Summary
Her præsenterer vi en ny Ca2 + -imaging tilgang ved hjælp af en bioluminiscerende reporter. Denne fremgangsmåde anvender en kondenseret konstruktion GFP-aequorin, som binder til Ca2 + og udsender lys, hvilket eliminerer behovet for lys excitation. Markant denne metode tillader lange kontinuerlig billeddannelse, adgang til dybe hjernens strukturer og høj tidsmæssig opløsning.
Abstract
Funktionel in vivo-billeddannelse er blevet et stærkt værktøj til at studere funktionen og fysiologi hjerneceller og strukturer af interesse. For nylig blev en ny metode til Ca 2+ -imaging hjælp af bioluminescerende reporter GFP-aequorin (GA) er blevet udviklet. Denne nye teknik beror på fusion af GFP og aequorin gener, der producerer et molekyle stand til at binde calcium og - med tilføjelse af dets cofaktor coelenterazin - udsender lys, der kan overvåges ved hjælp af en foton samler. Transgene linier bærer GFP-aequorin gen er blevet genereret for både mus og Drosophila. I Drosophila har GFP-aequorin gen blevet anbragt under kontrol af GAL4 / UAS binære udtryk, der giver mulighed for målrettet udtryk og billedbehandling i hjernen. Denne metode er senere blevet vist at være i stand til at detektere både indad Ca2 + -transients og Ca2 + -released fra indre lagre. Vigtigst det giver mulighed for en større varighed i kontinuerlig optagelse, billedbehandling på større dybder i hjernen, og optagelse ved høje tidsmæssige opløsninger (op til 8,3 ms). Her præsenterer vi den grundlæggende metode til at bruge selvlysende billeddannelse til at registrere og analysere Ca 2+ -activity indenfor champignon organer, en struktur centralt for indlæring og hukommelse i fluen hjernen.
Introduction
Den grundlæggende mønster og funktion af aktivitet inden for sine diskrete strukturer i hjernen og har længe været et område med intense studier inden for neurovidenskab. Måske nogle af de tidligste vellykkede tilgange, der anvendes til at løse dette problem var direkte fysiologiske målinger af ændringen i elektrisk aktivitet - men alternative metoder, der tillader levende billeddannelse af ændringer i spænding, pH eller calcium koncentrationer (som proxy for aktivitet) har bragt yderligere kapaciteter til studiet af neuronal aktivitet 1. Billeddannelsesteknikker bære en bred vifte af fordele såsom reduceret invasionsevne og evnen til at overvåge aktiviteten inden hele hjernen strukturer. Desuden i dyr med medgørlige genetik, herunder frugt flyve Drosophila, udvikling af genetisk kodede calcium indikatorer, såsom Cameleon, GCaMPs og andre 1 har tilladt forskere til at overvåge enkelte neuroner, neuronale populationer og hele hjernenstrukturer. Mens mere traditionelle fluorescerende calcium billeddiagnostiske metoder ved hjælp GCaMPs (GFP fusioneret til calmodulin) eller FRET (FFP og YFP fusioneret til calmodulin) har vist sig at være brugbare teknikker, der giver god rumlig og tidslig opløsning, den underliggende proces med lys excitation skaber nogle begrænsninger på dens eksperimentelle anvendelser. På grund af lysets natur excitation, autofluorescens, foto-blegning, og fototoksicitet er uundgåeligt produceret, hvilket følgelig begrænser dybden af de strukturer, der kan afbildes, varigheden af optagelser samt tidstro kontinuitet optagelse. Med andre ord skal optagelser ofte udføres intermitterende at undgå disse uønskede bivirkninger.
På grund af disse udfordringer, er der blevet udviklet yderligere alternative metoder til calcium imaging. En af de mest lovende metoder er bioluminescerende billeddannelse, som er baseret på lys, der produceres ved en enzymatisk reaktion efter calcium binding. Bioluminescent imaging kræver ikke lys excitation og derfor ikke oplever de samme vanskeligheder som konventionel calcium billeddannelse. Bioluminescerende reporter Aequorin - isoleret fra Aequorea victoria, det samme Jellyfish hvorfra GFP blev også isoleret-binder calcium via sine tre EF hand strukturer og gennemgår en konformationsændring, hvilket fører til oxidation af dets cofaktor coelenterazin og frigivelsen af blåt lys (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en meget lav affinitet for calcium (Kd = 10 uM), hvilket gør den ideel til overvågning calcium transienter fordi den producerer meget lidt baggrundsstøj og ikke interfererer med den intracellulære calcium-puffersystem 4. Selv aequorin tidligere har været anvendt til at overvåge processen med neurale induktion i Xenopus æg 5 lyset produceret er for svagt til at bruge til tidstro billeddannelse af neuronal aktivitet. I et forsøg på at tage denne udfordring, Philippe Br &# 251; lad og kolleger på Pasteur Instituttet skabt en genetisk konstruktion sammensmelte GFP og Aequorin gener, efterligne den indfødte stat i vandmænd 4. Dette fusionsgenproduktet binder calcium igen via de tre EF hand strukturer af aequorin, som gennemgår en konformationsændring, der fører til oxidation af coelenterazin, som overfører energi ikke-radiativt til GFP. Denne energi overførsel resulterer i frigivelse af grønt lys (λ = 509 nm) fra GFP, i stedet for blåt lys fra aequorin. Sammensmeltningen af GFP og aequorin giver også større proteinstabilitet hjælpe fusionsproteinet producere lys 19 til 65 gange lysere end Aequorin alene 4. Ved hjælp af en bioluminescerende tilgang i hjernen udvider den nuværende eksperimentelle anvendelse af calcium imaging både hvad angår varigheden af kontinuerlig optagelse, og antallet af strukturer i hjernen, der kan optages. Stort set i sammenhæng med tidligere arbejde betyder det, at både global og en størrekan overvåges række regionaliseret "aktivitet" i hjernen (gennem proxy af calcium transienter). Endnu vigtigere aktivitet kan overvåges i længere tid, i en realtid og kontinuerlig basis, som let egner sig til udøvelse af en fuldstændig forståelse af basal funktion i hjernen.
