Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

In Situ karakterisering av Hydratiserade proteiner i vatten av Salvi och ToF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Detta arbete presenteras ett protokoll för vätskehantering och provinför till en mikrokanal för in situ time-of-flight sekundär jon masspektrometrianalys av protein biomolekyler i en vattenlösning.

Abstract

Detta arbete visar in situ karakterisering av protein biomolekyler i vattenlösningen med hjälp av systemet för analys vid Liquid Vacuum Interface (SALVI) och tids of-flight sekundär jon masspektrometri (ToF-SIMS). Fibronektin proteinfilm immobiliserades på kiselnitrid (SiN) membran som bildar SALVI detektionsområdet. Under ToF-SIMS analys har tre lägen för analys utförs inklusive hög rumslig upplösning masspektrometri, tvådimensionell (2D) avbildning och djup profilering. Masspektra förvärvades i både positiva och negativa lägen. Avjoniserat vatten analyserades även som ett referensprov. Våra resultat visar att fibronektin filmen i vatten har mer distinkta och starkare vatten kluster toppar jämfört med enbart vatten. Karakteristiska toppar av aminosyrafragment är också observeras i den hydratiserade protein ToF-SIMS-spektra. Dessa resultat illustrerar att proteinmolekylen adsorption på en yta kan studeras Dynamically använder SALVI och ToF-SIMS i vätskemiljö för första gången.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydration är avgörande för struktur, en konformation, 2 och biologisk aktivitet 3 av proteiner. Proteiner utan vattenmolekyler som omger dem skulle inte ha livskraftiga biologiska aktiviteter. Specifikt vattenmolekyler interagerar med ytan och inre strukturen av proteiner och olika vätsketillstånd proteiner göra sådana interaktioner distinkt. 4 Samspelet mellan proteiner med fasta ytor är en grundläggande fenomen med konsekvenser i nanoteknologi, biomaterial och vävnadstekniska processer. Studier har länge indikerade att konformationsändringar kan uppstå som ett protein påträffar en yta. ToF-SIMS har tänkt som den teknik som har potential för att studera protein-fasta gränssnittet. 5-7 Det är viktigt att förstå hydratiseringen av proteiner på fasta ytor, vilket potentiellt ger en grundläggande förståelse för mekanismen för deras struktur, konformation, och biological aktivitet.

huvudyta analytiska tekniker är emellertid mestadels vakuumbaserade och direkta applikationer för flyktiga flytande studier är svårt på grund av snabb avdunstning av flyktiga vätskan under vakuum. Vi utvecklade ett vakuum kompatibel mikroflödes gränssnitt, system för analys vid Liquid Vacuum Interface (SALVI), för att möjliggöra direkta observationer av flytande ytor och vätske fast interaktioner med hjälp av time-of-flight sekundär jon masspektrometri (ToF-SIMS). 8- 11 de unika aspekterna omfattar följande: 1) detektionsfönstret är en öppning av 2-3 mikrometer i diameter för att direkt avbildning av vätskeytan, 2) ytspänningen används för att hålla vätskan i öppningen, och 3) SALVI är portabel mellan flera analytiska plattformar. 11,12

SALVI består av ett kiselnitrid (SiN) membran som detekteringsområde och en mikrokanal tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS). Det är fabricated i renrummet och tillverknings och nyckeldesignfaktorer har i detalj i tidigare artiklar och patent. 8-12 Ansökningarna från ToF-SIMS som ett analytiskt verktyg visades med hjälp av olika vattenlösningar och komplexa vätskeblandningar, en del av som innehöll nanopartiklar. 13-17 Specifikt tillåter SALVI flytande ToF-SIMS dynamisk sondering av flytande och fast gränssnitt av levande biologiska system (dvs, biofilmer), enskilda celler och fast elektrolyt gränssnitt, öppnar nya möjligheter för in situ kondenserad fas studier inklusive vätskor med hjälp av ToF-SIMS. Men den nuvarande utformningen inte tillåta gas och vätska interaktioner ännu. Detta är en riktning för framtida utveckling. SALVI har använts för att studera den hydratiserade proteinfilmen i detta arbete för första gången.

