Summary
Dit werk geeft een protocol voor vloeistofverwerking en monsterintroductiemethode een microkanaal in situ time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie analyse van biomoleculen eiwit in een waterige oplossing.
Abstract
Dit werk toont in situ karakterisering van eiwit biomoleculen in de waterige oplossing met behulp van het systeem voor de analyse van de Liquid Vacuum Interface (SALVI) en time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS). De fibronectine proteïnefilm werd geïmmobiliseerd op het siliciumnitride (SiN) membraan dat de SALVI detectiegebied vormt. Tijdens ToF-SIMS werden drie wijzen van analyse zoals hoge ruimtelijke resolutie massaspectrometrie, tweedimensionale (2D) beeldvorming en diepteprofilering. Massaspectra werden zowel positieve als negatieve modes verworven. Gedeïoniseerd water werd ook geanalyseerd als referentiemonster. Onze resultaten tonen aan dat de film fibronectine in water is duidelijker en sterker watercluster pieken opzichte water alleen. Karakteristieke pieken aminozuur fragmenten zijn ook waargenomen in het gehydrateerde eiwit ToF-SIMS spectra. Deze resultaten illustreren dat eiwitmolecuul adsorptie aan een oppervlak kan worden bestudeerd dynamically gebruik SALVI en ToF-SIMS in de vloeibare omgeving voor de eerste keer.
Introduction
Hydratatie is essentieel voor de structuur, conformatie 1, 2 en 3 biologische activiteit van eiwitten. Eiwitten zonder watermoleculen rondom hen niet zou hebben levensvatbare biologische activiteiten. Specifiek watermoleculen interactie met het oppervlak en inwendige structuur van eiwitten en andere toestanden van hydratatie eiwitten dergelijke interacties onderscheiden. 4 de interactie van eiwitten met vaste oppervlakken is een fundamenteel verschijnsel gevolgen nanotechnologie, biomaterialen en weefselengineering processen. Studies hebben aangetoond dat lange conformationele veranderingen kunnen optreden als een eiwit een oppervlak ontmoet. ToF-SIMS is voorzien als de techniek die het potentieel heeft om de eiwit-vaste stof grensvlak studie. 5-7 Het is belangrijk om de hydratatie van eiwitten begrijpen op vaste oppervlakken, die potentieel biedt een fundamenteel begrip van het mechanisme van hun structuur, conformatie en biologischeal activiteit.
Echter hoofdoppervlak analytische technieken zijn meestal vacuüm gebaseerde directe toepassingen voor vluchtige vloeibare studies moeilijk door de snelle verdamping van vluchtige vloeistof onder de vacuümomgeving. We ontwikkelden een vacuümcompatibel microfluïdische interface analysesysteem in de Liquid Vacuum Interface (SALVI), om directe waarneming van vloeistofoppervlakken en vloeistof-vaste stof interacties met behulp van time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS) inschakelen. 8- 11 de unieke aspecten zijn: 1) het detectievenster is mazen van 2-3 urn diameter worden directe beeldvorming van het vloeistofoppervlak, 2) oppervlaktespanning wordt gebruikt om de vloeistof binnen de opening te houden, en 3) is SALVI draagbare tussen meerdere analytische platforms. 11,12
SALVI bestaat uit een siliciumnitride (SiN) Membraan het detectiegebied en een microkanaal van polydimethylsiloxaan (PDMS). Het is fabrvoor bestemde in de clean room, de fabricage en uitgangspunten van factoren zijn beschreven in eerdere artikelen en octrooien. 8-12 De toepassingen van ToF-SIMS als analytisch hulpmiddel aangetoond met verschillende waterige oplossingen en complexe vloeistofmengsels sommige die nanodeeltjes bevatten. 13-17 Specifiek SALVI vloeistof ToF-SIMS maakt dynamische sonderen van de vloeistof-vaste stof grensvlak van levende biologische systemen (dat wil zeggen, biofilms), enkele cellen en vaste elektrolyt-interface, het openen van nieuwe mogelijkheden voor in situ gecondenseerde fase studies met inbegrip van vloeistoffen met behulp van ToF-SIMS. Echter, het huidige ontwerp nog niet toestaan dat gas-vloeistof interacties. Dit is een richting voor toekomstige ontwikkeling. SALVI is gebruikt om de gehydrateerde proteïnefilm bestuderen dit werk voor het eerst.