I de sidste par år, har vores laboratorium og andre har udviklet transgene fluer, der udtrykker GFP-aequorin under kontrol af det binære ekspressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har brugt GFP-aequorin bioluminescens at optage aktivitet frembragt af fysiske stimuli, såsom duft 7,8, samt studeret de cellulære bestanddele modulerer Ca2 + -activity i svampen organer følgende acetylcholinreceptor stimulering ved direkte nicotin-program 9. Derudover har vi også brugt GFP-aequorin til at løse en række eksperimentelle spørgsmål, som ikke har været i stand til at blive behandlet tidligere, ligesom langsigtedebilleddannelse af spontane calcium transienter og visualisering af dybere hjernens strukturer 10. På det seneste har vi brugt GAL4 / UAS system til at udtrykke pattedyr ATP-receptoren P2X 2 11 en kation kanal, i projektion neuroner (PNS) og bruges LexA systemet til at udtrykke GFP-aequorin i champignon organer (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (en høflighed af B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Dette har givet os mulighed for at aktivere PNS ved anvendelse af ATP, som til gengæld aktiverer champignon organer (en nedstrøms target i PNS), efterligner flere naturlige forhold, såsom reaktion på en stimulus lugt. Samlet denne teknik kombinerer P2X 2 og GFP-aequorin udvider de eksperimentelle muligheder. Groft det giver mulighed for bedre at forstå de mønstre af aktivitet i hjernen, indlede nye undersøgelser om, hvordan forskellige stimuli og forstyrrelser kan ændre den basale mønster af aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af prøver
- Fremstilling af opløsninger og oprette
- Bevar alle Drosophila melanogaster linjer ved 24 ° C på standard mad medium. Bagud og holde dem ved lav densitet i hætteglasset for at generere standardiseret størrelse og vægt af fluer.
- Tilføj 10 jomfruelige hunner med 10 mænd i et hætteglas, så lad dem parre sig og overføre dem hver 2 dage til en frisk hætteglas. Derefter 10 dage senere, når fluerne begynder at Eclose, høste fluerne hver dag. Hold en præcis registrering af alderen på de fluer og holde dem i god stand.
- På dag 3, adskille hanner fra hunnerne og holde hunnerne 20 fluer pr hætteglas. Optag fluerne på 4 eller 5 dage gammel.
- Forbered Ringers opløsning med følgende koncentrationer: 130 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES og 36 mM saccharose og justere opløsningens pH til nøjagtigt 7,3. Forbered perfusionsopløsninger på 25 μM nikotin og 100 mM KCl i Ringers opløsning.
- Forbered 1.000 pi pipettespids: ved hjælp af en barberblad form tip til en skrå (ca. 35 ° fra enden af spidsen) og fjern overskud af base over 1½ centimeter fra spidsen.
- Forbered boks til opbevaring (23 cm x 17 cm x 8.5 cm) af prøve under inkubation. Placer to svampe (12 cm x 8 cm x 3 cm) mættet med vand i bunden [at forhindre prøven udtørring] under en lille rack apparat til at placere prøver på som deres fremstilling er afsluttet.
- Forbered fluer prøver, så at de indeholder mindst 1 kopi af UAS-GFP-aequorin og en kopi af et Gal4 linje til at drive ekspression af GFP-aequorin. OK107 Gal4 linie (en linie kørsel udtryk primært i champignon organer) krydses med UAS-GFP-aequorin i dette præparat.
BEMÆRK: Indersiden af kassen skal være vandtæt og ydersiden skal blokere lys ind boksen for at forhindre nedbrydning af coelenterazin under inkubation.
- Bevar alle Drosophila melanogaster linjer ved 24 ° C på standard mad medium. Bagud og holde dem ved lav densitet i hætteglasset for at generere standardiseret størrelse og vægt af fluer.
- Prepredelsen af prøver
- Ice bedøver Drosophila ved at overføre det til et hætteglas og holde på is i 2 minutter, før de flyttes til kølede petriskål til placering i pipettespidsen. Forbered pipettespidser på let fugtet filtrerpapir i 100 ml petriskål på is under dissektion mikroskop.
- Forsigtigt med pincet sted flyve inde i pipettespidsen.
- Ved hjælp af en pensel forsigtigt skubbe og tilpasse flyve sådan, at hovedet er helt forbi kanten af spidsen og dorsale regionen er delvist blotlagt ved fjernes under spidsen formning (figur 2B) sektionen.
- Kombiner en lille (ca. 3-4 pi) dele af de to komponenter af dental lim. Påfør limen forsigtigt rundt om forsiden og bagsiden hoved og hals ned til og omkring pipette spids kant - undgå kronen af hovedet. Lad limen tørre i 2 minutter.
- Placer pipettespids med limede flue gennem hullet i optagelse kammer (figur 2D) og gently trykke på for at sikre på plads.