Fibronektin är ett vanligt använt protein dimer, bestående av två nästan identiska monomerer kopplade genom ett par av disulfidbindningar, 18 som jags väl känd för sin förmåga att binda celler. 19,20 Det valdes som ett modellsystem för att illustrera att det hydratiserade proteinfilmen kan dynamiskt sonde använda SALVI vätska ToF-SIMS strategi. Proteinlösningen infördes i mikrokanalen. Efter inkubation under 12 h, en hydratiserad proteinfilm bildad på baksidan av SiN membranet. Avjoniserat (DI) vatten användes för att skölja bort kanalen efter protein introduktion. Uppgifterna samlades in från hydratiserade fibronektin proteinmolekyler i SALVI mikro med dynamisk ToF-SIMS. DI vatten studerades också som en kontroll för att jämföra med resultat från hydrerad fibronektin tunn film. Tydliga skillnader observerades mellan den hydratiserade proteinfilmen och DI vatten. Detta arbete visar att protein adsorption på ytan i vätskemiljön kan studeras med hjälp av nya SALVI och flytande ToF-SIMS strategi. Video protokollet är avsett att ge teknisk vägledning för personer som är intresseradeatt utnyttja denna nya analysverktyg för olika tillämpningar av SALVI med ToF-SIMS och minska onödiga misstag i vätskehantering samt ToF-SIMS datainsamling och analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Rengöring och sterilisering av den SALVI Microchannel

  1. Sterilisering av mikrokanal, i SALVI
    1. Rita 2 ml 70% etanol vattenlösning i en spruta, anslut sprutan med inloppsänden av SALVI, och långsamt injicera 1 ml av vätskan i 10 min. Ta bort sprutan vid slutet av injektionen. Därefter ansluter inlopp och utlopp SALVI med hjälp av en polyetereterketon (PEEK) union. Alternativt kan du använda en sprutpump för att utföra samma procedur. Till exempel ställa in flödeshastigheten på 100 l / min.
    2. Hålla SALVI mikrokanal fylld med 70% etanollösning vid rumstemperatur under 4 h.
  2. Presentera Avjoniserat (DI) vatten i SALVI
    1. Rita 2 ml steriliserat avjoniserat vatten i en spruta, anslut sprutan med inlopp SALVI, och långsamt injicera 1 ml av vätskan i 10 min. Avlägsna sprutan och anslut inlopp och utlopp SALVI med hjälp av en PEEK union. Alternativt kan du använda en sprutpump som nämns isteg 1.1.1.

2. Immobilisering av Protein Film i SALVI

  1. Immobilisera Protein Film i SALVI
    1. Rita 2 ml fibronektin (10 mikrogram / ml i fosfatbuffrad saltlösning, PBS) lösning i en spruta, anslut sprutan med inlopp SALVI långsamt injicera en ml av vätskan i 10 minuter, ta bort sprutan och anslut inloppet och utlopp SALVI med hjälp av en PEEK union.
    2. Inkubera SALVI fylld med fibronektinlösningen i en ren odlingsskål, hålla skålen i huven vid rumstemperatur under 12 h.
    3. Rita 2 ml steriliserat avjoniserat vatten i en spruta och koppla sprutan med inlopp SALVI. Långsamt injicera 1 ml vatten i 10 minuter, ta bort sprutan och anslut inlopp och utlopp SALVI.
      Obs: Om utrustad med en ljusmikroskop, kontrollera SALVI under mikroskop för att se till att SiN membranet är intakt innan ToF-SIMS analys. Nu SALVI enheten är klar för ToF-SIMS enALYS.

3. Installera SALVI i TOF-SIMS lastslusskammaren

Obs: Handskar ska användas vid alla tillfällen när du hanterar SALVI enheten och installera den på ToF-SIMS skede för att undvika eventuella föroreningar under ytan analys.

  1. Mount SALVI till scenen
    1. Lägg TOF-SIMS steget på en plan och ren yta. Sätt SALVI enheten på scenen med kiselskivan och SiN membran uppåt. Fäst SALVI med fyra metallklämstycken och skruva metallbitar håller hörnet på enheten i metallplattan med fyra skruvar.
    2. Rulla försiktigt upp PFTE slang som är ansluten till mikroflödessystem kanal. Använd fyra metallbitar och fyra skruvar för att hålla den styva delen nedåt. Se till att enheten är placerad i det öppna utrymmet på SIMS skede så att den inte stör med den primära jonstrålen under analysen. Ytterligare bild och illustration av SALVI fabricatjon och installation finns i tidigare publikationer. 8,9,11
  2. Montera Faraday Cup på scenen
    1. Fäst Faraday cup på scenen med en skruv.
  3. Ladda scenen i TOF-SIMS lastslusskammaren
    1. Öppna ToF-SIMS lastsluss, hålla och lagt grunden vågrätt på flaket, och stäng lastslussdörr.

