículas de alginato tenían un tamaño medio de 25,0 ± 14,4 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Imágenes Representante Live / Dead de fluorescencia de las células cultivadas de células HEK-293 durante un período de 5 días. Las células se encapsulan en (A) PNIPAAm-g-CS y (B) PNIPAAm-g-CS con 50 mg / ml de alginato micropartículas. Las células también se cultivaron en una monocapa (C) y (D) matado con metanol en PNIPAAm-g-CS para representar un control positivo y negativo, respectivamente. El experimento Live / Dead viabilidad se repitió tres veces con tres repeticiones por experimento. Las barras de escala representan 100 micras. Las micropartículas de alginato tenían un tamaño medio de 59,7 ± 14,9 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. La viabilidad a corto plazo de las células HEK-293 en PNIPAAm-g-CS con alginato micropartículas. La supervivencia de las células HEK-293 encapsulados dentro PNIPAAm-g-CS con y sin micropartículas de alginato se evaluó y comparó el uso de XTT después de 5 días. Una monocapa de células y las células encapsuladas en PNIPAAm-g-CS matado con 70% de metanol se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Tanto PNIPAAm-g-CS y PNIPAAm-g-CS con micropartículas de alginato no mostraron una reducción significativa (p> 0,05) en la viabilidad celular en comparación con la monocapa de células, sin embargo, mostraron una reducción significativa (p <0,05) en la viabilidad celular en comparación con el matado Células. La adición de micropartículas de alginato no compromete significativamente la viabilidad celular de PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Las barras de error representan el intervalo de confianza calculado 95% (n = 3, seis repeticiones por experimento). Las micropartículas de alginato tenían un tamaño medio de 59,7 ± 14,9 m.ref = objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay varios pasos críticos en la síntesis del compuesto de micropartículas de hidrogel y evaluar su fuerza adhesiva, la capacidad y la biocompatibilidad celular hinchazón. polimerización por radicales libres de PNIPAAm-g-CS requiere metacrilación exitosa de sulfato de condroitina, la disolución completa de los componentes de monómero, y las condiciones de reacción libre de oxígeno. La relación de monómero a NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado en la mezcla de reacción fue elegido porque se ha demostrado, en nuestro trabajo anterior, para generar copolímeros con propiedades mecánicas similares a intervertebral nativo tejido del disco 29. El aumento de la cantidad de sulfato de condroitina en el hidrogel reducirá la pérdida de agua durante la gelificación y por lo tanto disminuir la rigidez a la compresión del gel. El grado seleccionado de metacrilación también se ha demostrado para producir hidrogeles con propiedades de manejo favorables para la inyectabilidad a través de una aguja de 18 G cuando se disuelve en solución acuosa <sup> 29. Una mayor grado de sustitución de metacrilato de la CS se incrementará la densidad de reticulación de la red de polímero, causando el aumento de viscosidad de la solución por debajo de la LCST y la reducción de gel capacidad de hinchamiento. Otros han investigado diferentes enfoques en la síntesis de hidrogeles PNIPAAm tal como polimerización radical de transferencia de átomos (ATRP) 35 o revertir la transferencia de cadena por adición-fragmentación (RAFT) 36. La polimerización a través de ATRP ha llevado al desarrollo de hidrogeles estrechas, polidispersos con peso molecular sintonizado multado alterando el monómero a iniciador. Los grupos funcionales se pueden injertar en una forma similar a un peine mediante polimerización balsa, lo que repercute entrelazamiento cadena polimérica y la separación de fases.