- Kombiner de to komponenter af silicium lim (ca. 3-4 pi). Påfør lim på den flade side af kammeret langs kanten, hvor kammeret og pipettespidsen mødes for at forhindre lækage af Ringers opløsning. Lad limen tørre i 2 minutter.
- Dissektion
- Anbringe tape over perfusionskanal, korte kant og strækker sig til bagsiden af kammeret.
- Placer kammer med flue på dissektion blok under mikroskop tænde lysstofrør. Pipetter 1 ml Ringers opløsning ind i kammeret.
- Brug fine kirurgiske kniv til at fjerne kutikula. Gøre parallelle snit fra bagsiden af hovedet til antennal region. Derefter skæres langs kanten af øjet derefter foretage en vinkelret snit over antenne forbinder de tidligere indsnit. Foretage en endelig snit parallelt med, at der på bagsiden af hovedet. Brug de fine skarpe pincet til at fjerne neglebånd (figur 2C).
- Brug fine skarpe pincet til forsigtigt fat end rydde væk eksponerede respiratorisk væv indtil hjernen og [fluorescerende] champignon krop er tydeligt visualiseres.
- Brug ultra-skarpe pincet til forsigtigt gribe og knibe neuroepitel væv, der dækker hjernen for at tillade gennemtrængning af coelenterazin.
BEMÆRK: Alternativt papain kan anvendes til at permeabilisere neuroepithelia 9. - Ved hjælp af en pipette, skylles to gange med Ringers opløsning for at fjerne eventuelle rester fra dissektion og sted prøve i mørke kassen.
- Pipetter 1 ml Ringers opløsning indeholdende 5 pM benzyl-coelenterazin ind i kammeret. Lukke boksen og tillade inkubation med coelenterazin ved stuetemperatur i mindst 2 timer.
2. Imaging
- Opsætning
- Start optagelsen systemet: tænde mikroskop, computer, kamera og afløbssystem og sæt værelse miljøkontrol til 25 ° C.
- Åbn Måling og Automation Explorer program på computeren. Klik på “ Enheder og Interfaces ", så dobbeltklik på" NI Motion Devices "og endelig højreklikke på" PCI-7334 "og vælg" initialisere enhed ".
- Åbn Photon Imager. Opret ny mappe og navn første indspilning fil. Kamera skal være -80 ° C, før systemet vil fungere.
- Opsætning perfusionssystem - tilføj KCI, nikotin og Ringers opløsning til reservoirer og justere, så de hver især udledninger løsning på 2 ml / min. Vask med Ringers opløsning før start eksperiment.
- Forbered prøve
- Placer billedbehandling montere blok parabol på mount under mikroskop på 5x forstørrelse og indsæt perfusion rør ind kanal gennem punktering.
- Sæt mikroskop til fluorescerende tilstand derefter centrum og bringe champignon organer (MBS) i fokus. Juster til 20X og re-center og fokus.
- Position dræning apparat i løbet af dræning pool, justere højden af dræning shunt så spidsen er bare above pool og køre Ringers opløsning i 30 sek for at sikre tilstrækkelig dræning.
- Træk ned skjold at lukke apparat mod lys. Brug af automatiseret system i foton imager foretage fine justeringer af fokus og tage en reference fluorescerende billede af MBs.
- Indspilning
- Juster foton hastighed til den ønskede optagehastighed (fra 50 msek op til 1 sekund eller mere). Vælg foton tilstand og åben lukker. Optag genotype, køn, alder, og prøve nummer i logposter. Juster positionen ROI kasser end blomsterbægeret og celle organer (CCB) og mediale lapper ved at klikke på ROI kasser og trække, mens du holder kontrol.
- Optag baseline for ca. 5 til 10 minutter (som ønsket).
- Anvend nikotin i 1 min. Bemærk start / stop i loggen. Vask med Ringers opløsning i 5 minutter.
- Vent 5 min til nyttiggørelse og forberede KCl log indrejse og timeren.
- Anvend KCl i 1 min. Bemærk start / stop i loggen. Vask med Ringers opløsning i 1 min.
- Kontakttil fluorescerende tilstand, tage endelig fluorescerende billede, og slukke Ringers opløsning.
- Tryk på "Stop". Dialogboks bede om at slukke for systemet. Vælg "Nej" for at fortsætte optagelsen.
- Åbent skjold, flytte afløbssystemet, skifte linse mål til 5X, fjerne perfusion rør. Fjern prøven / optagelse fad fra scenen, rense ud 20X objektivet ved at skylle og tørre linsen to gange med vand.
- Tryk den hvide play-knappen øverst i programvinduet at indlede næste optagelse.
3. Analyse og Video Creation
- Uddrag foton værdier
- Åbn foton analyseprogram (f.eks Photon Viewer), og åbne første prøve regneark fil.
- Vælg fanen display kontrol. Vælg ROI ved at klikke på området, mens du holder kontrol. Juster størrelse, orientering og form af områder af interesse til at omfatte GFP belyst CCB og mediale lapper.
- Tilføj en tilføjelseal ROI ved at klikke på "Definer ROI", og klikke og trække på skærmen for at oprette den nye ROI.
- Vælg "Film" fanen for at afspille foton video. Juster "sec bredde" og "sec skridt" som ønsket. Juster placering ROI som nødvendigt.
- Vælg repræsentative skærmbilleder af GFP-fluorescens, nikotin respons og KCI respons. Beskær screenshots og indsæt billedet i en præsentation dias til senere analyse og sammenligning.
- Juster både "sec bredde" og "sec step" til optagehastighed på få sekunder. Vælg længde på analyse ved at flytte grå markører på toppanelet til beslag region, før stimulus initiering og lige efter svar ende.