4. ToF-SIMS Data Acquisition

  1. Slå på vakuumpumpen och säkerställa lämplig vakuum (t ex i storleksordningen 10 -6 mbar eller torr) uppnås i lastslusskammaren.
  2. Flytta SALVI in i huvudkammaren när vakuumet stabiliseras efter ca 30 min.
    Obs: Vakuumet bör vara lägre än 5 x 10 -6 mbar vakuum i huvudkammaren under datainsamling. Annars är högre vakuum indikerar en läcka i SALVI systemet.
  3. Justera primära jonstrålen och analysator av ToF-SIMS med enspatial upplösning av ca 400 nm i enlighet med tillverkarens rekommendationer. Strömmen av primär stråle är 1200 pA medan cykeltiden är 30 ps inom DC-läge.
    Obs: Denna process följer i stort tillverkarens rekommendationer.
  4. Hitta mikroflödes kanal med optiskt mikroskop. Använd den optiska bildcentrum som referens och anpassa den för att stämma överens med den sekundära ion bildens centrum.
  5. Före varje mätning, använd en 1 keV O 2 + balk (~ 40 nA) för att skanna på SiN fönster med en 500 x 500 pm 2 område för ~ 15 sekunder för att avlägsna ytkontaminering. Också använda en elektron översvämning pistol för att kompensera yta laddning under alla mätningar. Använd den automatiska funktionen av vapnet översvämning i standardläget för detta steg.
  6. Välj positiv eller negativ läge innan datainsamling. Använd 25 keV Bi 3 + balk som primär jonstrålen i alla mätningar.
    Obs: Stegen är liknande feller positiva och negativa uppgifter förvärv. För intresse av utrymme, är det positiva läget beskrivs i detalj här.
    1. djupprofilering
      1. Skanna Bi 3 + balk på en runda med en diameter på ~ 2 um med 32 pixlar med 32 pixlar.
      2. För att minimera den tid som krävs för att slå igenom på SiN membranet, använd en lång pulsbredd (dvs 180 ns, strålströmmen ~ 1,0 Pa vid en cykeltid av 100 ^ sek) Bi 3 + balk. Intensiteterna sekundära joner representant från ökningen vätskeytan när punch-through nås. Stansen-through varierar från 300 sek till 500 sek, beroende på sats SiN membranet.
        Obs: Denna skillnad verkar vara relaterade till parti SiN membran förvärvade enligt vår erfarenhet. Däremot stansen-genom tiden inte riktigt påverka dataanalys.
      3. Efter SiN membranet punch-through, hålla samma ström i ungefär 200 sekunder tillerhålla tillräckliga data för 2D-bild rekonstruktioner.
      4. Minska pulsbredd till 80 ns för datainsamling att förvärva spektra med bättre massupplösning. Fortsätt med detta förvärv för ungefär ytterligare 200 sek. Spektrumdata som visas i figur 1 erhålles från denna region.
    2. 2D Imaging och Masspektra
      1. Samla 2D och spektra uppgifter mass samtidigt vid mätning av djupprofildata. TOF-SIMS instrument sparar all information om varje plats under experimentet. Data visas i olika fönster (FPanel - Spectra, FPanel - Profiler och FPanel - bilderna separat) av den digitala styrprogramvaran. Kontrollera data i varje panel omdömesgillt under datainsamling.

5. ToF-SIMS Data Analysis

Obs: Dataanalys initialt utförs med hjälp av IonToF ToF-SIMS avgörande programvara.