Fibronectine is een veelgebruikte eiwit dimeer bestaande uit twee vrijwel identieke monomeren verbonden door een paar disulfidebindingen, 18 waarbij is bekend om zijn vermogen om cellen te binden. 19,20 werd gekozen als modelsysteem om te illustreren dat het gehydrateerde eiwit film dynamisch kunnen worden gesondeerd met behulp van de vloeistof SALVI ToF-SIMS aanpak. De eiwitoplossing werd in de microkanaal. Na incubatie gedurende 12 uur, een gehydrateerde eiwit gevormd op de achterzijde van de SiN membraan. Gedeïoniseerd (DI) water werd gebruikt om af te spoelen na het kanaal eiwit introductie. Informatie werd verzameld uit gehydrateerde fibronectine eiwitmoleculen in de SALVI microkanaal met behulp van dynamische ToF-SIMS. DI water werd ook bestudeerd als een controle ter vergelijking met de resultaten van gehydrateerde fibronectine dunne film. Duidelijke verschillen waargenomen tussen de gehydrateerde eiwit film en DI-water. Dit werk toont aan dat eiwit adsorptie op het oppervlak in de vloeibare milieu kan worden bestudeerd met behulp van de roman SALVI en vloeibare ToF-SIMS aanpak. De video protocol is bedoeld om technische begeleiding voor mensen die geïnteresseerd zijnin het gebruik van deze nieuwe analytische tool voor diverse toepassingen van SALVI met ToF-SIMS en onnodige fouten in liquid handling verminderen evenals ToF-SIMS data-acquisitie en analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reiniging en sterilisatie van de SALVI Microchannel
- Sterilisatie van de Microchannel in SALVI
- Trekken 2 ml 70% ethanol waterige oplossing in een injectiespuit, sluit de spuit met het inlaateinde van SALVI en injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min. Verwijder de injectiespuit aan het einde van de injectie. Vervolgens sluit de inlaat en uitlaat van SALVI met behulp van een polyetheretherketon (PEEK) unie. Anders, gebruik een spuitpomp dezelfde procedure voeren. Stel bijvoorbeeld de stroomsnelheid van 100 pl / min.
- Houd de SALVI microkanaal gevuld met 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Introduceer gedeïoniseerd (DI) water in SALVI
- Trek 2 ml gesteriliseerde DI water in een spuit, sluit de spuit met de inlaat van SALVI, en injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min. Verwijder de spuit en sluit de inlaat en uitlaat van SALVI met behulp van een PEEK unie. Afwisselend gebruik een spuitpomp zoals vermeld instap 1.1.1.
2. immobilisatie van het eiwit Film in SALVI
- Immobiliseer de Eiwit Film in SALVI
- Trek 2 ml van fibronectine (10 ug / ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) oplossing in een spuit, sluit de spuit met de inlaat van SALVI, injecteer langzaam 1 ml van de vloeistof in 10 min, verwijder de spuit en sluit de inlaat en de uitlaat van SALVI met behulp van een PEEK unie.
- Incubeer de SALVI gevuld met fibronectine oplossing in een schone kweekschaal, houdt de schaal in de kap bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
- Trek 2 ml gesteriliseerde DI water in een spuit en verbind de spuit met de inlaat van SALVI. injecteer langzaam 1 ml water in 10 min, verwijder de spuit en sluit de inlaat en uitlaat van SALVI.
Opmerking: als uitgerust met een lichtmicroscoop, controleer dan de SALVI onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de SiN membraan intact is voordat ToF-SIMS analyse. Nu is de SALVI apparaat klaar is voor ToF-SIMS eenalysis.
