Summary
Bu işlem, bir sulu çözelti içinde, protein biyomoleküllerin yerinde time-of-flight sekonder iyon kitle spektrometrisi analizi için bir mikrokanal sıvı kullanım ve numune girişi için bir protokol sunulur.
Abstract
Bu çalışma Sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) ve (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi de Analiz Sistemi kullanılarak sulu çözeltide protein biyomoleküllerin yerinde karakterizasyonu göstermektedir. fibronektin, protein filmi SALVI algılama alanı oluşturan silisyum nitrür (SİN) zar üzerinde hareketsizleştirildi. TOF-SIMS analizi sırasında, analizin üç modu, yüksek uzaysal çözünürlüğü kütle spektrometresi, iki boyutlu (2D) görüntüleme ve derinlik profilleme dahil yapılmıştır. Kütle spektrumları pozitif ve negatif modda hem de elde edildi. Deiyonize su, bir referans örnek olarak analiz edildi. Bizim sonuçları suda fibronektin filmi tek başına suya göre daha belirgin ve güçlü su küme zirveleri olduğunu göstermektedir. amino asit parçalarının karakteristik zirveleri de sulandırılmış protein TOF-SIMS spektrumları içinde gözlemlenebilir. Bu sonuçlar, bir yüzey üzerine bir protein molekülünün adsorpsiyon Dynamica incelenebilir olduğunu göstermektedirLly ilk kez sıvı ortamda Salvi ve TOF-SIMS kullanarak.
Introduction
Hidrasyon yapısı, 1 konformasyon, 2 ve proteinlerinin biyolojik aktivitesi 3 için çok önemlidir. onları çevreleyen su molekülleri olmaksızın Proteinler canlı biyolojik aktiviteleri olmazdı. Özellikle, su molekülleri yüzey ve proteinlerin iç yapısı ile etkileşim ve proteinlerin farklı hidrasyon durumları farklı tür etkileşimleri yapmak. 4 katı yüzeyler ile proteinlerin etkileşim nanoteknoloji, biyomalzeme ve doku mühendisliği süreçlerinde etkileri olan temel bir olgudur. Çalışmalar, uzun bir protein, bir yüzey ile karşılaştığında olarak yapısal değişiklikler meydana gelebilir göstermiştir. TOF-SIMS protein katı arayüzü çalışma potansiyeline sahip teknik olarak tasavvur edilmiştir. 5-7 Potansiyel kendi yapısının mekanizmasının temel bir anlayış sağlar katı yüzeyler, proteinlerin hidrasyon anlamak önemlidir, konformasyon ve biyolojikark aktivitesi.
Bununla birlikte, ana yüzey analitik teknikler çoğunlukla vakum tabanlıdır ve uçucu sıvı çalışmalar için doğrudan uygulamalar bağlı vakum ortamında uçucu sıvı hızlı buharlaştırma zordur. Biz sıvı yüzeyler ve sıvı-katı etkileşimleri (TOF-SIMS) zaman-of-flight ikincil iyon kütle spektrometresi kullanarak doğrudan gözlemler sağlamak için, sıvı Vakum Arabirimi (SALVI) at Analiz, uyumlu mikroakışkan arayüz Sistemi bir vakum geliştirdi. 8- 2) yüzey gerilimi, diyafram içinde sıvı tutmak için kullanılan 1) tespit penceresi sıvı yüzeyinin doğrudan görüntüleyebilen ve çapı 2-3 mikron bir açıklık ve 3) SALVI: 11 benzersiz özellikleri aşağıdakileri içerir birden fazla analitik platformlar arasında taşınabilir. 11,12
SALVI algılama alanı ve polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikrokanal bir silisyum nitrür (SİN) membran oluşur. Bu Fabr olduğunuTemiz oda gili ve imalat ve temel tasarım faktörleri önceki gazetelerde ve patent ayrıntılı edilmiştir. 8-12 analitik bir araç olarak TOF-SIMS uygulamaları bazı sulu çözeltilerde ve karmaşık sıvı karışımlarının, kullanarak çeşitli gösterildi hangi nanopartiküller içeriyordu. 13-17 Özellikle, SALVI sıvı TOF-SIMS yerinde yoğunlaştırılmış aşamasında yeni fırsatlar açarak, canlı biyolojik sistemlerin (yani, biyofilm), tek hücreler ve katı-elektrolit arayüzünün sıvı-katı arayüzü sondalama dinamik veriyor TOF-SIMS kullanarak sıvılar dahil çalışmalar. Bununla birlikte, mevcut tasarım henüz gaz-sıvı etkileşimleri izin vermez. Bu gelecekteki gelişimi için bir yönüdür. SALVI ilk kez bu çalışmada hidratlanmış bir protein filmi incelemek için kullanılmıştır.
Fibronektin iki hemen hemen aynı disülfid bağları bir çift bağlı monomerler, 18 oluşan bir yaygın olarak kullanılan protein dimeri olan Ihücreleri bağlanma yeteneği için iyi bilinmektedir. Bu bir model sistem olarak seçildi 19,20 hidratlanmış bir protein filmi dinamik SALVI sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanılarak sondalanabilir ki göstermek için. Protein çözeltisi, mikrokanal sokuldu. 12 saat inkübe edildikten sonra, bir hidratlı bir protein filmi SıN membran arka tarafında oluşturulmuş. Deiyonize (DI) su, protein girmesinden sonra kanal durulayın kullanıldı. Bilgi dinamik TOF-SIMS kullanarak SALVI mikrokanalda hidratlı fibronektin protein molekülleri toplanmıştır. DI su da hidrate fibronektin ince film elde edilen sonuçlarla karşılaştırmak için bir kontrol olarak çalışıldı. Belirgin farklılıklar sulandırılmış protein film ve DI su arasında gözlendi. Bu çalışma, sıvı ortamda yüzeyde protein adsorpsiyon roman salvi ve sıvı TOF-SIMS yaklaşımı kullanarak okudu edilebileceğini göstermektedir. video protokol ilgilenen kişiler için teknik rehberlik sağlamak için tasarlanmıştırTOF-SIMS ile Salvi farklı uygulamalar için bu yeni analitik aracı kullanan ve TOF-SIMS veri toplama ve analiz yanı sıra sıvı taşıma gereksiz hatalar azaltmak içinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
SALVI Mikrokanallı 1. Temizlik ve Sterilizasyon
- Salvi mikrokanal Sterilizasyonu
- , Bir şırınga içine% 70 etanol sulu çözeltisi 2 ml çizin salvi giriş ucuna sahip bir şırınga bağlayın ve yavaş yavaş 10 dakika içinde sıvının 1 ml enjekte edilir. enjeksiyon sonunda şırıngayı çıkarın. Sonra, bir polietereterketon (PEEK) birliği ile Salvi girişini ve çıkışını bağlayın. Alternatif olarak, aynı prosedürü gerçekleştirmek için bir şırınga pompası kullanın. Örneğin, 100 ul / dakika akış hızını ayarlamak.
- 4 saat oda sıcaklığında% 70 etanol çözeltisi ile dolu SALVI mikrokanalı tutun.
- Salvi içine Deiyonize (DI) Su tanıtmak
- , Bir şırınga içine sterilize DI su 2 ml çizin Salvi girişi ile şırınga bağlayın ve yavaşça 10 dakika içinde sıvı 1 ml enjekte edilir. şırıngayı çıkarın ve bir PEEK birliği ile Salvi girişini ve çıkışını bağlayın. belirtildiği gibi Alternatif olarak, bir şırınga pompası kullanımıadım 1.1.1.
Salvi Protein Film 2. İmmobilizasyonu
- Salvi Protein Film Immobilize
- bir şırınga içine (fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ug / ml, PBS) çözeltisi fibronektinin 2 ml çizme, yavaş yavaş 10 dakika içinde sıvının 1 ml enjekte edilir, Salvi girişi ile şırınga bağlayın şırınga kaldırmak, ve giriş bağlantı ve Salvi çıkışı bir PEEK birliği ile.
- Temiz bir kültür kabı içinde fibronektin çözeltisi ile doldurulmuş salvi inkübe 12 saat oda sıcaklığında kaputu çanak tutmak.
- bir şırınga içine sterilize DI su 2 ml çizin ve Salvi girişi ile şırınga bağlayın. Yavaşça, 10 dakika su 1 ml enjekte şırınga kaldırmak ve Salvi girişini ve çıkışını bağlayın.
Not: Bir ışık mikroskobu ile donatılmış ise, SİN membran TOF-SIMS analizden önce sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında Salvi kontrol edin. Şimdi SALVI cihaz hazır ToF-SIMS biralysis.
3. TOF-SIMS Loadlock Odası içine Salvi yükleyin
Not: SALVI kotarma ve yüzey analizi sırasında olası kirlilikleri önlemek için TOF-SIMS sahneye takarken Eldiven her zaman giyilmelidir.
- Sahne üzerine Dağı SALVI
- düz ve temiz bir zemine TOF-SIMS sahne yatırın. silikon gofret ve SiN zar yukarı bakacak şekilde sahneye SALVI cihazı koymak. dört metal sıkma parçaları kullanarak Salvi Fix ve dört vida ile metal plakanın içine cihazın köşe tutan metal parçalar vida.
- Yavaşça mikroakışkan kanala bağlı PFTE boruyu döndürün. sert bir bölümünü basılı tutun dört metal parçalar ve dört vidayı kullanın. bu analiz sırasında birincil iyon ışını ile karışmaz, böylece cihazın SIMS sahnede açık alanda yerleştirildiğinden emin olun. Ek resim ve SALVI fabricat ve illüstrasyoniyon ve kurulum önceki yayınlarda mevcuttur. 8,9,11
- Sahne Alanı'na Faraday Kupası monte edin
- bir vida ile sahnede Faraday fincan sabitleyin.
- içine Stage yükleyin ToF-SIMS Loadlock Odası
- , TOF-SIMS loadlock açın tutun ve yükleme platformu üzerine yatay olarak sahne ve loadlock kapağını kapatın.
4. TOF-SIMS Veri Toplama
- (10 -6 mbar veya Torr emriyle, örneğin) Vakum pompası açın ve uygun vakum sağlamak loadlock odasına ulaşılır.
- Vakum 30 dakika sonra kararlı bir kez ana hazneye salvi taşıyın.
Not: Vakum veri toplama sırasında ana odasında daha düşük 5 x 10 -6 mbar vakum olmalıdır. Aksi takdirde, daha yüksek vakum SALVI sisteminde bir sızıntı göstergesidir. - Bir ile TOF-SIMS birincil iyon ışını ve analizörü ayarlamaüretici tavsiyelerine göre, yaklaşık 400 nm uzaysal çözünürlüğü. çevrim süresi DC modunda 30 mikro-sn iken primer ışın akımı 1200 pA olduğunu.
Not: Bu işlem, büyük ölçüde üreticinin tavsiyelerini takip ediyor. - optik mikroskop kullanarak mikroakışkan kanal bulun. bir referans olarak optik görüntü merkezini kullanabilir ve ikincil iyon görüntü merkezi ile tutarlı olacak şekilde hizalayın.
- Her ölçümden önce, yüzey kontaminasyonu gidermek için ~ için 500 x 500 mm 2 alana sahip SiN penceresinde 15 sn taramak için 1 KeV O 2 + ışını (~ 40 nA) kullanın. Ayrıca, tüm ölçümler sırasında yüzey şarj telafi etmek için bir elektron taşkın tabancası kullanın. Bu adım için varsayılan modda sel silahın otomatik işlevini kullanın.
- veri toplama önce pozitif veya negatif modunu seçin. Tüm ölçümlerde birincil iyon ışını olarak 25 keV Bi 3 + ışını kullanın.
Not: adımlar benzer f vardırya da pozitif ve negatif veri satın almalar. alanı ilgi için, pozitif mod burada ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.- Derinlik Profil
- 32 piksel çözünürlükte 32 piksel ~ 2 mikron çapında yuvarlak bir alanda Bi 3 + ışını tarayın.
- Punch-aracılığıyla SiN membranı gereken süreyi en aza indirmek için, uzun bir darbe genişliği kullanımı (yani, 180 NSEC, 100 mikro saniye olduğu bir döngü sırasında demet akımı ~ 1,0 pA) Bi 3 + kiriş. sıvı yüzey artış ikincil iyonlar temsilcisi şiddetleri yumruk-through ulaşıldığında. yumruk-through zaman SiN membran toplu bağlı olarak 300 sn 500 sn arasında değişir.
Not: Bu fark bizim deneyimine göre edinilen SiN membranların toplu ilişkili görünmektedir. Ancak, yumruk-through zaman gerçekten veri analizi etkilemez. - SİN membranı sonra-through yumruk yaklaşık 200 saniye boyunca aynı akım tutmak2D görüntü rekonstrüksiyon için yeterli veri elde.
- Daha iyi kitle çözünürlük ile spektrumları elde etmek veri toplama 80 nsaniye için darbe genişliğini azaltır. hakkında başka bir 200 saniye bu satın devam edin. Şekil 1 'de gösterilen spektrum verileri bu bölgeden elde edilir.
- 2D Görüntüleme ve Kütle Spektrumu
- Derinlik profil verilerini ölçerken aynı anda 2D görüntüleme ve kütle spektrumları verilerini toplamak. TOF-SIMS enstrüman deney sırasında her yerinde bütün bilgileri kaydeder. (- Spectra, FPanel - Profiller ve FPanel - ayrı Görüntüler FPanel) dijital kontrol yazılımı veri farklı pencerelerde gösterilir. mantıklı veri toplama sırasında her panelde verileri kontrol edin.
- Derinlik Profil
5. TOF-SIMS Veri Analizi
Not: Veri analizi ilk IonToF TOF-SIMS enstrümantal yazılımını kullanarak gerçekleştirilmektedir.
- Açık birDaha sonra SIMS (Ölçme Explorer) ve alysis yazılım derinliği profili, m / z spektrumu ve görüntü verilerini işlemek için sırasıyla, "profilleri ',' spektrumları 've' imaj 'düğmelerini tıklatın.
- uzantısı ".ita" sahip veri dosyalarını açın.
- Ilgi doruklarına Seç "iyon" kutusuna tür adını yazın ve spektrumları farklı renkleri ile etiketlemek. x ekseni boyunca sürüklemek için farenin kaydırma tekerleğini kullanın. pik yükseklikleri ve genişlikleri ayarlamak için Ctrl ve kaydırma tekerleğini kullanın. y-ekseni boyunca doğrusal ve Log modları arasında mektup "L" geçer.
- Kitle kalibrasyon önce veri yeniden yürütün. Aksi takdirde, bu kütle kalibrasyon aşamasında tepeler arasındaki aralığı tercih zordur.
- ilgi derinliği profil verilerini seçin ve derinlik profili zamansal seriye göre spektrumları yeniden.
- rekonstrüksiyon düğmesini tıklayın. int bir tarama aralığı "Başlat Yeniden" penceresinde,erest. Derinlik profili verilerini yeniden "Tamam" a tıklayın.
- Bir kitle kalibrasyonu gerçekleştirin. Basın "F3" "kitle kalibrasyon" penceresini açmak için. Belirli bir örneğe dayalı olarak kalibrasyonu için tepe seçin. 21, bu çalışmada, aşağıdaki tepe noktalarını kullanmak CH3 + (m / z 15) H, 3 O + (m / z 19), C2-H 5 + (m / z 29 ) H, 5 O 2 + (m / z 37), C3, H 7 + (m / z 43) H, 7 O 3 + (m / z 55) H, 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) ve pozitif mod için 13 konumundaki H atomu O 6 + (m / z 109). Aşağıdaki zirveler CH kullanın - (m / z 13), O - (m / z 16) OH, - (m / z 17), C2-H - (m / z 25), C3 H - (m / z 37) ve Cı 4H - (m / z 49), negatif mod.
- Bir tepe seçinaşağı ok penceresinin sol alt köşesindeki zirvesinde işaret olduğundan emin olun. O zirveyi tıklayın ve "kitle kalibrasyon" penceresinde zirve adını yazın, "Ekle" yi tıklayın ve ilgi iyon kütle kalibrasyonu dahildir.
- Son olarak, "yeniden kalibre" butonuna tıklayın. piklerin alanları oranlarını şarj etme kütlesine göre doğru yerlere olup olmadığını kontrol edin. "Spectrum" menüsünde, seçmek ve yürütülen belirli analizlere göre "Uygula Mass Kalibrasyon" "Tüm Spectra" veya "Seçilmiş spektrumları", tıklayın.
- tepe değer seçme örnek analiz için gerekli olan gibi, literatürde diğer önceki bulgulara göre, numunenin karakteristik tepeler belirler. m / z spektrumlarında ilgili maksimum yoğunluğu karşılaştır. Gerekirse, zirve listesinde gereksiz zirveleri yeni zirveleri eklemek ya da silmek.
- tepe ekleyin. Bir tepe üzerine tıklayın sol alt pencerede kırmızı çizgileri bulmak. Hold "Ctrl" tuşuna, otomatik zirve listesine bir pik ekler tepe genişliği tanımlamak için yatay fareyi kaydırın. zirveye eklemek için başka bir yolu penceresinin üstündeki "zirve ekle" düğmesine tıklayın sonra ana spektrum penceresinde bir tepe seçin ve etmektir. Yeni açılan pencerede ilgili özelliklere, "Spectrum" menüsünde, eklemek "arama doruklarına" seçeneğini kontrol etmek için pek çok zirveler varsa gerektiği gibi, daha sonra doruklarına ekleyin.
- "Tepe List" menüsündeki, bir tepe listesini vermek, seçmek "itmil" biçiminde tepe listesi "Kaydet ...". spektrum boyunca sürüklemek için Ctrl ve sol düğmesini kullanın. spektrumları penceresinde, ilgi bir tepe seçmek ve arzu edilen pozisyonlara iki kesik çizgileri sürükleyin.
- Bir tepe listesini almak için, "Kitle aralığı List" menüsündeki, "İthalat ...", dosya uzantısı ".ITPL" ile varolan zirve listesi dosyasını bulun seçin. "Aç" ı tıklayın.
- olarak, bir "itmil" zirve listesini kullanmak için"Kitle Aralığı Listesi" menüsünden "Aç ..." seçeneğini tıklayın, dosyayı bulmak, ardından "Aç" a tıklayın.
- daha fazla veri analiz etmek için bir zirve listesi uygulayın. "Spectra" penceresinin sol-alt kısmında, "Kitle Aralığı Listesi" adı verilen bir pencere vardır. ithal pik listesi burada gösterilir.
- , Kullanılacak zirve listesi dosyasını sağ tıklatın "aktif spektrumunun" veya "tüm spektrumları" uygulamak.
- Veri profillerini görüntülemek. "Profil" penceresinde, kullan "M" harfi y eksenine uyacak şekilde pencereye (dizi) ve harfi "N" ile sığdırmak için. Ctrl kullanın ve profil genişliğini ayarlamak için kaydırma tekerleği. Veya y ekseni aralığını ve yüksekliğini değiştirmek için anahtar gemide "*" "/" kullanın ve.
- ayrıca ilk analizden sonra diğer grafik yazılımı kullanarak komplo için İhracat verileri.
- "Dosya" menüsünden tıklayın "Profil" penceresinde, bir derinlik profili vermek için, daha sonra "Export & # seçin34 ;, seçin ve sonra bir ".txt" dosyası "Farklı kaydet".
- "Spectra" penceresinde, bir m / z spektrum dosyasını dışa "Dosya" menüsünden tıklayın, ardından "Gönder" i seçin ve ardından ".txt" dosyası "olarak kaydet" seçeneğini seçin.
- "Görüntü" penceresi, baskı ekranında, bir görüntü dosyasını dışa ve görüntü dosyası olarak kaydedin.
6. TOF-SIMS Veri çiziliyor ve Tanıtım
Not: SIMS veriler enstrümantal yazılımı kullanılarak işlenir sonra verileri çizmek için bir grafik aracı kullanın.
- veri almak için bir grafik aracı kullanın.
- yeniden dağılım gösterir y ekseni olarak, x-ekseni ve pik yoğunluğu, m / z kullanarak bir arsa sağlayın. Bir örnek, Şekil 1 'de verilmiştir.
- yeniden derinlik profili zamansal dizi göstermek için y ekseni olarak x-ekseni ve tepe yoğunluğu olarak püskürtme zamanı kullanarak bir komplo yapın. Bir örnek figu verilmiştir2 yeniden.
- Farklı m / z yeniden 2D birleştirir ve iyon eşleştirme göstermek için bir matris oluşturur. Bir örnek, Şekil 2'de verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek sonuçlar bir çift önerilen protokolün avantajlarını göstermek için sunulmaktadır. SALVI mikroakışkan arabirimini kullanarak, birincil iyon ışını (Bi 3 +) doğrudan DI su hidratlı fibronektin film üzerinde bombardımanına. Böylece sıvı yüzeyinin moleküler kimyasal haritalama başarıyla elde edilebilir.
Şekil 1a ve sırasıyla hidratlı fibronektin film ve DI su pozitif TOF-SIMS kütle spektrumları göstermek 1b. Su kümeleri de dahil olmak üzere ilgili maksimum (yani, m / z 19, 37, 55, 73, 91 ve 109) ve amino asit fragmanları (örneğin, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, ve 98) kırmızı oklarla gösterilmiştir. yaygın olarak kuru proteinin numuneleri kullanılarak rapor edilmiştir, amino asit parçalarının karakteristik zirveleri, ek olarak, su kümeleri tepe gözlenmektedirDI su içinde hidre fibronektin film kütle spektrumları. Ayrıca, bu su küme tepe noktalarının yoğunlukları ve Dİ su kütle spektrumları bu çok farklıdır. Bu sonuç, çevredeki su moleküllerinin özelliği ve bir yüzey üzerindeki adsorpsiyon rol oynayan hidratlanmış protein molekülleri içinde doğrudan bir kanıt sağlar.
Şekil 2a hidrate fibronektin film ve DI su derinliği profili zaman serisi gösterir. Örnek SİN membranı altında olduğu SiN zar aracılığıyla yumruk önce, seçilen ikinci iyon yoğunlukları önemsizdir (yani fibronektin için 280 sn ve DI su için 340 sn). SİN zar aracılığıyla delikli sonra, bu ikincil iyonların yoğunlukları önemli ölçüde artar. Uzun atım genişliği kullanırken, kütle çözünürlüğü nispeten düşüktür. Bu nedenle, kısa darbe genişliği süreci daha kitlesel çözünürlükte veriler elde etmek için kullanılırGörüntü ve spektrum rekonstrüksiyon için Şekil 2a vurguladı. Bir süre sonra (örneğin, fibronektin 60 sn ve DI suyla 220 sn), düşük darbe genişliği daha toplu çözünürlükte m / z spektrumları elde etmek için kullanılır. Nihai m / z spektrumları derinlik profili zamansal seride yeşil gölgeli alanlar vurgulanır. Şekil 2b Şekil 2a yeşil gölgeli alanda uygun hidratlı fibronektin film ve DI su, 2D görüntüleri gösterir 200 sn ölçümlerinden yeniden inşa edildi. Bu 2D görüntüleri örnekten seçilen ikincil iyonların sayısını temsil: ikincil iyon sayısı yüksek, görüntü daha parlak. Böyle sezgisel görüntüleri veri analizinde yardımcı olur, farklı örnekler arasında seçilen ikincil iyonların net bir karşılaştırma vermek. Bizim tecrübelerimize göre, SİN yumruk-through zaman farkı partiden SiN membran toplu değişir. Bununla birlikte, bu yeniden etkilemezDinamik TOF-SIMS analizi neticeleri.
Şekil 1: SALVI mikrokanal içinde hidre fibronektin film ve Dİ su TOF-SIMS pozitif spektrumları karşılaştırılması fibronektin (a) yeniden m / z spektrumu.. (B) DI su spektrumu.
Şekil 2:. Derinlik profilleri ve sulandırılmış fibronektin ve DI su 2D görüntüleri (a) pozitif modda fibronektin ve DI su derinliği profilleme zaman serisi. (B) 2D görüntüleri yeşil tekabül yeniden derinlik profili zaman serilerinin boyunca 200 sn zaman segmentleri gölgeli (a). Birkaç karakteristik kütle su kümeleri ilgilendiren oranları şarj etmek(Örneğin, m / z 1, 19, 37, 55) bilinen amino asit fragmanları ek olarak gösterilmiştir (örneğin, m / z 30, 83, 98). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SALVI gibi TOF-SIMS ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) olarak vakum temelli araçların dinamik sıvı yüzey ve sıvı-katı ara analizine olanak sağlayan bir mikroakışkan arabirimdir. Küçük delikler kullanımı doğrudan vakum sıvı açığa nedeniyle SALVI herhangi bir değişiklik olmadan birçok ince odaklı spektroskopi ve görüntüleme teknikleri için uygundur; 22 taşınabilirlik ve Mikroakiskan çok yönlülüğü gerçek bir multimodal görüntüleme platformu yapmak. Farklı özellikler ve diğer mevcut tekniklere kıyasla Salvi önemi birkaç son değerlendirme özetlenmiştir. SALVI teknolojisinin geliştiricisi olarak 22-25 grubumuz aktif dinamik sıvı yüzeyleri ve sıvı-katı arayüzleri içeren çalışmaların çeşitli uygulayarak olmuştur . Yeni uygulamalar bazı örnekleri, memeli hücre zarları, bakteri biyofilm eki, sulu bir yüzey oksidasyon sonucu 15,16 veya nanopartikül oluşmasını içerir. Bu pabaşına, biz SİN yüzeyinde adsorbe hidrate protein ince film ilk sıvı TOF-SIMS sonuçları sunulmaktadır.
Dikkatlice protokolde vurgulanan adımları ele oldukça önemlidir. 1. ve 2. adımlarda şırınga içine sıvı çizerken Örneğin, şırınga içinde herhangi bir baloncuklar olmadığından emin olun. Kabarcıklar Salvi enjekte edilir çünkü bir kez, onlar vakum kaçağı neden olabilir. Herhangi bir kabarcıklar görülür ise 9 Böylece, dik şırınga ayarlama ve yavaşça dışarı kabarcıklar iterek onlardan kurtulmak için isabetli olmuştur. Buna ek olarak, bu 3. adımda anlatılan algılama alanının Bu düzgünlüğü doğrudan TOF-SIMS tasarımına göre veri kalitesini etkiler olarak optimize edilmiş TOF-SIMS analizi için Salvi SiN pencere düz yapmak çok önemlidir. 26 O görsel SIMS sahneye şeyi güvence sonra cihazı incelemek gerekmektedir. SİN penceresi yatay değilse, vidaları ayarlayın ve yüksekliğini değiştirmekSALVI cihazının her mümkün olduğu kadar aynı düzlemde olduğundan emin olmak için. Bu hassas noktalar bütün deney başarısını ve güvenilirliğini belirleyen tecrübe ve titizliği, gerekir.
Şekil 1b'de gösterildiği gibi, m / z 19, 37, 55, 73, 91 ve 109 yüksek düzeylere sahip olan tepe değeri. Bu (H 3 O + H 5 O 2 + H 7 O 3 + H 9 O 4 + H 11 O 5 + ve O 6 + H 13) su kümelerinin iyi bir sayı olduğunu pozitif gösterir ikincil iyonlar. daha yüksek m / z değerleri ile, diğer su kümeleri (veriler gösterilmemiştir) komşu zirveleri ile karşılaştırıldığında nispeten kuvvetli zirvesine sahip bulunmaktadır. su kümeleri bu büyük miktarlarda SiN yumruk-through sonra DI su yüzeyinden yayılır. pozitif modda su küme sinyalleri w önceki gözlenebilir olmamıştırork; ve bu TOF-SIMS geçmişte koşulları optimize edilmemiş ikincil iyonların ve düşük sayıları bağlandı. 8 SALVI ve TOF-SIMS edinme koşullarının optimize sürekli çaba ile bu tür yani birincil iyon ışını (Bi + vs olarak . Bi 3 +), darbe genişliği ve derinliği profilleme sırasında mevcut koşullar, makalede sunulan şartlar kullanılarak pozitif modda 44 su kümeleri kadar gözlemlemek mümkündür. Burada gösterilen sonuçlar daha çeşitli biyolojik moleküller ve biyolojik sistemlerin dinamikleri suyun rolünü araştırmak için umut vericidir.
Burada, biyolojik moleküler dinamik okuyan salvi TOF-SIMS avantajlarını göstermek için, örnek olarak, fibronektin protein hidrasyon sunulmuştur. M / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 ve 98 tepe DI wat çok daha güçlü olan bir önceki rapora, 27,28 göre amino asit fragmanları aitER Şekil 1b'de gösterilmiştir. fibronektin örnek amino asit fragmanlarının artan yoğunluğu bu farklılık bu ikincil iyon protein kendilerini gerçekten de olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, Şekil 1a'da su kümeleri tepe protein adsorpsiyon yüzey ve ara yüzey çözelti içinde su moleküllerinin özellikleri saf suda çok farklı olabileceğini düşündürmektedir Şekil 1b, DI suyun çok daha güçlüdür.
SALVI mikrokanalda fibronektin ve distile su: Şekil 2a iki farklı örnek temsilcisi derinlik profilleme zamansal dizi gösterir. SİN pencere uzun darbe genişliği Bi 3 + primer iyon ışını ile bombardıman ediliyordu olarak derinlik profilleme veriler toplanmıştır. Şekil 2a görüldüğü gibi, SİN penceresi yaklaşık 300 sn ile delinir. Salvi de SİN penceresi Throug delikli önceh seçilen ikincil iyonların yoğunlukları oldukça düşüktür. SİN penceresi aracılığıyla delikli sonra, ikincil iyon yoğunlukları hemen sıvı yüzey birincil iyon ışını tarafından bombardıman ediliyor başlar artar. Örneğin, H + yoğunlukları ve H 3 O + su yüzeyinin gözlem gösteren büyük bir artış göstermektedir. 8,9 yoğunlukları zımba oranı veya arayüzde, nispeten stabil ulaşabilir sonra kararsız doğru olmasına rağmen belirli bir süre sonra, değerleri (örneğin, fibronektin 60 sn ve Şekil 2a, sırasıyla Dİ su, 220 sn). Etkili m / z spektrumları SiN yumruk-through sonra elde çünkü uzun darbe genişliği sondaj farkı gerçekten m / z spektrumları (örneğin, Şekil 1) yeniden ne zaman burada gösterilen analiz sonuçlarını etkilemez. Ancak, bir araştırmacı tüm örnekler fo için aynı şartlarda kullanmayı tercih edebilirr tutarlılık ve veri analizi sırasında veri bölümleri seçiminde kolaylık. Daha iyi kütle çözünürlüğü elde etmek için, darbe genişlik, daha sonra indirgendi ve yoğunlukları derinliği profil deney ikinci kısmında buna göre azalmıştır. Başka bir 200 sn m / z spektral analiz için yeterli veri sağlamak için derinlik profili zaman serisi sürekli olarak toplandı. yeniden inşa edildi / z spektrumları m zaman segmentleri yeşil gölgeli alanlarda vurgulanır.
Fibronektin yaygın hücre kültürü önce yüzey adsorpsiyonu için kullanılmıştır; Birçok çalışma, fibronektin, hücre yapışması ve hücre biyomateryal etkileşimlerinden sorumlu olduğunu göstermiştir. 19,20,29 yeni bir çalışma (hidroksietil metakrilat) fırçalar Elipsometri kullanılarak poli adsorbe fibronektin kalınlığı ile karakterize edilir. Fibronektin ince film 3-12 mil kalınlığındadır. 30, kalınlığı olduğu saptanmıştır sulu Solu derinlik profili analizi için uygun olanyon. Salvi gelişimi ile 8,9, katı yüzey üzerinde adsorbe hidrate proteinin doğrudan analiz artık mümkün. Bu yaklaşım, potansiyel dinamik katı yüzeyler ile proteinlerin etkileşimlerini inceleyerek geniş bir uygulama olabilir.
Şekil 2b sırasıyla fibronektin ve DI su örneklerinin farklı ikincil iyonların seçilen 2D görüntüleri gösterir. 2D görüntüler SiN sonrası sıvı yüzeyine karşılık, Şekil 2a'da, yeşil renkli bölgeler derinlik profili zamansal verileri elde edilir zımba, daha önceden tarif edildiği gibi. Seçilen bir amino asit bölümünün sekonder iyon Çıkan CH4 K +, Cı 5H 7 O + ve C 4H 4 NO 2 + (yani, m / z 30, 83 ve 98) fibronektin, ince film için çok daha parlaktı DI su. Bu amino asit parçası, ikinci iyonları ön görülmektedir belirtir2 mikron çaplı diyafram içinde fibronektin molekülleri rom. Bundan başka, seçilen zirveler görüntüleri (ör, m / z 1, 19, 37 ve 55), fibronektin çeşitli su kümelerine karşılık gelen DI suyun daha belirgin parlaktır. Bu sonuç, fibronektin hidrasyon deiyonize suda, su moleküllerinin farklı biyomolekülün çevreleyen su molekülleri hale getirdiğini gösterir.
Özetle, bu çalışma protein hidrasyon kaynaklı su molekülü mülkiyet değişiklikler üzerinde çarpıcı kanıtlar sunmuştur. Bu sonuçlar, sıvı mikro bir katı yüzey üzerinde adsorbe protein yapısı, konformasyon ve biyolojik etkinliği üzerinde geliştirilmiş bir kavrayış temin edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 ml |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 ml |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µl |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 ml |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/ml |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