  1. Öppna enALYS programvara SIMS (Measurement Explorer) och klicka sedan på "profiler", "spektra" och "image" knappar, respektive, för att bearbeta djupprofil, m / z spektrum, och bilddata.
  2. Öppna datafiler som har tillägget ".ita".
  3. Välj toppar av intresse, skriver artens namn i "jon" rutan, och märka dem med olika färger i spektrat. Använd musens hjul för att dra längs x-axeln. Använd Ctrl och rullningshjulet för att justera topphöjder och bredder. Bokstaven "L" växlar mellan linjära och logg lägen längs y-axeln.
  4. Genomför rekonstruktion data innan masskalibrering. Annars är det svårt att välja avståndet mellan topparna i massan steget kalibrering.
    1. Välj de djupprofilering data av intresse och rekonstruera spektra enligt djupet profil tidsserie.
    2. Klicka på knappen återuppbyggnad. I "Start Reconstruction" fönster, skriv in ett sökområde av interest. Klicka på "OK" för att rekonstruera djupprofildata.
  5. Utför en massa kalibrering. Tryck på "F3" för att öppna "mass kalibrering" fönstret. Välj toppar för kalibrering baserad på den specifika provet. 21 I detta arbete genom att använda följande toppar CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) och H 13 O 6 + (m / z 109) för den positiva läge. Använda följande toppar CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), och C 4 H - (m / z 49) för det negativa sättet.
    1. Välj en topp,se till att den nedåtgående pil riktad mot toppen i nedre vänstra hörnet av fönstret. Klicka på den topp och skriv toppnamnet i "mass kalibrering" fönstret, klicka på "Lägg till", och jonen av intresse ingår i masskalibrering.
    2. Slutligen, klicka på "Kalibrera" -knappen. Kontrollera om områdena topparna är på rätt plats beroende på deras massa och laddning förhållanden. I menyn "Spectrum", välja och klicka på "Apply Mass Calibration" till "All Spectra" eller "Valda spektra", beroende på den specifika analysen genomförs.
  6. Som topp val är nödvändigt för provanalys, fastställa karakteristiska topparna i provet i enlighet med litteratur eller andra tidigare fynd. Jämföra intensiteten av topparna av intresse i m / z-spektra. Om det är nödvändigt, lägga till nya toppar eller ta bort onödiga toppar i topp listan.
    1. Lägga toppar. Klicka på en topp, hitta de röda linjerna på nedre vänstra fönstret. hold "Ctrl" -tangenten, bläddra musen horisontellt för att definiera toppbredd, vilket ger en topp till topp listan automatiskt. Ett annat sätt att lägga till en topp är att välja en topp i huvudfönstret spektrum, och sedan klicka på knappen "Lägg peak" ovanför fönstret. Om det finns många toppar att lägga till, i menyn "Spectrum", välj "Sök toppar", kontrollera relaterade specifikationer i det nyöppnade fönstret, sedan lägga toppar efter behov.
    2. Att exportera en topp lista, i menyn "Peak Lista", välj "Spara ..." topplistan i "itmil" format. Använd Ctrl och vänster musknapp för att dra längs spektrumet. I spektra fönstret väljer en topp av intresse och dra de två streckade linjerna till önskvärda positioner.
    3. Om du vill importera en topp lista, i menyn "Mass intervall List", välj "Import ...", lokalisera en befintlig topp listfil med filändelsen ".ITPL". Klicka på "Öppna".
    4. Om du vill använda en "itmil" peak lista, imenyn "Mass Intervall List", klicka på "Öppna ...", hitta filen, klicka sedan på "Öppna".
  7. Applicera en topp lista för att ytterligare analysera data. Till vänster botten av "Spectra" fönster, det finns ett fönster som heter "Mass Intervall List". Listan importerade topp visas upp här.
    1. Högerklicka på topp listan fil som ska användas, tillämpa den på den "aktiva spektrum" eller "alla spektra".
  8. Se dataprofilerna. I "profil" fönstret, använd bokstaven "M" passa fönster (komplett utbud) och bokstaven "N" för att passa till y-axeln. Använd Ctrl och rulla hjulet för att justera profilbredd. Eller använd "/" och "*" på tangentbordet för att ändra y-axeln sortiment och höjd.
  9. Exportera data för vidare rita med hjälp av andra grafiska program efter den första analysen.
    1. Om du vill exportera en djupprofil, i "profil" fönstret, klicka på menyn "Arkiv", välj sedan "Export & #34 ;, och välj sedan "Spara som" a ".txt" fil.
    2. För att exportera en m / z spektrum fil i "Spectra" fönstret, klicka på menyn "Arkiv", välj sedan "Export", och välj sedan "Spara som" a ".txt" fil.
    3. För att exportera en bildfil i "Bild" fönster, print screen och spara som bildfil.

