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Chemistry

La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Ce travail présente un protocole pour la manipulation de liquides et introduction de l'échantillon à un microcanaux pour in situ à temps de vol des ions secondaires masse analyse par spectrométrie de biomolécules de protéines dans une solution aqueuse.

Abstract

Ce travail démontre la caractérisation in situ de biomolécules de protéines dans la solution aqueuse en utilisant le Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI) et d'ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). Le film de protéine de fibronectine est immobilisé sur la membrane de nitrure de silicium (SiN) qui forme la zone de détection SALVI. Lors de l'analyse TOF-SIMS, trois modes d'analyse ont été menées, y compris haute spatiale spectrométrie de résolution en masse, en deux dimensions (2D) imagerie, et le profilage en profondeur. Les spectres de masse ont été acquises dans les deux modes positif et négatif. eau désionisée a également été analysée comme échantillon de référence. Nos résultats montrent que le film fibronectine dans l'eau a des pics de cluster de l'eau plus distinctes et plus forte par rapport à l'eau seule. des pics caractéristiques des fragments d'acides aminés sont également observables dans la protéine hydratée spectres ToF-SIMS. Ces résultats montrent que l'adsorption des protéines molécule sur une surface peut être étudiée dynamically utilisant SALVI et ToF-SIMS dans le milieu liquide pour la première fois.

Introduction

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L'hydratation est essentielle pour la structure, une conformation, 2 3 et l'activité biologique des protéines. Protéines sans les molécules d'eau qui les entourent ne seraient pas avoir des activités biologiques viables. En particulier, les molécules d'eau interagissent avec la surface et de la structure interne de protéines, et les différents états d'hydratation de protéines font de telles interactions distinctes. 4 L'interaction des protéines avec des surfaces solides est un phénomène fondamental avec des implications dans les nanotechnologies, les biomatériaux et les processus d'ingénierie tissulaire. Des études ont indiqué que les temps des changements conformationnels peuvent se produire en tant que protéine rencontre une surface. ToF-SIMS a été envisagé que la technique qui a le potentiel d'étudier l'interface protéine-solide 7.5. Il est important de comprendre l'hydratation de protéines sur des surfaces solides, qui fournit potentiellement une compréhension fondamentale du mécanisme de leur structure, conformation et biologiqueactivité al.

Cependant, les techniques d'analyse de surface importante sont pour la plupart à base de vide et des applications directes pour les études liquides volatils sont difficiles en raison de l'évaporation rapide de liquide volatil dans l'environnement sous vide. Nous avons développé un vide Interface microfluidique compatible, Système d'analyse à l'interface de vide Liquide (SALVI), pour permettre l'observation directe des surfaces liquides et les interactions liquide-solide en utilisant des ions secondaires spectrométrie de temps de vol de masse (TOF-SIMS). 8- 11 les aspects uniques sont les suivants: 1) la fenêtre de détection est une ouverture de 2-3 um de diamètre et permettant l'imagerie directe de la surface du liquide, 2) la tension de surface est utilisé pour maintenir le liquide dans l'ouverture, et 3) Salvi portable entre plusieurs plates-formes d'analyse. 11,12

SALVI se compose d'un nitrure de silicium (SiN) membrane en tant que zone de détection et un microcanal en polydiméthylsiloxane (PDMS). Il est fabricated dans la salle blanche, et les facteurs de fabrication et de conception clé ont été détaillés dans les documents précédents et les brevets. 8-12 Les applications de TOF-SIMS comme un outil d'analyse ont été démontrées en utilisant une variété de solutions aqueuses et les mélanges de liquides complexes, dont certains qui contenait des nanoparticules. 13-17 précisément, SALVI liquide TOF-SIMS permet dynamique de sondage de l'interface liquide-solide des systèmes vivants biologiques (ie, les biofilms), des cellules individuelles, et l'interface électrolyte solide, ouvrant de nouvelles perspectives pour la phase in situ condensé études, y compris les liquides à l'aide de TOF-SIMS. Cependant, la conception actuelle ne permet pas encore les interactions gaz-liquide. Ceci est une direction pour le développement futur. SALVI a été utilisée pour étudier le film de protéine hydratée dans ce travail pour la première fois.

La fibronectine est une protéine dimère couramment utilisé, constitué de deux monomères à peu près identiques reliées entre elles par une paire de liaisons disulfure, 18 qui is bien connu pour sa capacité à se lier aux cellules. 19,20 Il a été choisi comme système modèle pour illustrer le fait que le film de protéine hydratée pourrait être sondée dynamiquement en utilisant le liquide SALVI TOF-SIMS approche. La solution de protéine a été introduit dans le microcanal. Après une incubation de 12 heures, un film de protéine hydratée formée sur le côté arrière de la membrane SiN. Déminéralisée (DI) a été utilisé pour rincer le canal après l'introduction de protéines. Des informations ont été recueillies auprès de hydratés molécules de protéines de la fibronectine dans le microcanal SALVI utilisant dynamique TOF-SIMS. l'eau DI a également été étudié en tant que témoin de comparer avec les résultats obtenus à partir de couches minces fibronectine hydraté. On a observé des différences marquées entre le film protéique hydratée et de l'eau DI. Ce travail démontre que l'adsorption des protéines sur la surface dans le milieu liquide peut être étudiée en utilisant l'SALVI de roman et de liquide approche TOF-SIMS. Le protocole vidéo est destiné à fournir des conseils techniques pour les gens qui sont intéressésdans l'utilisation de ce nouvel outil d'analyse pour des applications diverses de SALVI avec TOF-SIMS et de réduire les erreurs inutiles dans la manipulation de liquides ainsi que l'acquisition de données TOF-SIMS et l'analyse.

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Protocol

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1. nettoyage et la stérilisation de l'Microchannel SALVI

  1. Stérilisation du Microchannel dans SALVI
    1. Piochez 2 ml de solution aqueuse à 70% d'éthanol dans une seringue, connecter la seringue à l'extrémité d'entrée de SALVI, et injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min. Retirer la seringue en fin d'injection. Ensuite, connectez l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une polyétheréthercétone (PEEK) union. Vous pouvez également utiliser une pompe à seringue pour effectuer la même procédure. Par exemple, régler la vitesse d'écoulement à 100 pi / min.
    2. Gardez le microcanal SALVI rempli d'une solution d'éthanol à 70% à la température ambiante pendant 4 heures.
  2. Présentez déminéralisée (DI) de l'eau dans SALVI
    1. Piochez 2 ml d'eau DI stérilisés dans une seringue, connecter la seringue avec l'entrée de SALVI, et injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min. Retirez la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une union PEEK. Vous pouvez également utiliser une pompe à seringue comme mentionné dansétape 1.1.1.

2. L'immobilisation du film de protéine dans SALVI

  1. Immobiliser le film de protéine dans SALVI
    1. Piochez 2 ml de fibronectine (10 pg / ml dans un tampon phosphate salin, PBS) dans une seringue, connecter la seringue avec l'entrée de SALVI, injecter lentement 1 ml de liquide dans 10 min, retirer la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI utilisant une union PEEK.
    2. Incuber l'SALVI rempli avec la solution de fibronectine dans une boîte de culture propre, garder le plat dans la hotte à température ambiante pendant 12 heures.
    3. Piochez 2 ml d'eau DI stérilisés dans une seringue et connecter la seringue avec l'entrée de SALVI. injecter lentement 1 ml d'eau en 10 minutes, retirer la seringue, et relier l'entrée et la sortie de SALVI.
      Remarque: Si équipé d'un microscope optique, vérifier la SALVI sous le microscope pour veiller à ce que la membrane SiN est intact avant l'analyse TOF-SIMS. Maintenant l'appareil est prêt pour SALVI TOF-SIMS unaly.

3. Installez SALVI dans le sas Chambre TOF-SIMS

Note: Les gants doivent être portés en tout temps lors de la manipulation du dispositif SALVI et de l'installer sur la scène TOF-SIMS pour éviter les contaminations potentielles lors de l'analyse de surface.

  1. Mont SALVI sur la scène
    1. Poser le stade TOF-SIMS sur une surface plane et propre. Mettez le dispositif SALVI sur la scène avec la tranche de silicium et de la membrane SiN vers le haut. Fixer le SALVI aide de quatre pièces de métal de serrage et visser les pièces métalliques qui maintiennent le coin de l'appareil dans la plaque de métal par quatre vis.
    2. Roulez doucement le tube de PTFE relié au canal microfluidique. Utilisez quatre pièces de métal et quatre vis pour maintenir la partie raide vers le bas. Assurez-vous que le dispositif est positionné dans l'espace ouvert sur la scène SIMS afin qu'il ne gêne pas le faisceau d'ions primaires au cours de l'analyse. Image supplémentaires et l'illustration de la fabricat SALVIion et l'installation sont disponibles dans les publications précédentes. 8,9,11
  2. Monter la Coupe de Faraday sur la scène
    1. Fixer la cage de Faraday sur la scène par une vis.
  3. Chargez la scène dans les TOF-SIMS sas Chambre
    1. Ouvrir le sas TOF-SIMS, détenir et préparer le terrain à l'horizontale sur la plate-forme de chargement, et fermer la porte du sas.

4. TOF-SIMS d'acquisition de données

  1. Tournez sur la pompe à vide et d'assurer vide approprié (par exemple, de l'ordre de 10 -6 mbar ou Torr) est atteinte dans la chambre de sas.
  2. Déplacer le SALVI dans la chambre principale une fois que le vide se stabilise au bout d'environ 30 min.
    Remarque: Le vide doit être inférieure à 5 x 10 -6 mbar vide dans la chambre principale lors de l'acquisition des données. Dans le cas contraire, le vide élevé est indicatif d'une fuite dans le système SALVI.
  3. Régler le faisceau d'ions primaires et d'un analyseur de ToF-SIMS avec unrésolution spatiale d'environ 400 nm selon les recommandations du fabricant. Le courant du faisceau primaire est de 1200 pA tandis que le temps de cycle est de 30 microsecondes de moins de mode DC.
    Remarque: Ce processus suit en grande partie les recommandations du fabricant.
  4. Trouver le canal microfluidique en utilisant le microscope optique. Utilisez le centre optique de l'image de référence et l'aligner à être compatible avec le centre de l'image d'ions secondaires.
  5. Avant chaque mesure, utiliser un 1 keV O 2 + faisceau (~ 40 nA) pour numériser sur la fenêtre SiN avec une zone de 500 x 500 um 2 pour ~ 15 sec pour éliminer la contamination de surface. En outre, utiliser un canon de saturation d'électrons pour compenser la charge de la surface lors de toutes les mesures. Utilisez la fonction automatique de l'arme à feu contre les inondations dans le mode par défaut pour cette étape.
  6. Sélectionnez le mode positif ou négatif avant l'acquisition de données. Utilisez le keV Bi 3 + faisceau 25 que le faisceau d'ions primaires dans toutes les mesures.
    Remarque: Les étapes sont similaires fou des acquisitions de données positives et négatives. Pour l'intérêt de l'espace, le mode positif est décrit en détail ici.
    1. profondeur de profilage
      1. Scannez le + faisceau Bi 3 sur une zone ronde avec un diamètre de ~ 2 um avec 32 pixels par la résolution 32 pixels.
      2. Pour réduire au minimum le temps nécessaire pour percer à travers la membrane-SiN, en utilisant une largeur d'impulsion longue (par exemple, 180 ns, le courant du faisceau ~ 1,0 Pa à une durée de cycle de 100 ps) 3 + Bi faisceau. Les intensités des ions secondaires représentant de l'augmentation de la surface du liquide lorsque punch-through est atteint. Le temps de percement varie de 300 s à 500 s, en fonction de la charge de la membrane SiN.
        Remarque: Cette différence semble être liée au lot de membranes SiN acquises selon notre expérience. Cependant, le temps de punch-through n'a pas vraiment d'incidence sur l'analyse de données.
      3. Après la membrane SiN punch-through, garder le même courant pendant environ 200 secondes pourobtenir suffisamment de données pour images 2D reconstructions.
      4. Réduire la largeur d'impulsion de 80 ns pour la collecte de données pour acquérir des spectres avec une meilleure résolution en masse. Continuer cette acquisition pour environ 200 autres sec. Les données spectrales représentées sur la figure 1 sont obtenus à partir de cette région.
    2. Imagerie 2D et spectres de masse
      1. Recueillir l'imagerie 2D et des données de spectre de masse en même temps lors de la mesure des données de profondeur de profilage. L'instrument TOF-SIMS enregistre toutes les informations de chaque point pendant l'expérience. Les données sont présentées dans des fenêtres différentes (Fpanel - Spectra, Fpanel - Profils et Fpanel - Images séparément) du logiciel de commande numérique. Vérifier les données dans chaque panneau judicieusement lors de l'acquisition de données.

Analyse 5. TOF-SIMS de données

Remarque: L'analyse des données est tout d'abord effectuée en utilisant le logiciel instrumental IonToF ToF-SIMS.

  1. Ouvrez l'unlogiciel de alyse de SIMS (Mesure Explorer), puis cliquez sur les «profils», «boutons d'image« spectres »et«, respectivement, pour traiter profil de profondeur, m / z spectre, et des données d'image.
  2. Ouvrez les fichiers de données qui portent l'extension ".ita".
  3. Sélectionnez pics d'intérêt, tapez le nom de l'espèce dans la case "ionique", et les étiqueter avec des couleurs différentes dans le spectre. Utilisez la molette de la souris pour faire glisser le long de l'axe des x. Utilisez Ctrl et molette de défilement pour ajuster la hauteur des pics et des largeurs. Lettre commutateurs "L" entre les modes linéaires et identifier le long de l'axe des ordonnées.
  4. Mener la reconstruction de données avant l'étalonnage de masse. Dans le cas contraire, il est difficile de choisir l'espacement entre les pics dans l'étape de calibrage de masse.
    1. Sélectionnez les données de profondeur de profilage d'intérêt et de reconstruire les spectres en fonction de la profondeur des séries temporelles profil.
    2. Cliquez sur le bouton de reconstruction. Dans la fenêtre "Démarrer la reconstruction", type dans une plage de balayage de intEREST. Cliquez sur "OK" pour reconstruire les données de profil de profondeur.
  5. Effectuer un étalonnage de masse. Appuyez sur "F3" pour ouvrir la fenêtre "d'étalonnage de masse". Choisissez pics pour l'étalonnage sur la base de l'échantillon spécifique. 21 Dans ce travail, utiliser les pics suivants CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) et H 13 O 6 + (m / z 109) pour le mode positif. Utiliser la pics CH suivante - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), et C 4 H - (m / z 49) pour le mode négatif.
    1. Sélectionnez un pic,Assurez-vous que la flèche vers le bas est pointé sur la crête dans le coin inférieur gauche de la fenêtre. Cliquez sur ce pic et tapez le nom de crête dans la fenêtre "d'étalonnage de masse", cliquez sur "Ajouter", et l'ion d'intérêt est inclus dans l'étalonnage de masse.
    2. Enfin, cliquez sur le bouton "Recalibrate". Vérifiez si les surfaces des pics sont dans les bons endroits en fonction de leur rapports masse sur charge. Dans le menu "Spectrum", sélectionnez et cliquez sur "Appliquer Mass Calibration" à "tous les spectres" ou "spectres sélectionnés", en fonction de l'analyse spécifique en cours.
  6. Comme la sélection pic est nécessaire pour l'analyse de l'échantillon, déterminer des pics caractéristiques de l'échantillon en fonction de la littérature ou d'autres résultats précédents. Comparer l'intensité des pics d'intérêt dans le m / z spectres. Si nécessaire, ajouter de nouveaux sommets ou supprimer sommets inutiles dans la liste de pointe.
    1. Ajouter pics. Cliquez sur un pic, trouver les lignes rouges à la fenêtre en bas à gauche. Hold la touche "Ctrl", faire défiler horizontalement la souris pour définir la largeur de pic, ce qui ajoute un pic à la liste de pointe automatiquement. Une autre façon d'ajouter un pic est de sélectionner un pic dans la fenêtre du spectre principal, puis cliquer sur le bouton "ajouter pic" au-dessus de la fenêtre. S'il y a beaucoup de sommets à ajouter, dans le menu "Spectrum", cliquez sur "Recherche pics", vérifier les spécifications relatives à la nouvelle fenêtre ouverte, puis ajouter des pics en fonction des besoins.
    2. Pour exporter une liste de pointe, dans le menu "Liste Peak", sélectionnez "Enregistrer ..." la liste de pointe dans le format "itmil". Utilisez le bouton gauche Ctrl et faire glisser le long du spectre. Dans la fenêtre de spectres, sélectionner un pic d'intérêt et faites glisser les deux lignes en pointillés à des postes souhaitables.
    3. Pour importer une liste de pointe, dans le menu "Mass Liste intervalle", choisissez "Importer ...", localiser un fichier de liste de pointe existant avec l'extension de fichier ".ITPL". Cliquez sur "Ouvrir".
    4. Pour utiliser un "itmil" liste de pics, dansle menu "Mass Liste Interval", cliquez sur "Open ...", trouver le fichier, puis cliquez sur «Ouvrir».
  7. Appliquer une liste de pointe pour analyser d'autres données. Au fond à gauche de la fenêtre "Spectra", il y a une fenêtre appelée "messe Intervalle Liste". La liste de pointe importé est représenté ici.
    1. Cliquez droit sur le fichier de liste de crête à être utilisé, l'appliquer au "spectre actif" ou "tous les spectres".
  8. Consultez les profils de données. Dans le "profil" fenêtre, utilisez la lettre "M" pour adapter à la fenêtre (de gamme) et la lettre "N" pour répondre à l'axe des ordonnées. Utilisez Ctrl et molette de défilement pour ajuster la largeur de profil. Ou utiliser "/" et "*" sur le clavier pour modifier la plage de l'axe y et la hauteur.
  9. Export des données pour tracer outre l'utilisation d'un autre logiciel graphique après l'analyse initiale.
    1. Pour exporter un profil de profondeur, dans le "profil" fenêtre, cliquez sur le menu "Fichier", puis sélectionnez "Export & #34 ;, puis sélectionnez "Enregistrer sous" un fichier ".txt".
    2. Pour exporter un fichier de spectre m / z, dans la fenêtre "Spectra", cliquez sur le menu "Fichier", puis sélectionnez "Exporter", puis sélectionnez "Enregistrer sous" un fichier ".txt".
    3. Pour exporter un fichier d'image, dans la fenêtre, l'écran d'impression "Image" et enregistrez le fichier image.

6. TOF-SIMS données de traçage et présentation

Remarque: Utilisez un outil graphique pour tracer les données après les données SIMS sont traitées en utilisant le logiciel instrumentale.

  1. Utilisez un outil graphique pour importer les données.
  2. Faites un terrain en utilisant le m / z comme axe des x et le pic d'intensité que l'axe des ordonnées pour montrer le spectre reconstruit. Un exemple est donné sur la figure 1.
  3. Faites un terrain en utilisant le temps de pulvérisation que l'axe des x et le pic d'intensité que l'axe des ordonnées pour montrer le profil de profondeur série temporelle reconstruite. Un exemple est donné dans Figure 2.
  4. Combiner des images 2D reconstruites des différents m / z et former une matrice pour montrer la cartographie d'ions. Un exemple est donné sur la figure 2.

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Representative Results

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Un couple de résultats représentatifs sont présentés pour démontrer les avantages du protocole proposé. En utilisant l'interface microfluidique SALVI, le faisceau d'ions primaires (Bi + 3) peut bombarder directement sur ​​le film de fibronectine hydraté dans de l'eau DI. Ainsi, la cartographie chimique moléculaire de la surface du liquide peut être acquis avec succès.

Figure 1a et 1b montrent la TOF-SIMS spectres de masse positive de l'eau du film de fibronectine et DI hydratée, respectivement. Les pics d'intérêt, y compris les clusters de l'eau (c.-à m / z 19, 37, 55, 73, 91 et 109) des fragments et amino-acides (par exemple, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 et 98) sont indiqués par des flèches rouges. En plus des pics caractéristiques des fragments d'acides aminés, qui ont été largement rapportés en utilisant des échantillons de protéines sèches, les sommets des clusters d'eau sont observées dans lespectres de masse d'un film de fibronectine hydraté dans de l'eau DI. En outre, les intensités de ces pics de la grappe de l'eau sont très différentes de celles dans les spectres de masse d'eau DI. Ce résultat fournit la preuve directe de la propriété des molécules d'eau environnantes et à l'intérieur des molécules de protéines hydratées qui jouent un rôle dans leur adsorption sur une surface.

La figure 2a montre le profil de profondeur de séries chronologiques du film de la fibronectine et de l'eau DI hydraté. Comme l'échantillon est sous la membrane SiN, les intensités des ions sélectionnés seconde sont négligeables devant la membrane SiN est poinçonnée par (ie, 280 s pour la fibronectine et 340 s pour l'eau DI). Une fois la membrane SiN est poinçonné à travers, les intensités de ces ions secondaires augmentent de manière significative. Lors de l'utilisation la longue largeur d'impulsion, la résolution en masse est relativement faible. Par conséquent, le processus de sa largeur d'impulsion est utilisé pour obtenir des données avec une meilleure résolution en massepour l'image et spectre reconstructions comme le montre la figure 2a. Après une période de temps (par exemple, 60 secondes pour la fibronectine et 220 s pour l'eau DI), la largeur d'impulsion réduite est utilisée pour obtenir m / z spectres avec une meilleure résolution en masse. Les finales m / z spectres ont été reconstruits à partir de 200 mesures sec surlignés en vert les zones ombragées dans la série temporelle de profil de profondeur. Figure 2b montre les images 2D du film de fibronectine hydraté et de l'eau DI, qui correspondent à la zone verte ombrée de la figure 2a. Ces images 2D représentent les chiffres de ions secondaires choisis parmi l'échantillon: l'image est lumineuse, plus le nombre d'ions secondaires. Ces images intuitifs donnent une comparaison claire des ions secondaires sélectionnés entre les différents échantillons, ce qui est utile dans l'analyse de données. D'après notre expérience, la différence dans le temps SiN percement varie d'un lot à l'autre des membranes SiN. Cependant, il ne modifie pas la resultats de l'analyse dynamique TOF-SIMS.

Figure 1
Figure 1: Comparaison des spectres positif ToF-SIMS du film de la fibronectine et de l'eau DI hydraté dans le microcanal SALVI (a) la reconstitution m / z du spectre de la fibronectine.. (B) Le spectre de l'eau DI.

Figure 2
Figure 2:. Profils de profondeur et des images 2D de la fibronectine hydraté et de l'eau DI (a) Le profilage des séries chronologiques de la profondeur de la fibronectine et de l'eau DI en mode positif. (B) reconstruire des images 2D correspondant au vert ombrée 200 segments de temps sec le long de la série temporelle du profil de profondeur (a). Plusieurs masse caractéristique pour charger ratios pertinents pour clusters d'eau(Par exemple, m / z 1, 19, 37, 55) sont présentés dans plus de fragments d'acides aminés connus (par exemple, m / z 30, 83, 98). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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SALVI est une interface qui permet microfluidique surface du liquide dynamique et liquide-solide analyse d'interface par des instruments d'aspiration en fonction, comme TOF-SIMS et microscopie électronique à balayage (MEB). En raison de l'utilisation de petites ouvertures pour exposer liquide directement dans le vide, SALVI est adapté à de nombreuses techniques de spectroscopie et imagerie finement ciblées sans aucune modification; 22 la portabilité et la polyvalence de la microfluidique en font une véritable plate-forme d'imagerie multimodale. Caractéristiques distinctes et l'importance de SALVI par rapport à d'autres techniques existantes sont résumés dans plusieurs études récentes. 22-25 En tant que développeur de la technologie SALVI, notre groupe a appliqué activement à une variété d'études impliquant des surfaces de liquides dynamiques et des interfaces liquide-solide . Quelques exemples de nouvelles applications comprennent les membranes des cellules de mammifères, les bactéries de biofilm, 15,16 fixation ou la formation de nanoparticules à la suite d'oxydation de surface aqueux. Dans ce papar, nous présentons les premiers résultats liquide TOF-SIMS de la protéine film mince hydraté adsorbé sur la surface de SiN.

Il est tout à fait essentiel de manipuler avec soin les étapes mises en évidence dans le protocole. Par exemple, lors de l'élaboration de liquide dans la seringue dans les étapes 1 et 2, assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles à l'intérieur de la seringue. Parce qu'une fois que les bulles sont injectées dans SALVI, ils peuvent induire une fuite dans le vide. 9 Ainsi, si les bulles sont observées, il est prudent de se débarrasser d'eux en définissant la seringue en position verticale et en poussant doucement les bulles. En outre, il est très important de faire la fenêtre SiN dans SALVI plat pour optimiser l'analyse TOF-SIMS, tel que décrit à l'étape 3. Cette aplomb de la zone de détection influe directement sur ​​la qualité des données en fonction de la conception de TOF-SIMS. 26 Il est nécessaire d'inspecter visuellement le dispositif après avoir obtenu tout sur la scène SIMS. Si la fenêtre de SiN est pas horizontal, régler les vis et changer la hauteurSALVI du dispositif afin d'assurer que tout est dans le même plan que la mesure du possible. Ces points délicats ont besoin d'expérience et de prudence, qui déterminent le succès et la fiabilité de l'ensemble de l'expérience.

Comme le montre la figure 1b, les pics avec m / z 19, 37, 55, 73, 91 et 109 ont des comptes élevés. Cela indique qu'il ya un bon nombre de clusters d'eau (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + et H 13 O 6 +) dans le positif ions secondaires. Les autres clusters d'eau (données non présentées) avec la hausse valeurs m / z ont également des pics relativement forts par rapport à leurs pics voisins. Ces grandes quantités de clusters d'eau sont émis à partir de la surface de l'eau désionisée après le percement SiN. signaux à sous-munitions de l'eau dans le mode positif n'a pas été observé dans la précédente work; et cela a été attribuée aux faibles taux d'ions secondaires et non optimisée TOF-SIMS conditions dans le passé. 8 Avec l'effort continu dans l'optimisation des conditions d'acquisition Salvi TOF-SIMS comme le faisceau d'ions primaires (c.-à-Bi + vs . Bi 3 +), largeur d'impulsion et les conditions actuelles pendant le profilage en profondeur, il est maintenant possible d'observer jusqu'à 44 clusters d'eau dans le mode positif en utilisant les conditions présentées dans ce document. Les résultats présentés ici sont prometteurs d'étudier plus avant le rôle de l'eau dans la dynamique de diverses molécules biologiques et les systèmes biologiques.

Voici à titre d'exemple pour illustrer les avantages de SALVI et TOF-SIMS dans l'étude de la dynamique moléculaire biologiques, l'hydratation de la protéine de fibronectine a été présenté. Les pics de m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, et 98 appartiennent à des fragments d'acides aminés selon le précédent rapport, 27,28 qui sont beaucoup plus forts que ceux de DI water le montre la figure 1b. Cette différence dans l'intensité accrue des fragments d'acide aminé dans l'échantillon de la fibronectine suggère que ces ions secondaires sont en effet parmi les protéines elles-mêmes. En outre, les sommets des clusters d'eau de la figure 1a sont beaucoup plus fortes que celles de l'eau DI à la figure 1b, ce qui implique que les propriétés des molécules d'eau à la surface des protéines d'adsorption et une solution interfaciale peuvent être très différentes de celles dans l'eau pure.

Figure 2a montre représentant le profilage en profondeur série temporelle de deux échantillons différents: la fibronectine et de l'eau déminéralisée dans le microcanal SALVI. Les données de profilage de profondeur ont été recueillies dans la fenêtre SiN était bombardée par le faisceau d'ions + Bi 3 primaire avec la longue largeur d'impulsion. Comme on le voit sur ​​la figure 2a, la fenêtre SiN est poinçonné à travers à environ 300 secondes. Avant la fenêtre SiN dans SALVI est poinçonné through, les intensités des ions secondaires sélectionnées sont assez bas. Une fois la fenêtre SiN est poinçonné à travers, les intensités des ions secondaires augmentent immédiatement que la surface du liquide commence à être bombardée par le faisceau d'ions primaires. Par exemple, les intensités de H + et H 3 O + montrent une forte augmentation, ce qui indique l'observation de la surface de l'eau. 8,9 Bien que les intensités sont instable juste après la punch-through ou à l'interface, ils peuvent atteindre relativement stable les valeurs après une période de temps (par exemple, 60 secondes pour la fibronectine et 220 s pour l'eau DI, respectivement, sur la figure 2a). La différence dans le long largeur d'impulsion de forage n'a pas vraiment d'incidence sur les résultats d'analyse illustrés ici lors de la reconstruction m / z spectres (par exemple, la figure 1), parce que les m / z spectres efficaces sont acquises après le péché punch-through. Cependant, un chercheur peut choisir d'utiliser les mêmes conditions pour tous les échantillons for la cohérence et de facilité dans le choix des sections de données lors de l'analyse des données. Afin d'obtenir une meilleure résolution de masse, la largeur d'impulsion a ensuite été réduit et les intensités sont diminuées en conséquence dans la dernière partie de l'expérience, la profondeur de profilage. Les séries chronologiques de profil de profondeur ont été collectées en continu pour un autre 200 sec pour fournir des données suffisantes pour m / z analyse spectrale. Les segments de temps que m / z spectres ont été reconstruits sont mis en évidence dans les zones vertes ombragée.

La fibronectine a été largement utilisé pour l'adsorption de surface avant la culture de cellules; De nombreuses études ont montré la fibronectine est responsable de l'adhésion cellulaire et des interactions de cellules biomatériau. 19,20,29 Une étude récente a caractérisé l'épaisseur de la fibronectine adsorbé sur brosses poly (méthacrylate hydroxyléthyl) en utilisant ellipsométrie. Le film mince fibronectine a été établie à 3-12 nm d'épaisseur. 30 telle épaisseur est raisonnable pour l'analyse approfondie de profilage dans une solu aqueusetion. 8,9 Avec le développement de SALVI, analyse directe de la protéine hydratée adsorbé sur la surface solide est désormais possible. Cette approche potentiellement peut avoir de nombreuses applications dans l'étude des interactions des protéines avec des surfaces solides dynamiquement.

Figure 2b montre les images 2D sélectionnés de différents ions secondaires à partir d'échantillons de fibronectine et de l'eau DI, respectivement. Images 2D sont obtenus à partir des profils en profondeur des données temporelles en vert les zones ombragées à la figure 2a, qui correspondent à la surface du liquide après le péché punch-through comme décrit précédemment. Les images des ions secondaires de fragments d'acides aminés choisie CH 4 N +, C 5 H 7 O + et C 4 H 4 NO 2 + (par exemple, m / z 30, 83 et 98) pour la couche mince de la fibronectine étaient beaucoup plus lumineux que ceux pour l'eau DI. Ceci indique que les ions secondaires de fragments d'acides aminés sont observées felon les molécules de fibronectine à l'intérieur de l'ouverture 2 um de diamètre. En outre, les images de pics sélectionnés (par exemple, m / z 1, 19, 37 et 55) correspondant à plusieurs pôles de l'eau de la fibronectine sont remarquablement plus brillantes que celles de l'eau DI. Ce résultat démontre que l'hydratation de la fibronectine rend les molécules d'eau entourant la biomolécule distincte des molécules d'eau dans l'eau DI.

En résumé, ce travail a fourni une preuve frappante de protéines hydratation eau induit des modifications de propriété molécule. Ces résultats pourraient fournir une meilleure compréhension fondamentale de la structure, la conformation et l'activité biologique des protéines adsorbées sur une surface solide dans le microenvironnement liquide.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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<em>La caractérisation in situ</em> des protéines hydratés dans l&#39;eau par Salvi TOF-SIMS
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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