3. Installeer SALVI in de ToF-SIMS laadvergrendelingskamer
Opmerking: Handschoenen moeten worden gedragen te allen tijde bij de behandeling van de SALVI apparaat en het installeren van het op de ToF-SIMS podium om mogelijke verontreinigingen tijdens de oppervlakte-analyse te voorkomen.
- Mount SALVI naar het werkgebied
- Leg de ToF-SIMS stage op een vlakke en schone ondergrond. Zet de SALVI apparaat op het podium met het silicium wafer en SiN membraan naar boven. Bevestig de SALVI met behulp van vier metalen Klemstukken en schroef de metalen stukken die de hoek van het apparaat in de metalen plaat met vier schroeven.
- Voorzichtig oprollen de PFTE slangen aangesloten op de microfluïdische kanaal. Gebruik vier stukken metaal en vier schroeven om de stijve deel ingedrukt houdt. Zorg ervoor dat het apparaat is geplaatst in de open ruimte op het podium SIMS zodat het niet interfereert met de primaire ionenbundel tijdens de analyse. Additional image en illustratie van de SALVI fabrication en de installatie zijn beschikbaar in eerdere publicaties. 8,9,11
- Monteer de Faraday Cup naar het werkgebied
- Bevestig de Faraday-beker op het podium door een schroef.
- Laad de Stage in de ToF-SIMS laadvergrendelingskamer
- Open de ToF-SIMS loadlock, vast te houden en de weg geëffend horizontaal op het laadplatform, en sluit de laadsluis deur.
4. ToF-SIMS Data Acquisition
- Schakel de vacuümpomp en zorgen voor passende vacuüm (bijvoorbeeld, in de orde van 10 mbar of -6 Torr) wordt bereikt in de laadvergrendelingskamer.
- Verplaats de SALVI in de hoofdkamer nadat het vacuüm is gestabiliseerd na ongeveer 30 min.
Opmerking: Het vacuüm moet lager zijn dan 5 x 10 -6 mbar vacuüm in de belangrijkste kamer tijdens data-acquisitie. Anders hogere vacuüm duidt op een lek in het systeem SALVI. - Pas de primaire ionenbundel en analyse van ToF-SIMS met eenruimtelijke resolutie van ongeveer 400 nm volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De stroom van primaire bundel 1200 pA terwijl de cyclustijd 30 psec onder gelijkstroompulsmodus.
Opmerking: Dit proces volgt grotendeels aanbevelingen van de fabrikant. - Vind de microfluïdische kanaal met de optische microscoop. Gebruik het optische beeld centrum als referentie en breng het in overeenstemming met het secundaire beeld ion center te zijn.
- Vóór elke meting, gebruik dan een 1 KeV O 2 + bundel (~ 40 nA) te scannen op het raam SiN met een 500 x 500 pm 2 gebied voor ~ 15 sec om besmetting van het oppervlak te verwijderen. Gebruik ook een elektron overstroming pistool tegen het oppervlak opladen compenseren tijdens alle metingen. Gebruik de automatische functie van de zondvloed pistool in de standaardmodus voor deze stap.
- Selecteer positieve of negatieve modus voor data-acquisitie. Gebruik de 25 keV Bi 3 + bundel als de primaire ionenbundel in alle afmetingen.
Opmerking: De stappen zijn vergelijkbaar fof positieve en negatieve data acquisities. Voor het belang van de ruimte, wordt de positieve modus in detail beschreven hier.- diepte Profiling
- Scan de Bi + 3 straal op een rondje met een diameter van ~ 2 micrometer met 32 pixels bij 32 pixels resolutie.
- Om de tijd die nodig is om punch-through de SiN membraan te minimaliseren, gebruik dan een lange puls breedte (dwz 180 ns, straalstroom ~ 1,0 Pa bij een cyclustijd van 100 psec) Bi 3 + balk. De intensiteit van de secundaire ionen vertegenwoordiger van de vloeistof toename oppervlak als punch-through is bereikt. Het doorschakelen varieert van 300 sec tot 500 sec, afhankelijk van de partij van de SiN membraan.