6. ToF-SIMS Data Rita och presentation

Obs: Använd ett grafiskt verktyg för att plotta data efter SIMS uppgifter behandlas med hjälp av den instrumentala programvara.

  1. Använd ett grafiskt verktyg för att importera data.
  2. Göra en kurva med användning av m / z som x-axeln och toppintensitet som y-axeln för att visa den rekonstruerade spektrumet. Ett exempel ges i figur 1.
  3. Göra en kurva med användning av sputter tidpunkt som x-axeln och toppintensitet som y-axeln för att visa den rekonstruerade djupprofilen temporal serien. Ett exempel ges i Figure 2.
  4. Kombinera rekonstruerade 2D-bilder av olika m / z och bildar en matris för att visa jon kartläggning. Ett exempel ges i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett par representativa resultat presenteras för att demonstrera fördelarna med det föreslagna protokollet. Genom att använda SALVI mikroflödes gränssnitt kan den primära jonstrålar (Bi 3 +) direkt bombardera på det hydratiserade fibronektin filmen i DI vatten. Sålunda kan framgångsrikt förvärvat den molekylära kemisk kartläggning av vätskeytan.

Figur 1a och 1b visar positiva ToF-SIMS-masspektra av den hydratiserade fibronektin film och DI vatten, respektive. Topparna av intresse även kluster vatten (dvs., m / z 19, 37, 55, 73, 91 och 109) och aminosyrafragment (dvs., m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, och 98) indikeras med de röda pilarna. I tillägg till de karakteristiska topparna för aminosyrafragment, som har varit allmänt rapporterats med användning av torra proteinprover, är topparna av vatten kluster observerades i denmasspektra av hydratiserad fibronektin film i DI-vatten. Dessutom intensiteterna hos dessa vattenkluster toppar är mycket olika de i masspektra för DI-vatten. Detta resultat ger direkta bevis för egenskapen av vattenmolekyler som omger och inuti de hydratiserade proteinmolekyler som spelar en roll i deras adsorption på en yta.

Figur 2a visar djupprofilen tidsserier av den hydratiserade fibronektin film och DI vatten. Då provet är under SiN membranet, intensiteterna för utvalda andra joner är försumbara innan SiN membranet stansas genom (dvs., 280 sek för fibronektin och 340 sek för DI vatten). När SiN membranet stansas genom, intensiteten hos dessa sekundära joner öka avsevärt. Vid användning av den långa pulsbredden, är den massupplösning relativt låg. Därför är den korta pulsbredden process som används för att få fram data med bättre massupplösningför bild- och spektrum rekonstruktioner Som visas i figur 2a. Efter en tidsperiod (dvs., 60 sek för fibronektin och 220 sek för DI-vatten), den reducerade pulsbredden används för att erhålla m / z spektra med bättre massupplösning. De slutliga m / z spektra rekonstruerades från 200 sek mätningar markerad i grönt skuggade områden i djupprofil tidsserie. Figur 2b visar 2D-bilder från den hydratiserade fibronektin film och DI vatten, som motsvarar den gröna skuggade området i figur 2a. Dessa 2D-bilder representerar räkningarna av utvalda sekundära joner från provet: den ljusare bilden, desto högre sekundär jon räkningen. Sådana intuitiva bilder ger en tydlig jämförelse av utvalda sekundära joner mellan olika prover, vilket är användbart i dataanalys. Enligt våra erfarenheter, skillnaden i SiN punch-through varierar från sats till sats av synd membran. Däremot påverkar det inte återtat av det dynamiska ToF-SIMS-analys.