- Vælg "Suspender visninger, mens du spiller" tryk "<< REW" og tryk på "PLAY>". Vælg fanebladet "Count Rate Chart", og juster enheder som ønsket og line farver til at matche ROI farve.
- Når analysen er færdigSkal du trykke på "Export Count Rate data". Vælg skærmbilleder af kombineret optagelser CCB og mediale lap region af interesse fra hver side. Beskær screenshots og indsæt billedet i et dias med respons billeder. Denne slide vil blive senere brugt i den endelige analyse.
- Eksempel Analyse: en metode til analyse af ekstraherede foton data beskrevet
- Åbn regnearksfiler i "Tæl Rate Eksport" mappe.
- Omformatere cellerne den første kolonne mærkede tid at vise tiden i timer og minutter.
- Henvisning den tilsvarende slide for prøven. Fjern alle værdier undtagen kolonner for den tid og de to repræsentative ROIs.
- Bestem nikotin stimulation starttidspunktet - fås i loggen fil i main Mappe- fjerne yderligere data før start eller fremhæve værdi.
- Find højeste / peak værdi for både CCB og mediale lap og mark / highlight.
- Bestem starten respons og sluttidspunkt for bådeCCB og mediale lap ved at skabe et skøn ved brug tidspunkt fra tilsvarende tegnes reaktion på dias og vælg faktiske værdi ved ændring i værdier i nærheden af disse punkter. Fremhæv området mellem disse punkter i både CCB og mediale lapper. Alternativt kan du bruge en makro 9.
- Kombiner alle prøver af én forsøgsgruppe på et nyt regneark.
- Juster på top ved at bestemme rækken værdi for hver CCB spidsværdi. Fratræk de lavere værdier fra den højeste række, for at bestemme omtrentlige rækken værdi, hvor at data prøve skal recopied til. Kontroller, at alle spidsværdierne er justeret.
- Kopier arket to gange og slette enten mediale lap kolonner eller CCB kolonner skabe sider med kun CCB eller mediale lap værdier.
- Fjern data, efter de alle CCB svarene er afsluttet. Opret fire rækker mærket Total Fotoner, Reaktion Længde (varighed), Peak amplitude og Reaktion Latency. Kopier og indsæt dette igen under originalerne.
- Brug funktionen SUM til bestemmelse af samlet fotoner under respons. Brug COUNT funktion til at bestemme længden af respons. Kopier og forbinde højeste værdi celle for at bestemme amplitude værdi. Brug COUNT funktion - vælg fra begyndelsen af perfusionen af nikotin til starten af reaktionen - at bestemme Reaktion Latency.
- Kopier værdier ved hjælp af sammenkobling funktion og formere (alle undtagen peak amplitude) ved at registrere hastigheden på få sekunder.
- Kan oprettes Bar / kasse grafer for beregnede parametre som Total Fotoner, Peak Amplitude og reaktion Længde, hvis det ønskes (tidl .: Figur 5B, C, D).
- I kolonnen efter rådata foton svar, gennemsnit de rå datapunkter for hvert tidspunkt ved hjælp af gennemsnit funktion. Hvis det ønskes opfølgning med en kolonne bestemmelse af standardfejlen af middelværdien (SEM) for hver af de midlede foton værdier på et tidspunkt.
- Brug den gennemsnitlige kolonne for at konstruere en gennemsnitlig respons profile [Graph] for CCB prøve gruppen. For at gøre dette skal du vælge kolonnen angiver tid som x-aksen værdier, og søjlen af den gennemsnitlige foton værdier som y-aksen og til slut vælge scatterplot grafen oprettelsen værktøj.
- Gentag denne analyse procedure med data fra de mediale lapper.
- Oprettelse billeder til video
- Åbent foton fremviser.
- Vælg fanebladet kontrol. Klik på ROI, mens du holder for at vælge, fjerne og / eller minimere det.
- Ændre "sec bredde" (ophobning tid) som ønsket for at bestemme indholdet af hver ramme.
- Ændre "sec trin" til at definere overlapningen af hver ramme.
- Vælg "synspunkter eksport, mens du spiller" tryk "<< REW" og derefter "PLAY>". Billederne til videoen vil blive eksporteret til mappen "view eksport" som en række .png filer.
- Brug Virtual Dub til at gøre video: en metode til video creation detaljeret
- Opret en ny mappe med navnet "Resultats" i visningen eksport mappen med billederne.
- Bring script (renommer.VBS) i mappen med billeder.
- Dobbeltklik på renommer.VBS til at køre.
- Billeder vil automatisk blive omdøbt numerisk og kopieres til mappen "Resultats".
- Åbn VirtualDub.exe.
- Vælg åben videofil - vælg første billede (efterfølgende billeder vil automatisk indlæse).
- Vælg video - vælg frame rate justeres som ønsket.
- Vælg video - vælg kompression vælge Cinepak Codec af radius.
- I filen skal du vælge Gem som AVI video vil blive oprettet automatisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fusion af GFP til aequorin giver os mulighed for at visualisere vores region af interesse forud for bioluminescerende billeddannelse gennem excitation af GFP i fluorescerende tilstand på mikroskopet (figur 3A, 4A, 6A, 6E). En af de enkleste måder at stimulere champignon organer er gennem aktivering af ionotropiske nicotinacetylcholinreceptorer. Selv acetylcholin er endogene ligand for denne receptor har vi fundet, at nikotin producerer mere reproducerbare responser i svampen organer. Dette er delvist fordi de specifikt udtryk nicotinacetylcholinreceptorer, og dermed ved hjælp af nikotin vi kan undgå aktivering af muskarine acetylcholin receptorer udtrykt andetsteds i hjernen. Desuden nikotin er mere stabilt end acetylcholin, og dermed giver bedre og mere pålidelig stimulus kontrol. En typisk reaktion begynder med den hurtige aktivering af begge bæger, celle-organer (CCB) og mediale lapper (ML) (se figur 4A for mærket billede). Generelt CCB respons holder længere og udviser en større bioluminescerende reaktion end lapperne som vist i sekventielle paneler af responset (figur 3C-H). Figur 4B viser en 10 sek akkumulering af fotoner, der er optaget på en tidsmæssig opløsning på 100 msek (10 Hz) under spidsbelastning af et svar på en 1 min perfusion af 25 uM nikotin. Efter udvaskning og restitutionsperiode på 10 minutter blev en anden stimulering af en 1 min perfusion af 100 mM KCI påbegyndes (figur 4C, E), der giver os mulighed for at bekræfte levedygtighed vores prøve. De kvantitative svar kan analyseres ved at vælge ROI under analysen i foton viewer. Kørsel af analysen i foton fremviser producerer både grafer viser antallet af fotoner, der udsendes i udvalgte ROI over tid (figur 4D og E) samt eksporteres regneark af disse værdier. Figur 4D er en example af graferne produceret af foton seeren plotte fotonerne udsendes i ROI 2 [grøn] (højre CCB) og ROI 4 [blå] (højre mediale lapper). Tilsvarende data for KCI respons vist i figur 4E. De eksporterede data kan anvendes til at rekonstruere kurve af respons (figur 5A) samt til at udtrække yderligere data om forskellige parametre, såsom varighed, peak amplitude, og den samlede respons (figur 5B-D). Senest ved hjælp GAL4-UAS og LexA systemer har vi udviklet en fremgangsmåde til at fremkalde en mere naturlig reaktion. Kort fortalt er ATP-gated P2X 2 kation kanal udtryk i projektion neuroner (PNS) og GFP-aequorin (GA) udtrykkes i champignon organer - et mål af PNS; dette gør det muligt for os at selektiv excitering af PNS om anvendelsen af ATP, som kan til gengæld producerer respons i svampe organer (figur 6).
Figur 1. Karakteristik af Bioluminescent Journalister (GFP-aequorin). (A) Skematisk af GFP og aequorin fusion gen med opstrøms sekvens aktivering. (B) Model blå lysemission ved aequorin som reaktion på høje niveauer af Ca2 +. (C) Model af grønt lys emission af GFP-aequorin som reaktion på høje niveauer af Ca2 +. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksperimentel oprettet. (A) Fly placeret i pipettespids. (B) En illustration af passende limning teknik stabilisere hovedet og tætner området mellem flue krop og pipettespids. (C) Skematisk af dissektion at åbne hoved kapsel. (D) 1 ml kammer på at holde blok med perfusion rør indsat. Total kammer dimensioner: længde: 7.4 cm, bredde: 2,7 cm, højde: 0,55 cm. Indre kammer dimensioner: længde: 1,7 cm, bredde: 1,4 cm, højde: 0,35 cm, og radius af kammeret hul: 0,1 cm. (E) Udsigt af flyve hoved viser GFP-positive signal i MBs: lav dæmpet lys med fluorescens stammer fra OK107-drevne GFP-aequorin efter fjernelse af neglebånd. (F) mikroskop med foton kamera og perfusionssystem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. repræsentant respons på 25 uM nikotin i svampe organer. (A) Fluorescerende billede afGFP-aequorin udtryk i champignon organer GA2 / +; OK107 / + kontrol flyve hjernen (skala bar = 50 um). (B) Peak bioluminiscerende respons i champignon organer. (C) Forud for stimulation. (D) Start af respons. (E) Peak respons. (F) Fortsat CCB respons. (G) Falling CCB respons. (H) Slutningen af respons (BH: Målestokken = 33 um). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentant analyse af prøve-optagelse (A) Fluorescerende billede af svampen krop GA2 / +;. OK107 / + kontrol flyve med fire ROI er udvalgt over CCB og mediale lapper (skala bar = 50 um). (B) 10 sek akkumulering af bioluminescerende reaktion på 25 uM nikotin - foton respons registreres ved 100 msek. (C) 10 sek akkumulering af bioluminescerende reaktion på 100 mM KCI registreret ved 100 msek. (D) Graf over registrerede antal fotoner, der udsendes i løbet af nikotin svar inden ROI s 2 og 4, der dækker den rigtige CCB og mediale lapper hhv. (E) Graf over registrerede antal fotoner, der udsendes i løbet af KCl svar inden ROI s 2 og 4, der dækker de rigtige CCB og mediale lapper hhv. I d og e, venstre Y-aksen svarer til det samlede antal fotoner inden for hele synsfeltet, mens den højre Y-akse svarer til fotoner i ROI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative parametre analyse af prøve optagelse Repræsentant excel analyse af det bioluminescerende reaktion på nikotinsyre aktivering af svampen krop i GA2 / +;. OK107 / + kontrol flue. (A) Photon respons over tid i CCB og mediale lapper. (B) Varighed af svarene i CCB og mediale lapper. (C) Højeste foton værdi (maksimal amplitude) under svar inden for den CCB og mediale lapper. (D) Total fotoner inden CCB og mediale kamre af hele respons. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. To forskellige svar i champignon organer efter stimulering af PNS thrdybdegående ATP og P2X 2. Prøve 1 flue udtrykker P2X 2 i PNS og GFP-aequorin i champignon organer (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) Fluorescerende billede af svampe organer med ROI s (skala. bar = 50 um). (B) Bioluminescent billede af spidsrespons i champignon organer efter aktivering af PNS ved P2X 2 stimuleret med 500 pM ATP, observeret primært i mediale lapper. (C) Bioluminescent billede af top KCI respons. (D ) Tidsforløb for foton emission inden ROI regioner, hele svaret Prøve 2 flue udtrykker P2X 2 i PNS og GFP-aequorin i champignon organer (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) Fluorescerende billede med ROI s (skala bar = 50 um). (F) Bioluminescent billede af den inducerede respons i champignon organer efter enctivation af PNS af P2X 2 stimuleret med 1 mM ATP i begge kamre og CCB. (G) Bioluminescent billede af top KCI respons. (H) Tidsforløb for foton emission inden ROI regioner, hele svaret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nyligt udviklede bioluminescerende-baserede GFP-aequorin tilgang præsenteres her tillader in vivo funktionelle registrering af Ca 2+ -activity i forskellige neuroner, samt, hvis det ønskes, i andre slags celler såsom nyre stjerneformede celler som rapporteret i Cabrero et al. 2013 5.
Modifikationer, problemer skydning, yderligere komponenter, og kritiske trin
Drosophila Husbandry
GFP-aequorin transgen (pG5A) 4 blev indsat i vektoren pUAST at skabe tre uafhængige transformerede linjer 6. Alle linjer blev testet for deres bioluminescens, og alle var i stand til at reagere på in vivo Ca 2+ -activity 6. Men nyere forsøg har påpeget, at GA2 linie indsat på den tredje kromosom genererer mere robust signal end GA1 linje indsat on andet kromosom. Her blev de repræsentative resultater opnås ved anvendelse af UAS-GA2 krydsede med MB-specifik linje OK107. Desuden nylig B. Pfeiffer har genereret et GFP-aequorin konstruktion placeret under kontrol af 20XUAS regulerende element (20X-G5A-2) og denne konstruktion er blevet valideret i vores laboratorium. Kort fortalt, det giver et meget stærkt signal, stærkere end vores standard GA2, som derfor skal være mere effektiv og nyttig til yderligere at overvåge Ca2 + -activity i dybere strukturer i hjernen, såsom ellipsoiden kroppen. Derudover kan det også være nyttigt til billeddannelse små mængder af neuroner eller i axonterminaler (synaptiske kontakter).
Forberedelserne til Imaging
Selv fluen skal is bedøvet under positionering og limning, er det vigtigt at minimere tiden på is. Fluer bør overføres til et hætteglas og holdes på is i 2 minutter, inden de flyttes til den afkølede petriskålentil placering i pipettespidsen. Vi har bemærket, at længere periode af anæstesi reducerer levedygtigheden af prøven og kan dæmpe svar. Optimalt holder vi den tid af is anæstesi under 5-10 min.
Tape og limning er kritiske trin. Det er afgørende at sikre fluen hovedet på plads for dissektion og billedbehandling samt at forhindre lækage af Ringers opløsning i pipettespidsen og / eller ud af optagelsen kammeret. Dental lim (og i mindre grad silicium lim) bliver klæbrig og efterfølgende begynder at tørre, så snart de to komponenter kombineres. Derfor er det vigtigt at anvende limen hurtigt for at undgå svage binding og sammenklumpning af limen. I nogle tilfælde har vi bemærket, at alternative sorter af tape og lim, når de i kontakt med Ringers opløsning, kan frigive forurenende stoffer ind i Ringers opløsning, som kan påvirke fluen og dens reaktion, især for eksperimenter dedikeret til than studere af olfaktoriske system ved hjælp af forskellige lugte. Derfor forsigtig her hvis erstatte materialer (se materialer til specifikke sorter, vi bruger).
Flere forskellige former for coelenterazin er blevet udviklet med henblik på at optimere dens aktivitet som lysets hastighed emission, Ca 2+ -affinity (følsomhed) eller intensiteten af lysemissionen 12. For eksempel det native coelenterazine er mere stabil, således mere velegnede af langsigtet billeddannelse som flere timer, mens benzyl-coelenterazine (også kaldet H-coelenterazin) resulterer i en hurtigere og højere lysudsendelse med kortere halveringstid. Yderligere oplysninger om de forskellige former for coelenterazin, se web-adressen i Materials List.
Imaging
Bioluminescens signaler kan overvåges med en elektron multiplikator CCD-kamera (EM-CCD, afkølet til -80 ° C) monteret på et mikroskop. Denne opsætning skal be opstaldet inde i en stram mørk boks for at undgå enhver uønsket (omgivende) lys forurening. Beskrevet i dette manuskript setup bruger en 20X nedsænkning-objektiv tillader et synsfelt på 400 x 400 um (512 x 512 pixels). For at forbedre signal-støj-forholdet, blev data opnået med en 0,100 sek integrationstiden (10 Hz), og 2 x 2 binning blev anvendt (1 pixel = 1,2 x 1,2 um). At erhverve og lagre data, blev hver detekteret foton tildelte x, y-koordinater og et tidspunkt. Mellem 500 og 600 nm bølgelængde, EM-CCD-kamera (se præcis beskrivelse i Materialer List) har en kvanteudbytte på 96%.
En af de mest afgørende parametre for in vivo funktionelle brain imaging er den tidsmæssige opløsning. Indtil nu har de fleste af fluorescens-baserede Ca2 + -imaging teknik, såsom GCaMP og cameleon giver en tidsmæssig opløsning på ca. 4 Hz (250 ms / ramme). For nylig, med bioluminescens-baserede GFP-aequorin vi har været i stand til at Raise købet tid op til 100 ms / ramme med EMCCD kameraet og endda op til 120 billeder / sek (8,3 msek / ramme) med elektronmultiplikator ICDD kamera 10. På dette tidsmæssige opløsning nærmer sig de elektrofysiologiske teknikker (i området fra omkring 1 ms). Mens høj tidsmæssig opløsning er både informative og afgørende for de undersøgelser, dedikeret til synaptisk transmission og stimulus-induceret aktivitet, udvidet langsommere endnu afgørende Ca 2 + -kinetics også sker inden neuroner, fx Ca 2+ frigivelse fra intracellulære Ca 2 + -stores (for en gennemgang: Berridge et al, 2003 13.). For den sidstnævnte type, en langsommere tidsmæssig opløsning stadig er acceptabel, mens omvendt, de kræver generelt en bedre Ca2 + -affinity fra sensoren, der skal detekteres. Dette krav er opnået med GFP-Aequorin at opdage frigivelsen af intracellulære Ca 2 + -stores på Axon terminalen på olfaktoriske receptperiferi neuroner 7,8. Alternativt, afhængigt af de ønskede eksperimentelle betingelser, langsommere erhvervelsestiden kunne anvendes. For eksempel, i lang O / N optagelser, har vi anvendt en 2 sek integration gange på grund af det store antal datapunkter indsamlet (Minocci et al., 2013). Kort sagt, en praktisk funktion med bioluminescens er, at den tidsmæssige opløsning kan nemt justeres i overensstemmelse med de ønskede eksperimentelle betingelser.
Alternative kamre (flue s setup) er blevet udviklet for at lette mål eksperimentet. For eksempel, for de undersøgelser baseret på naturlige lugt stimulus, antennen skal holdes fri, derfor en tilgang som den er udviklet af A. Fiala 14 er bedst egnet (vi brugte en lignende tilgang til Murmu et al. 2010). Kort fortalt er i dette approach, fluen er bundet (limet) på en minutien pin ved halsen, som er limet til en plastik dækglas indeholder et lille hul. En tætning er skabtrundt om toppen af hovedet af fluen. Derefter er en dråbe Ringer deponeret på hovedet, og hovedet kapslen dissekeres. På en sådan måde, er antennerne holdes fri og er tilgængelige til at fornemme lugte. Tilsvarende kan på lang sigt optagelse, som O / N eller endda par dage 10 fluen behov holdes fri for begrænsning som muligt, og i nogle tilfælde tilføres (for eksempel: med en kapillær papir gennemvædet med en glucose 5% løsning). Under disse omstændigheder Fiala tilgang er også mere velegnet end tilgangen i den blå pipette spids (snorkling metode).
Alle narkotika applikationer kan styres eksternt ved hjælp af en 6-vejs multi-ventiler tyngdekraften perfusionssystem. Strømmen kan styres ved anvendelse af volumetriske perfusion regulatorer kalibreret før hver optagesession for en strøm på 2 ml / min. Apparater dræning udtrækker væske ved en hastighed på 2 ml / min fra kontrolapparatet kammeret via peristaltisk pumpe tillader en kontinuerlig strøm.
Inogle betingelser, på grund af dyre omkostninger af lægemidlet og / eller mængden af stof til brug, vil man gerne kun at anvende små mængder af forbindelser. Således er det nødvendigt at anvende den direkte i badet i stedet for gennem perfusion system. I dette tilfælde lukkeren skal være lukket under denne proces for at undgå lys forurening.
Analysemetoder
Tællinger pr sek eller tællinger pr sek pr koordinat er begge blevet brugt af vores gruppe til analyse. Tæller per sekund er måske bedst egnet til lyse reaktioner i hele strukturer, mens tællinger pr sek og pr koordinat (som repræsenterer en normalisering af svarene på størrelsen af ROI) er bedst egnet og præcis for små populationer af celler. Begge kan let udvælges i analysen software.
En af de vigtigste fordele ved at bruge bioluminescens fremgangsmåde er den måde, som er erhvervet og lagres data (x, y, t parametrehvert udsendte fotoner). Faktisk mens andre billeddiagnostiske teknikker, der anvendes standard mode som en erhvervet fuld billede (generelt i en tiff-format), med dette system, vi opnår kun de relevante og væsentlige signal ved at gemme kun de pixelkoordinaterne, der er blevet aktiveret af lyset i løbet af en forhånd fastsatte tidsrum (som svarer til den tid, erhvervelse eller tidsmæssig opløsning). Derfor lagring af data er virkelig "lys" i forhold til opbevaring et fuldt billede, og dermed gør det lettere at analysere data. Til dataanalyse, bruger vi en relateret software (foton seeren), som giver mulighed for indstilling af ophobning tid som ønsket. Derefter visningen af et billede af signalerne kan justeres som ønsket i et mål overbevisende præsentere data. Sideløbende resultaterne kvantificeres på samme opløsning tid end deres erhvervelse tid.
Betydning og biologiske anvendelser af bioluminescerende billeddannelse
Som nævnt ovenfor bioluminescerende calcium imaging tilbyder tre principielle fordele til fluorescerende calcium billeddannelsesteknikker: (1) en dybere områder af hjernen kan afbildes, (2) afbildning kan forekomme kontinuerligt i længere varighed som adskillige timer som O / N og endda i nogle tilfælde op til to dage, og (3) mere for nylig, med en højere tidsmæssig opløsning, op til 120 ramme / sek (8,3 ms). Den væsentligste begrænsning af bioluminescerende tilgang er på grund af sin uforenelighed med konfokal belysning, som derfor ikke tillader os at fastlægge den nøjagtige dybde (z-planen) af de aktiverede strukturer eller neuroner.
Den første fordel ved bioluminescerende billeddannelse, billedbehandling af dybe områder af hjernen, er tidligere blevet påvist i 2007 af billeddannelse af et højt kalium induceret calcium svar inden for den ellipsoide legeme (eb), en dyb struktur placeret i midten af hjernen, uden forudgående elektrofysiologiske eller funktionelle rapporter 6 Ca2 + -activity i eb efter påføring af picrotoxin (en blokker af GABA A receptorer), viser, at GABAerge ring-neuroner i eb er faktisk hæmmende neuroner (beskrevet i :. Ble et al, artiklen indsendt).
Den anden fordel, længere og kontinuerlig tidsregistrering, er blevet udnyttet i flere undersøgelser fra vores laboratorium. Lugt stimulation er blevet anvendt til at undersøge aktiviteten af hjerneneuroner i tidligere undersøgelser 11,15,16. Brug længere sigt billedbehandling, dog har vores laboratorium været i stand til at vise tidligere urapporteret ændringer i kinetik inden for de olfaktoriske receptor neuroner til lugte. Den første undersøgelse af Murmu et al. (2010) viste, at mens korte lugt stimuli (1-3 sek) udviste lignende kinetik og kun en moderat forskel i amplitude, en længere lugt stimulus (5 sek) forårsagede en meget større amplitude samt en ændre sig i kinetik / structure af respons, som blev tilskrevet intracellulære calcium butikker. En efterfølgende undersøgelse viste, at mens 5 på hinanden følgende anvendelser af 1 sek lugt pulser ved 5 minutters intervaller ikke ændre deres calcium respons, at øge længden af stimulus til 5 sek ført til en gradvis dæmpning af reaktionen, hvilket tyder på en tilpasningsproces. Optrådte desuden denne tilpasning fænomen at være indledt, GABAergic regulering af tidligere identificerede calcium butikker 8. Vigtigst disse data også viser sig, at der i denne eksperimentelle betingelse, kan GFP-aequorin er Ca2 + -sensor detektere og følge calcium frigivet fra de intracellulære Ca2 + -stores. En ekstra unikke undersøgelse fra vores laboratorium bruges bioluminiscerende imaging O / N for at optage basal (spontan) aktivitet i hele neuronale og gliale populationer i hjernen samt aktivitet i champignon organer 10. Disse optagelser afslørede overraskende spontan aktivitet i antennal mechanosensory og motoriske center (AMMC) og antennal lap. Endvidere uventede celleautonom aktivitet i glia forekommende hele natten. Inden svampen krop undersøgelsen identificeret både punktformig aktivitet og to markante toppe, en kort og en lang, hvis hyppighed ændres med alderen 10.
I den seneste undersøgelse i vores laboratorium, vi brugte selvlysende billedbehandling til at undersøge virkningerne af manipulation af sekundære signalsystemer molekyler impliceret i hukommelsen, og hvordan de påvirker calcium svar inden svampen organer 9. Selv om dunce og rutabaga blev identificeret mere end 30 år siden, og er kendt for at regulere niveauet af cAMP, deres in vivo virkninger på cellulære og fysiologiske mekanismer og især på Ca2 + -svar stadig stort set ukendt. Med GFP-aequorin tilgang, har vi været i stand til samtidigt at optage både bæger (den dendritiske struktur) og cellelokaliteterne organer, samt de axonale projektioner på niveau med lapperne, og dermed gør det muligt at korrelere niveauet og den kinetiske af responset i de forskellige rum i denne meget komplekse struktur.
Den seneste program, vi er ved at udvikle efterligner en naturlig reaktion gennem kunstig aktiverende neuronale populationer præsynaptiske til strukturen af interesse. For at gøre dette, vi udtrykker P2X 2 receptoren, en ligand-gated kation kanal, som er lydhør over for ATP, i den præsynaptiske neuron og udtrykker GFP-aequorin i den post-synaptiske neuronal befolkning. Adskillelse af disse to elementer i forskellige neuronale populationer kræver to separate ekspressionssystemer. Til dette formål en LexA konstruktion indeholdende GFP-aequorin er blevet oprettet. I vores indledende forsøg med dette system, vi har udtrykt P2X 2 i en undergruppe af PNS hjælp af Gal4-GH146 med UAS-P2X 2 og GFP-aequorin i svampen organanvendelse af LexA MB247 line kombineret med LexA-13X-GFP-aequorin. Vi har med succes optaget calcium reaktioner i kroppen med svamp stimulationer af 1 mM ATP til P2X 2 receptoren i PNS (figur 6).
Afslutningsvis har bioluminescence GFP-aequorin tilgang vist sig at være nyttige i at optage stimulus induceret Ca2 + -activity, analogt med andre Ca 2 + -indicators. Men endnu vigtigere, det tillader også påvisning af spontan Ca 2+ -activity i hjernen. Denne tilgang åbner fremtidige muligheder for langsigtede eksperimenter og hele hjernescanning, der kan øge dybden af vores forståelse af de fysiologiske fænomener og aktivitetsmønstre i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