Opmerking: Dit verschil lijkt verband te houden met de partij SiN membraan verkregen volgens onze ervaring. Echter, de punch-through tijd niet echt invloed op de data-analyse. - Na de SiN membraan punch-through, houden dezelfde stroom voor ongeveer 200 secvoldoende gegevens voor 2D beeld reconstructies te verkrijgen.
- Verlaag de pulsbreedte tot 80 nanoseconden voor het verzamelen van gegevens om spectra te verwerven met een betere massa-resolutie. Ga door deze overname nog ongeveer 200 sec. Het spectrum uit figuur 1 worden verkregen uit dit gebied.
- 2D Imaging and Mass Spectra
- Verzamel de 2D-beeldvorming en de massa spectra data op hetzelfde moment bij het meten van de diepte profiling data. De ToF-SIMS instrument slaat alle informatie van elke plek in het experiment. De gegevens worden getoond in verschillende vensters (FPanel - Spectra, FPanel - Profielen en FPanel - Beelden afzonderlijk) van de digitale control software. Controleer gegevens in elk paneel oordeelkundig tijdens data-acquisitie.
- diepte Profiling
5. ToF-SIMS Data Analysis
Let op: Data-analyse wordt in eerste instantie uitgevoerd met de IonToF ToF-SIMS instrumentale software.
- Open het eenalysis software van SIMS (Measurement Explorer) en klik vervolgens op de 'profielen', 'spectra' en 'beeld' knoppen, respectievelijk, de diepte profiel, m / z spectrum, en beeldgegevens te verwerken.
- Open de gegevensbestanden die de extensie ".ita" te hebben.
- Selecteer toppen van belang, typt u de naam van die soort in box "ion", en label ze met verschillende kleuren in de spectra. Gebruik het muiswieltje te slepen langs de x-as. Gebruik Ctrl en scrollwiel om piek hoogtes en breedtes te passen. Letter "L" schakelt tussen Lineair en Log modes langs de y-as.
- Gedrag datareconstructie voordat massa kalibratie. Anders is het moeilijk om de afstand tussen pieken in het massa calibratiestap kiezen.
- Selecteer de diepte profilering gegevens van rente en te reconstrueren de spectra volgens de diepte profiel temporele series.
- Klik op de knop de wederopbouw. In het venster "Reconstructie Start", typt u een scan reeks interest. Klik op "OK" om de diepte profiel data te reconstrueren.
- Voer een massa kalibratie. Druk op "F3" om het venster "massa-kalibratie" te openen. Kies pieken voor de kalibratie op basis van de specifieke monster. 21 In dit werk, gebruikt u de volgende pieken CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) en H 13 O 6 + (m / z 109) voor de positieve modus. Gebruik de volgende pieken CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), en C 4 H - (m / z 49) de negatieve modus.
- Selecteer een piek,Zorg ervoor dat de neerwaartse pijl wijst op het hoogtepunt in de linker benedenhoek van het venster. Klik op dat de piek en typ de naam piek in het venster "massa-kalibratie", klik op "Add", en het ion van belang wordt opgenomen in de massa kalibratie.
- Tot slot, klik op de "Opnieuw kalibreren" knop. Controleer of de oppervlakten van de pieken op de juiste plaats op basis van hun massa's op te laden. In het menu "Spectrum", te selecteren en klik op "Apply Mass Calibration" naar "Alle Spectra 'of' Geselecteerde spectra", afhankelijk van de specifieke analyse wordt uitgevoerd.
- Zoals piek selectie nodig zijn voor het monster analyse, het bepalen van karakteristieke pieken van het monster volgens de literatuur of andere eerdere bevindingen. Vergelijk de intensiteit van belangrijke pieken in de m / z spectra. Indien nodig, het toevoegen van nieuwe pieken of te verwijderen nutteloos pieken in de top lijst.
- pieken toe te voegen. Klik op een piek, het vinden van de rode lijnen op de bodem venster verlaten. Hold de "Ctrl" -toets, scroll muis horizontaal om piekbreedte, die een piek toevoegt aan de piek lijst automatisch te definiëren. Een andere manier om een piek toe te voegen is een piek in de belangrijkste spectrum venster te selecteren en vervolgens te klikken op de "add piek" knop boven het raam. Als er veel pieken om verwante specificaties in het nieuw geopende venster toe te voegen, in het menu "Spectrum", selecteer "search pieken", controleren, pieken voeg dan als dat nodig is.
- Tot een piek te exporteren, in het menu "Peak List", selecteer "Opslaan ..." de piek lijst in de "itmil" formaat. Gebruik de Ctrl en de linker knop te slepen langs het spectrum. In de spectra venster, kies een piek van belang en sleep de twee stippellijnen om gewenste posities.
- Tot een piek lijst importeren in het menu "Mass interval List", kies "Importeren ...", zoek een bestaand peak lijst bestand met de extensie ".ITPL". Klik op "Open".
- Om een "itmil" piek lijst te gebruiken, inhet menu "Mass Interval List", klik op "Open ...", zoek het bestand en klik op "Open".
- Breng een piek lijst om de gegevens verder te analyseren. In de linker onderhoek van venster "Spectra", is er een venster genaamd "Mass Interval List". De geïmporteerde piek lijst wordt hier getoond op.
- Klik met de rechtermuisknop de piek lijst bestand te gebruiken, toe te passen op de "actieve spectrum" of "alle spectra."
- Raadpleeg de profielen. In het venster "Profile", gebruiken letter "M" aan te passen om het venster (full range) en de letter "N" aan te passen aan de y-as. Gebruik Ctrl en scroll wiel om het profiel breedte aan te passen. Gebruik "/" en "*" op het toetsenbord om de y-as bereik en hoogte veranderen.
- Export van gegevens voor verdere plotten met behulp van andere grafische software na de eerste analyse.
- Tot een diepte profiel te exporteren, in het venster "Profile", klikt u op het menu "Bestand" en selecteer "Export & #34 ;, en selecteer vervolgens "Opslaan als" een ".txt" bestand.
- Om een m / z spectrum bestand te exporteren, in het venster "Spectra", klikt u op het menu "Bestand" en selecteer "Export" en selecteer vervolgens "Opslaan als" een ".txt" bestand.
- Om een image-bestand te exporteren, in de "Image" venster, print screen en opslaan als het beeldbestand.
6. ToF-SIMS gegevens plotten en presentatie
Opmerking: Gebruik een grafische tool om de gegevens te plotten na de SIMS gegevens worden verwerkt met behulp van de instrumentale software.
- Gebruik een grafische tool om de gegevens te importeren.
- Maak een grafiek met de m / z als de x-as en piekintensiteit als de y-as naar de gereconstrueerde spectrum tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 1.
- Maak een grafiek met de sputtertijd de x-as en piekintensiteit als de y-as naar de gereconstrueerde diepteprofiel temporale reeks tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in Figure 2.
- Combineer gereconstrueerde 2D beelden van verschillende m / z en vormen een matrix voor de ion mapping tonen. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkele representatieve resultaten worden de voordelen van de voorgestelde protocol aangetoond. Door het gebruik van de SALVI microfluïdische interface kan de primaire ionenbundel (Bi 3 +) direct bombarderen op de gehydrateerde fibronectine film in DI water. Waardoor de moleculaire chemische mapping van het vloeistofoppervlak succes kan worden verkregen.
Figuur 1a en 1b van de positieve ToF-SIMS massaspectra van de gehydrateerde fibronectine film en DI water laten zien, respectievelijk. De belangrijke pieken zoals water clusters (dwz, m / z 19, 37, 55, 73, 91 en 109) en aminozuur- fragmenten (dat wil zeggen, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 en 98) zijn aangegeven met de rode pijlen. Naast de karakteristieke pieken van aminozuur fragmenten, die wijd zijn gerapporteerd met behulp van droge eiwitmonsters, worden de toppen van water clusters waargenomen in demassa spectra van gehydrateerd fibronectine film in DI water. Bovendien zijn de intensiteiten van deze pieken water cluster zijn zeer verschillend van die in de massaspectra DI water. Dit resultaat geeft de directe bewijs van het eigendom van watermoleculen rondom en binnen de gehydrateerde eiwitmoleculen die een rol spelen in hun adsorptie aan een oppervlak.
Figuur 2a toont de diepte profiel tijdreeksen van de gehydrateerde fibronectine film en DI-water. Aangezien het monster onder de SiN membraan, de intensiteiten van geselecteerde tweede ionen verwaarloosbaar voor de SiN membraan geperforeerd door (dwz 280 seconden voor fibronectine en 340 seconden voor DI water). Zodra de SiN membraan is geperforeerd door middel van de intensiteiten van deze secundaire ionen aanzienlijk toenemen. Bij gebruik van de lange pulsbreedte, de massaresolutie relatief laag. Daarom is de korte pulsbreedte werkwijze gebruikt om gegevens te verkrijgen met betere massaresolutievoor het spectrum en reconstructies zoals blijkt uit figuur 2a. Na enige tijd (bijvoorbeeld, 60 seconden voor fibronectine en 220 seconden voor DI water), de verminderde pulsbreedte wordt gebruikt voor m / z spectra betere massaresolutie verkrijgen. De uiteindelijke m / z spectra werden gereconstrueerd uit 200 sec metingen in het groen gearceerde gebieden in het diepteprofiel temporele series. Figuur 2b toont de 2D-beelden van de gehydrateerde fibronectine film en DI water, die overeenkomen met het groene gearceerde deel van figuur 2a. Deze 2D-beelden geven de tellingen van geselecteerde secundaire ionen uit de steekproef: hoe helderder het beeld, des te hoger de secundaire ionen tellen. Zulke intuïtieve beelden geven een duidelijke vergelijking van de geselecteerde secundaire ionen tussen de verschillende monsters, wat handig is in data-analyse. Volgens onze ervaring, het verschil in de SiN doorschakelen varieert van partij tot partij van de SiN membranen. Dit betekent echter geen invloed op de retaten van de dynamische ToF-SIMS analyse.
Figuur 1: Vergelijking van de ToF-SIMS positieve spectra van de gehydrateerde film fibronectine en DI water in de SALVI microkanaal (a) De gereconstrueerde m / z spectrum van fibronectine.. (B) De DI-water spectrum.
Figuur 2:. Diepte profielen en 2D-beelden van gehydrateerd fibronectine en DI-water (a) De diepte profilering tijdreeksen van fibronectine en DI water in de positieve modus. (B) 2D beelden gereconstrueerd overeenkomt met de groene gearceerde 200 sec tijdsegmenten langs het diepteprofiel tijdreeks in (a). Verschillende karakteristieke massa om verhoudingen van belang rekening te water clusters(Bv, m / z 1, 19, 37, 55) getoond in aanvulling op de bekende aminozuur fragmenten (bijvoorbeeld m / z 30, 83, 98). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SALVI is een microfluïdische interface die dynamisch vloeistofoppervlak en vloeistof-vaste stof grensvlak analyse maakt van vacuüm gebaseerde instrumenten, zoals ToF-SIMS en scanning elektronenmicroscopie (SEM). Door het gebruik van kleine openingen bloot vloeistof direct in vacuüm, SALVI is geschikt voor vele fijne gefocuste spectroscopie en imaging technieken zonder enige wijziging; 22 de draagbaarheid en veelzijdigheid van microfluidics maken het een echt multimodaal imaging platform. Verschillende functies en belang van SALVI vergelijking met andere technieken zijn samengevat in verscheidene recente reviews. 22-25 Als ontwikkelaar van de SALVI technologie is de groep actief toe te passen op verschillende studies met dynamische vloeistofoppervlakken en vloeistof-vaste stof interfaces . Voorbeelden van nieuwe toepassingen zijn zoogdiercelmembranen, bacteriën biofilm beslag, 15,16 of vorming van nanodeeltjes als gevolg van waterige oppervlakte oxidaties. In deze paper presenteren we aanvankelijk vloeibaar ToF-SIMS resultaten van het gehydrateerde eiwit dunne film geadsorbeerd op het oppervlak SiN.
Het is heel essentieel om zorgvuldig omgaan met de gemarkeerde stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, bij het opstellen vloeistof in de spuit in de stappen 1 en 2, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit. Want zodra de bubbels worden geïnjecteerd in SALVI, kunnen ze lekken veroorzaken in vacuüm. 9 Dus, als eventuele luchtbellen in acht worden genomen, is het verstandig om zich te ontdoen van hen te krijgen door het instellen van de spuit rechtop en voorzichtig uit te drukken de bubbels. Bovendien is het zeer belangrijk om het venster SiN in SALVI vlak voor optimale ToF-SIMS maken, zoals beschreven in stap 3. Deze vlakheid van de detectiezone rechtstreeks effect op de datakwaliteit volgens het ontwerp van ToF-SIMS. 26 het moet het apparaat visueel te inspecteren na het veiligstellen van het geheel op de SIMS podium. Als de SiN-venster niet horizontaal, past u de schroeven en verander de hoogteSALVI van het apparaat om te controleren dat alles op hetzelfde vlak zoveel mogelijk. Deze gevoelige punten moeten verbeteren en zorgvuldigheid, die het succes en de betrouwbaarheid van het gehele experiment te bepalen.
Zoals getoond in figuur 1b, de pieken met m / z 19, 37, 55, 73, 91 en 109 hebben hoge tellingen. Dit geeft aan dat er een flink aantal van water clusters (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + en H 13 O 6 +) in de positieve secundaire ionen. Andere water clusters (gegevens niet getoond) met hogere m / z waarden ook relatief sterke pieken in vergelijking met naburige pieken. Deze grote hoeveelheden water clusters worden uitgezonden door de DI wateroppervlak na de SiN punch-through. cluster water signalen in de positieve modus niet waarneembaar in de voorafgaande work; en dit werd toegeschreven aan de lage tellingen van secundaire ionen en niet geoptimaliseerde ToF-SIMS omstandigheden in het verleden. 8 Met de voortdurende inspanning optimale SALVI en ToF-SIMS acquisitievoorwaarden zoals primaire ionenbundel (dat wil zeggen Bi + vs . Bi + 3), pulsbreedte en de huidige omstandigheden tijdens diepte-, is het nu mogelijk om nauwgezet 44 water clusters in de positieve modus met de in dit document omstandigheden. Resultaten hier zijn veelbelovend voor de rol van water in dynamica van verschillende biologische moleculen en biologische systemen verder te onderzoeken.
Hier als voorbeeld om de voordelen van SALVI en ToF-SIMS in zoals biologische moleculaire dynamica illustreren de hydratatie van fibronectine eiwit werd gepresenteerd. De pieken met m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 en 98 behoren tot de aminozuur fragmenten volgens de voorgaande verslag 27,28 die veel sterker zijn dan die van DI wat zijner is getoond in figuur 1b. Dit verschil in de verhoogde intensiteit van de aminozuur fragmenten in het monster fibronectine suggereert dat deze secundaire ionen inderdaad van de eiwitten zelf. Bovendien, de toppen van water clusters in figuur 1a zijn veel sterker dan DI water in figuur 1b, hetgeen betekent dat de eigenschappen van watermoleculen in de eiwitadsorptie oppervlak interface- oplossing sterk verschillen van die in zuiver water zijn.
Figuur 2a toont representatieve diepteprofilering tijdelijke reeks van twee verschillende monsters: fibronectine en DI water in de SALVI microkanaal. De diepte profiling data werden verzameld als het raam SiN werd gebombardeerd door de Bi 3 + primaire ionenbundel met de lange puls breedte. Zoals blijkt uit figuur 2a, wordt het venster SiN geperforeerd door ongeveer 300 sec. Voordat het venster SiN in SALVI geponst through, de intensiteit van de geselecteerde secundaire ionen zijn vrij laag. Zodra het venster SiN wordt geslagen door middel van de intensiteit van de secundaire ionen per direct te verhogen als de vloeistof oppervlak begint gebombardeerd door de primaire ionenbundel. Bijvoorbeeld, de intensiteiten van H + en H 3 O + vertonen een grote toename, met vermelding van de observatie van het wateroppervlak. 8,9 Hoewel de intensiteiten onstabiel zijn direct na de punch-through of op de interface, kunnen zij relatief stabiel te bereiken waarden na verloop van tijd (bijvoorbeeld 60 seconden voor fibronectine en 220 seconden voor DI water in respectievelijk figuur 2a). Het verschil in de lange pulsbreedte boren niet echt invloed op de analyseresultaten hier weergegeven als reconstrueren m / z spectra (bijvoorbeeld figuur 1), aangezien de effectieve m / z spectra verkregen na de SiN doorschakelen. Echter kan een onderzoeker kiezen om dezelfde omstandigheden te gebruiken voor alle monsters for consistentie en gemak bij het kiezen van data secties tijdens de data-analyse. Om beter massa resolutie te verkrijgen werd de pulsbreedte vervolgens gereduceerd en intensiteiten werden dienovereenkomstig in het laatste gedeelte van de diepteprofilering experiment afgenomen. Het diepteprofiel tijdreeksen werden continu verzameld voor andere 200 sec voldoende gegevens voor m / z spectraalanalyse. De segmenten van de tijd dat m / z spectra werden gereconstrueerd worden groen gemarkeerd schaduwrijke gebieden.
Fibronectine is op grote schaal gebruikt voor oppervlakte adsorptie vóór celkweek; Vele studies hebben aangetoond fibronectine verantwoordelijk voor celhechting en cel-biomateriaal interacties. 19,20,29 Een recente studie karakteriseerde de dikte van fibronectine geadsorbeerd op poly (hydroxyethyl methacrylaat) borstels gebruikt ellipsometrie. De fibronectine dunne film werd bepaald op 3-12 nm dik. 30 Dergelijke dikte is redelijk voor de diepte- analyse in een waterige oplostie. 8,9 Met de ontwikkeling van SALVI, directe analyse van het gehydrateerde eiwit geadsorbeerd op het vaste oppervlak is nu mogelijk. Deze benadering kan mogelijk brede toepassingen in onderzoek naar de interactie van eiwitten met vaste oppervlakken dynamisch zijn.
Figuur 2b toont de geselecteerde 2D-beelden van verschillende secundaire ionen uit fibronectine en DI watermonsters, respectievelijk. 2D afbeeldingen verkregen van de diepte- tijd gegevens in groene gearceerde gebieden in figuur 2a, die overeenkomen met het vloeistofoppervlak na SiN doorschakelen zoals eerder beschreven. De beelden van geselecteerde aminozuurfragment secundaire ionen CH 4 N +, C 5 H 7 O + en C 4 H 4 NO 2 + (dwz, m / z 30, 83 en 98) voor de fibronectine dunne film waren veel helderder dan voor DI water. Dit geeft aan dat het aminozuur fragment secundaire ionen waargenomen from de fibronectine moleculen in de 2 urn diameter opening. Bovendien is de beelden van geselecteerde pieken (bijv m / z 1, 19, 37 en 55) gevonden verscheidene water clusters van fibronectine opmerkelijk helderder dan DI water. Dit resultaat toont aan dat de hydratatie van fibronectine maakt de watermoleculen rondom het biomolecuul onderscheiden van de watermoleculen in DI water.
Samengevat heeft dit werk treffend bewijs op proteïne hydratatie geïnduceerde watermolecuul pand wijzigingen voorzien. Dergelijke resultaten kan een verbeterde fundamentele overeenstemming over de structuur, de bouw, en de biologische activiteit van eiwitten geadsorbeerd op een stevige ondergrond in de vloeistof micro-omgeving te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 ml |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 ml |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µl |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 ml |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/ml |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