Figur 1
Figur 1: Jämförelser av ToF-SIMS positiv spektra av den hydratiserade fibronektin filmen och DI-vatten i SALVI mikrokanalen (a) Den rekonstruerade m / z spektrum av fibronektin.. (B) DI vatten spektrum.

figur 2
Figur 2:. Djupprofiler och 2D-bilder av hydratiserad fibronektin och DI-vatten (a) djupprofilering tidsserie av fibronektin och DI-vatten i den positiva läge. (B) 2D-bilder rekonstrueras motsvarar den gröna skuggade 200 sek tidssegment längs djupprofil tidsserien i (a). Flera karakteristiska massa och laddning förhållanden av betydelse för vattenkluster(T.ex. m / z 1, 19, 37, 55) visas förutom kända aminosyrafragment (t.ex., m / z 30, 83, 98). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI är en mikroflödes gränssnitt som möjliggör dynamisk vätskeytan och gränssnittsanalys flytande och fast av vakuumbaserade styrmedel, såsom ToF-SIMS och svepelektronmikroskop (SEM). Tack vare användningen av små öppningar för att exponera vätskan direkt i vakuum, är SALVI lämplig för många fint fokuserade spektroskopi och avbildningstekniker utan några ändringar, 22 att överföra och mångsidighet mikrofluidik gör det en sann multimodal imaging plattform. Olika egenskaper och betydelsen av SALVI jämfört med andra befintliga tekniker sammanfattas i flera senaste omdömena. 22-25 Som utvecklare av SALVI teknik, har vår grupp aktivt tillämpa den på en mängd olika studier med dynamiska vätskeytor och vätske fast gränssnitt . Några exempel på nya tillämpningar innefattar däggdjurscellmembran, bakterier biofilm fastsättning, 15,16 eller nanopartikelbildning som ett resultat av vattenhaltiga yt-oxidationer. I denna paper presenterar vi de första flytande ToF-SIMS resultat av den hydratiserade protein tunn film adsorberat på SiN ytan.

Det är ganska viktigt att noggrant hantera de markerade steg i protokollet. Till exempel när dra vätska i sprutan i steg 1 och 2, se till att det inte finns några bubblor i injektionssprutan. Eftersom när bubblorna injiceras i SALVI, kan de orsaka läckage i vakuum. 9 alltså om några bubblor observeras, är det klokt att bli av med dem genom att sätta sprutan upprätt och försiktigt trycka ut bubblorna. Dessutom är det mycket viktigt att göra SiN fönster i SALVI platt för optimerad ToF-SIMS analys, som beskrivs i steg 3. Denna jämnhet av detektionsområdet direkt påverkar kvaliteten på uppgifterna enligt utformningen av ToF-SIMS. 26 Det är nödvändigt att visuellt inspektera enheten efter att säkra allt på SIMS scenen. Om SiN fönster inte är horisontellt, justera skruvarna och ändra höjdenav SALVI enheten för att säkerställa att allt är i samma plan så mycket som möjligt. Dessa känsliga punkter behöver erfarenhet och noggrannhet, som bestämmer framgången och tillförlitligheten hos hela experimentet.

Såsom visas i figur 1b, de toppar med m / z 19, 37, 55, 73, 91 och 109 har höga värden. Detta tyder på att det finns ett stort antal kluster vatten (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + och H 13 O 6 +) i den positiva sekundära joner. De andra kluster vatten (data visas ej) med högre m / z-värden har också relativt starka toppar jämfört med sina grann toppar. Dessa stora mängder vatten kluster avges från DI vattenytan efter SiN punch-through. Vatten kluster signaler i positiv läge har inte varit observerbar i föregående work; och detta tillskrevs den lågt antal sekundära joner och icke-optimerade ToF-SIMS förhållanden i det förflutna. 8 Med det pågående arbetet med att optimera de Salvi och ToF-SIMS förvärvs villkor såsom primära jonstrålar (dvs Bi + vs . Bi 3 +), pulsbredd och strömförhållanden under djupprofilering, är det nu möjligt att observera upp till 44 vattenkluster i den positiva läge med de villkor som presenteras i detta dokument. Resultat som visas här är lovande att ytterligare undersöka vattnets roll i dynamiken i olika biologiska molekyler och biologiska system.

Här som ett exempel för att illustrera fördelarna med SALVI och ToF-SIMS i att studera biologiska molekylär dynamik, var hydratiseringen av fibronektin protein presenteras. Topparna av m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 och 98 tillhör de aminosyrafragment enligt den föregående rapporten, 27,28 som är mycket starkare än DI water visas i Figur 1b. Denna skillnad i ökad intensitet av aminosyrafragment i fibronektin provet tyder på att dessa sekundära joner är faktiskt från proteinerna själva. Dessutom topparna av vatten kluster i figur 1a är mycket starkare än de av DI-vatten i Figur 1b, vilket innebär att egenskaperna hos vattenmolekyler i proteinadsorption ytan och gräns lösning skulle kunna vara mycket olika dem i rent vatten.