Una mezcla homogénea de agua en aceite es necesario en la creación de uniformes, las micropartículas de alginato reticuladas. Una técnica de emulsión es simple de realizar y no requiere el uso de productos químicos peligrosos, sin embargo ambos micropascalesforma y distribución Artículo son difíciles de controlar. tamaño de las micropartículas puede ser alterada por el aumento de la velocidad de agitación emulsión, creando así las partículas más pequeñas y vice-versa. En este estudio en particular, tamaño de las micropartículas de alginato se investigó como una propiedad potencial que pueda afectar la hinchazón, la mecánica, o la viabilidad celular. dispersión de la luz también se puede utilizar como una alternativa a la medición del tamaño medio de micropartículas. Otras propiedades de la emulsión tales como el tipo de tensioactivo y la concentración de alginato impactarán tamaño de las micropartículas y la formación de agregados 37. La disminución de la concentración de alginato se reducirá el tamaño de las micropartículas, sin embargo agregados son más propensos a formar. Las variaciones en la naturaleza hidrófila e hidrófoba de los tensioactivos afectarán a la tensión superficial entre las fases de aceite y agua, por lo tanto, cambiando el tamaño de las gotitas dentro de la emulsión. Las micropartículas de alginato pueden, alternativamente, ser producidos usando un dispositivo microfluídico, que permite particl uniformee forma y distribución de tamaño estrecha 38. Esta técnica consiste en la dispersión de una fase de alginato dentro de una fase continua de aceite que fluye a través de un canal y entra en un baño de cloruro de calcio. Draying Spray es otra técnica que produce muy pequeñas micropartículas 39. También es importante tener en cuenta que el alginato se puede cargar con proteínas o factores de crecimiento y puede ser reticulado con otros iones divalentes, tales como zinc o de bario.

En este trabajo, nos caracterizamos un sistema adhesivo con potenciales aplicaciones en la ingeniería de tejidos. Nuestro ensayo de tracción tiene como objetivo específicamente para cuantificar la fuerza de adhesión del material compuesto cuando está en contacto con el cartílago porcino. Este tipo de sustrato se seleccionó para imitar la adhesión del material compuesto de hidrogel a las placas extremas del cartílago del disco intervertebral. Otros sustratos de tejidos, tales como piel porcina, se pueden utilizar como una alternativa para cuantificar la fuerza de un adhesivo 40, pero el tipo de tejido sevariar dependiendo de la aplicación prevista. Mantener el control de temperatura adecuado del baño de agua salina y pre-enfriamiento del material compuesto antes de su uso son cruciales para medir con precisión las propiedades mecánicas. la temperatura del baño de agua elevada por encima de 37 ° C harán que el hidrogel se encoja rápidamente y se ponía rígida, mientras que los compuestos que son probados mecánicamente por debajo de 37 ° C se muestran una disminución de resistencia a la tracción debido a la falta de separación de fases. Actualmente, estamos desarrollando métodos para investigar la resistencia adhesiva al cizallamiento de varias formulaciones adhesivas inyectables. El trabajo futuro incluirá la realización de ensayos mecánicos ex vivo con los DIV porcina para determinar si el adhesivo resiste la extrusión a través de un defecto anular y restaura la funcionalidad biomecánica al segmento de movimiento espinal.

Por encima de 32 ° C, PNIPAAm-g-CS se contrae y expulsa el agua de la matriz de hidrogel debido al comportamiento LCST de PNIPAAm, resultando en una disminución de la masa por encimaun período de 7 días en PBS (Figura 2). Por el contrario, la adición de micropartículas de alginato imparte un efecto de hinchamiento y el adhesivo aumentado significativamente en masa (p <0,05) a una concentración de micropartículas de 25 mg / m y más aún a 50 mg / ml. En este estudio hinchazón, cambios en la masa húmeda del hidrogel son probablemente atribuible a intercambio de agua con el entorno, desde PNIPAAm-g-CS ha demostrado ser selectivamente degradable en presencia de enzimas 29. Muchos de los pasos del protocolo desarrollado para el estudio de la inflamación fueron adaptados en función de la termorreversibilidad de PNIPAAm-g-CS. discos de hidrogel ha de transición completa a 37 ° C antes de añadir la solución de pre-calentado PBS, de lo contrario el gel se dispersará. Después del hinchamiento durante una semana, la solución de PBS debe ser rápida y cuidadosamente removido de los viales antes de que los hidrogeles vuelven de nuevo a un estado líquido similar. Debe tenerse en cuenta que el protocolo de hinchazón se describe en este documento no simula completamente laen el ambiente in vivo de la IVD nativo. Las propiedades de hinchamiento del andamio in vivo dependerá de la presión osmótica de los tejidos circundantes 41 y comportamiento de degradación del gel. Sin embargo, en general, el aumento de la capacidad de hinchamiento con la incorporación de micropartículas de alginato se considera favorable, ya que ayudará a que el hidrogel inyectable para alojarse espacio de llenado a temperatura fisiológica. Características tales como la ratio y contenido de agua de la hinchazón se pueden calcular con las medidas adicionales de masa seca. Futuros estudios de hinchamiento se incluyen la inmersión de los discos de hidrogel contra un polietilenglicol (MW = 20.000 g / mol) de baño, que se aplicará una presión osmótica y imitar el entorno in vivo del IVD.

Aparte de las propiedades mecánicas y la hinchazón, el adhesivo debe presentar biocompatibilidad celular con el fin de ser considerado como un andamio adecuado. Estudios previos han demostrado la supervivencia de encapsulaTED en células de alginato 42,43 y materiales basados en PNIPAAm 44,45. Los resultados de ambos ensayos los Live / Dead y XTT son consistentes con estos resultados anteriores, lo que sugiere la viabilidad celular apropiada durante un período de 5 días (figuras 3 y 4). Nuestro laboratorio también ha llevado a cabo investigaciones preliminares de viabilidad durante un transcurso de tiempo más largo (21 días) y se observó un comportamiento similar. En general, un excedente de PNIPAAm-g-CS y micropartículas debe estar preparado para dar cuenta de cualquier pérdida de material durante las transferencias de pipeta. Una vez más, es extremadamente crítica para conservar la arquitectura andamio mediante el mantenimiento de condiciones de temperatura a 37 ° C. Si la red andamio vuelve de un gel a un estado líquido similar, la unión de células y la viabilidad puede verse en peligro. Con respecto al ensayo Live / Dead, citrato de sodio juega un papel importante en la eliminación y deconstrucción de micropartículas de alginato. El citrato de sodio invierte la acción reticulación entre calcium y alginato y causa una suspensión para formar 46. lavados adicionales con PBS para eliminar PNIPAAm-g-CS o alginato se pueden realizar para mejorar la calidad de las imágenes. Durante el ensayo de XTT, muestras de polímero que no contienen células se crean dentro de las placas. Estas réplicas servir de patrones en blanco y son necesarios para calcular un valor de absorbancia precisa. Nuestros estudios preliminares de viabilidad se basan estrictamente en el uso de células HEK-293. En futuros estudios, se demostró la diferenciación de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo encapsulados (AD-MSC) en células de núcleo pulposo. La diferenciación AD-MSC hacia el fenotipo NP-como se ha demostrado mediante el uso de la compresión dinámica 47 y la hipoxia 48,49.

En general, el adhesivo propuesto demuestra promesa para aplicaciones de ingeniería de tejidos en las zonas de soporte de carga, tales como el disco intervertebral, donde el éxito de la estrategia de regeneración dependerá de la capacidad andamio para resist dislocación durante el movimiento y la carga. Este sistema es muy versátil en que potencialmente podría ser adaptado para liberar las proteínas de la matriz extracelular o factores de crecimiento específicos para la aplicación deseada. Es importante destacar que los métodos descritos aquí pueden adaptarse a cualquier estudio de caracterización con polímeros de termogelificación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean expresar su agradecimiento por la asistencia del Dr. Jennifer Kadlowec en el desarrollo del protocolo de ensayo de tracción adhesiva.

Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número 1R15 AR 063920-01. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

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