Figur 2a visar representativa djupprofilering temporal serie på två olika prover: fibronektin och DI-vatten i SALVI mikrokanalen. Profileringen uppgifter djup samlades som SiN fönstret att bombarderas av Bi 3 + primär jonstråle med lång pulsbredd. Som ses i figur 2a, är SiN fönster stansas genom på omkring 300 sek. Innan SiN fönster i SALVI stansas through, intensiteterna utvalda sekundära joner är ganska låg. När SiN fönster stansas genom, intensiteten hos de sekundära joner omedelbart öka vätskeytan börjar att bombarderas av den primära jonstrålen. Till exempel, intensiteten hos H + och H 3 O + visar en stor ökning, vilket indikerar observation av vattenytan. 8,9 Trots intensitet är instabila direkt efter punch-through eller vid gränsytan, kan de når relativt stabil värden efter en viss tid (t.ex. 60 sek för fibronektin och 220 sek för DI-vatten, respektive, i figur 2a). Skillnaden i det långa pulsbreddsborrning egentligen inte påverkar analysresultaten illustrerade här när rekonstruera m / z spektra (t.ex. figur 1), eftersom den effektiva m / z spektra förvärvas efter SiN punch-through. Dock kan en forskare väljer att använda samma villkor för alla prover for konsekvens och underlätta att välja datasektioner under dataanalys. I syfte att erhålla bättre massupplösning, var pulsbredden reduceras därefter och intensitet minskade i motsvarande mån i den senare delen av den djupprofilering experimentet. Djupet profil tidsserier kontinuerligt samlas in för ytterligare 200 sek för att ge gott om uppgifter för m / z spektralanalys. Segmenten tid som m / z spektra rekonstruerades markeras i grönt skuggade områden.

Fibronektin har använts i stor utsträckning för yta adsorption före cellodling; många studier har visat fibronektin är ansvarig för celladhesion och cell biomaterial interaktioner. 19,20,29 En ny studie som kännetecknas tjockleken på fibronektin adsorberat på poly (hydroxyletyl metakrylat) borstar med hjälp av ellipsometri. Fibronektin tunna filmen bestämdes vara 3-12 nm tjockt. 30 En sådan tjocklek är rimligt för djupprofilanalys i en vattenlösningartion. 8,9 Med utvecklingen av SALVI, är nu möjligt direkt analys av det hydratiserade proteinet adsorberat på den fasta ytan. Detta tillvägagångssätt potentiellt kan ha breda tillämpningar inom studierna av växelverkan mellan proteiner med fasta ytor dynamiskt.

Figur 2b visar de valda 2D-bilder av olika sekundära joner från fibronektin och DI vattenprover, respektive. 2D-bilder erhålls från djupprofilering tidsdata i grönt skuggade områden i figur 2a, som motsvarar vätskeytan efter SiN punch-through som beskrivits tidigare. Bilderna av valda aminosyrafragment sekundära joner CH 4 N +, C 5 H 7 O + och C 4 H 4 NO 2 + (dvs., m / z 30, 83 och 98) var för fibronektin tunna filmen mycket ljusare än de som för DI-vatten. Detta tyder på att aminosyrafragment sekundära joner observeras fROM fibronektin molekyler inre diameter öppning 2 pm. Vidare bilderna av valda toppar (t.ex., m / z 1, 19, 37, och 55) som motsvarar flera vatten kluster av fibronektin är anmärkningsvärt ljusare än de av DI-vatten. Detta resultat visar att hydratiseringen av fibronektin gör de vattenmolekyler som omger biomolekylen distinkt från vattenmolekylerna i DI-vatten.

Sammanfattningsvis har detta arbete ges slående bevis på proteinhydra inducerad vattenmolekyl fastighets förändringar. Sådana resultat kan ge en förbättrad grundläggande förståelse för struktur, konforma och biologisk aktivitet av proteiner adsorberas på en fast yta i flytande mikromiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>In Situ</em> karakterisering av Hydratiserade proteiner i vatten av Salvi och ToF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter