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Chemistry

साल्वी और TOF-एस द्वारा पानी में हाइड्रेटेड प्रोटीन की सीटू लक्षण वर्णन में

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

इस काम के बगल में समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन biomolecules के एक जलीय घोल में विश्लेषण के लिए एक microchannel के लिए तरल से निपटने और नमूना परिचय के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

Abstract

इस काम तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी) और समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (TOF-एस) के विश्लेषण के लिए प्रणाली का उपयोग करते हुए जलीय घोल में प्रोटीन biomolecules के लक्षण वर्णन में सीटू को दर्शाता है। फ़ाइब्रोनेक्टिन प्रोटीन फिल्म सिलिकॉन नाइट्राइड (पाप) झिल्ली है कि सालवी का पता लगाने क्षेत्र रूपों पर स्थिर था। TOF-एस विश्लेषण के दौरान, विश्लेषण के तीन मोड उच्च स्थानिक संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री, दो आयामी (2 डी) इमेजिंग, और गहराई रूपरेखा सहित आयोजित की गई। जन स्पेक्ट्रा सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में हासिल किया गया। विआयनीकृत पानी भी एक संदर्भ के रूप में नमूना विश्लेषण किया गया था। हमारे परिणाम है कि पानी में फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म अकेले पानी की तुलना में अधिक विशिष्ट और मजबूत पानी क्लस्टर चोटियों है दिखाने के लिए। एमिनो एसिड के टुकड़े की विशेषता चोटियों भी हाइड्रेटेड प्रोटीन TOF-एस स्पेक्ट्रा में प्रत्यक्ष कर रहे हैं। इन परिणामों के उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि एक सतह पर प्रोटीन अणु सोखना Dynamica अध्ययन किया जा सकताlly पहली बार के लिए तरल वातावरण में साल्वी और TOF-एस का उपयोग कर।

Introduction

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जलयोजन संरचना, 1 रचना, 2 और प्रोटीन की जैविक गतिविधि 3 के लिए महत्वपूर्ण है। उन्हें आसपास के पानी के अणुओं के बिना प्रोटीन व्यवहार्य जैविक गतिविधियों के लिए नहीं होता। विशेष रूप से, पानी के अणुओं को सतह और प्रोटीन की आंतरिक संरचना के साथ बातचीत, और प्रोटीन के विभिन्न राज्यों हाइड्रेशन ऐसी बातचीत अलग बनाते हैं। 4 ठोस सतहों के साथ प्रोटीन की बातचीत नैनो, biomaterials और ऊतक इंजीनियरिंग प्रक्रियाओं में प्रभाव के साथ एक मौलिक घटना है। अध्ययनों से पता लंबे समय से एक प्रोटीन के रूप में एक सतह का सामना करना पड़ता गठनात्मक परिवर्तन हो सकता है कि संकेत दिया है। TOF-एस तकनीक प्रोटीन ठोस इंटरफेस का अध्ययन करने की क्षमता है कि के रूप में कल्पना की गई है। यह ठोस सतहों 5-7, जो संभवतः उनकी संरचना की व्यवस्था की एक बुनियादी समझ प्रदान करता है पर प्रोटीन के हाइड्रेशन समझने के लिए महत्वपूर्ण है, रचना, और जीवविज्ञानअल गतिविधि।

हालांकि, प्रमुख सतह विश्लेषणात्मक तकनीकों ज्यादातर वैक्यूम आधारित होते हैं और वाष्पशील तरल के अध्ययन के लिए सीधे आवेदन निर्वात वातावरण के तहत अस्थिर तरल का तेजी से वाष्पीकरण के कारण मुश्किल हो जाता है। हम एक निर्वात संगत microfluidic इंटरफेस प्रणाली विश्लेषण के लिए तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी) में, तरल सतहों और तरल ठोस बातचीत समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (TOF-एस) का उपयोग करने का सीधा टिप्पणियों सक्षम करने के लिए विकसित की है,। 8 , 2) सतह तनाव, एपर्चर के भीतर तरल धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है 1) का पता लगाने खिड़की तरल सतह के प्रत्यक्ष इमेजिंग की अनुमति के व्यास में 2-3 माइक्रोन का एक छेद है और 3) सालवी है: 11 अद्वितीय पहलुओं में निम्नलिखित शामिल कई विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों के बीच पोर्टेबल। 11,12

सालवी का पता लगाने क्षेत्र और एक microchannel polydimethylsiloxane (PDMS) से बना के रूप में एक सिलिकॉन नाइट्राइड (पाप) झिल्ली से बना है। यह fabr हैसाफ कमरे में icated, और निर्माण और महत्वपूर्ण डिजाइन कारकों पिछले कागजात और पेटेंट में विस्तृत किया गया है। 8-12 एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में TOF-एस के आवेदनों जलीय समाधान और जटिल तरल मिश्रण, कुछ की एक किस्म का उपयोग प्रदर्शन किया गया जो नैनोकणों निहित। 13-17 विशेष रूप से, साल्वी तरल TOF-एस को लाइव जैविक प्रणालियों (यानी, biofilms), एकल कक्षों, और ठोस इलेक्ट्रोलाइट इंटरफेस के तरल ठोस इंटरफेस की जांच कर रही गतिशील अनुमति देता है, सीटू सघन चरण में के लिए नए अवसर खोलने TOF-एस का उपयोग कर तरल पदार्थ सहित अध्ययन करता है। हालांकि, मौजूदा डिजाइन अभी तक गैस तरल बातचीत की अनुमति नहीं देता। यह भविष्य के विकास के लिए एक दिशा है। साल्वी ने पहली बार इस काम में हाइड्रेटेड प्रोटीन फिल्म अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

फ़ाइब्रोनेक्टिन आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीन डिमर है, दो लगभग समान डाइसल्फ़ाइड बांड की एक जोड़ी से जुड़े monomers, 18 से मिलकर जो मैंकोशिकाओं के लिए बाध्य करने की क्षमता के लिए जाना जाता रहा है। 19,20 यह एक मॉडल प्रणाली के रूप में चुना गया था वर्णन करने के लिए है कि हाइड्रेटेड प्रोटीन फिल्म गतिशील सालवी तरल TOF-एस दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा सकती है। प्रोटीन समाधान microchannel में पेश किया गया था। 12 घंटे के लिए incubating के बाद, एक हाइड्रेटेड प्रोटीन फिल्म पाप झिल्ली के पीछे की ओर का गठन। विआयनीकृत (डीआई) पानी प्रोटीन शुरूआत के बाद चैनल बंद कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सूचना हाइड्रेटेड गतिशील TOF-एस का उपयोग कर सालवी microchannel में फ़ाइब्रोनेक्टिन प्रोटीन अणुओं से एकत्र किया गया था। डि पानी भी एक नियंत्रण हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन पतली फिल्म से प्राप्त परिणामों के साथ तुलना करने के लिए के रूप में अध्ययन किया गया था। स्पष्ट मतभेद हाइड्रेटेड प्रोटीन फिल्म और डि पानी के बीच मनाया गया। इस काम को दर्शाता है कि तरल वातावरण में सतह पर प्रोटीन सोखना उपन्यास साल्वी और तरल TOF-एस दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। वीडियो प्रोटोकॉल लोग हैं, जो रुचि रखते हैं के लिए तकनीकी मार्गदर्शन प्रदान करने का इरादा हैTOF-एस के साथ सालवी की विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस नए विश्लेषणात्मक उपकरण के उपयोग और TOF-एस डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तरल से निपटने में अनावश्यक गलतियों को कम करने में।

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Protocol

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1. सफाई और साल्वी Microchannel का बंध्याकरण

  1. सालवी में Microchannel का बंध्याकरण
    1. एक सिरिंज में 70% इथेनॉल के जलीय समाधान के 2 मिलीलीटर ड्रा, साल्वी के इनलेट अंत के साथ सिरिंज कनेक्ट है, और धीरे-धीरे 10 मिनट में तरल के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। इंजेक्शन के अंत में सिरिंज निकालें। इसके बाद, इनलेट और आउटलेट सालवी की एक polyetheretherketone (तिरछी) यूनियन का उपयोग कर कनेक्ट। वैकल्पिक रूप से, एक ही प्रक्रिया का संचालन करने के लिए एक सिरिंज पंप का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, 100 μl / मिनट में प्रवाह की गति निर्धारित किया है।
    2. 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल समाधान के साथ भरा सालवी microchannel रखें।
  2. सालवी में Deionized (डीआई) जल का परिचय
    1. एक सिरिंज में निष्फल डि पानी के 2 मिलीलीटर ड्रा, साल्वी के प्रवेश के साथ सिरिंज कनेक्ट है, और धीरे-धीरे 10 मिनट में तरल के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। सिरिंज निकालें, और एक तिरछी नज़र यूनियन का उपयोग कर इनलेट और साल्वी की दुकान से कनेक्ट। वैकल्पिक रूप से, एक सिरिंज पंप का उपयोग के रूप में उल्लेख किया हैकदम 1.1.1।

2. सालवी में प्रोटीन फिल्म का स्थिरीकरण

  1. सालवी में प्रोटीन फिल्म स्थिर
    1. (10 माइक्रोग्राम फॉस्फेट बफर खारा में / एमएल, पीबीएस) एक सिरिंज में समाधान फ़ाइब्रोनेक्टिन के 2 मिलीलीटर ड्रा, साल्वी के प्रवेश के साथ सिरिंज कनेक्ट करते हैं, धीरे-धीरे 10 मिनट में तरल के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन, सिरिंज को हटाने, और इनलेट कनेक्ट और साल्वी की दुकान एक तिरछी नज़र यूनियन का उपयोग कर।
    2. एक साफ संस्कृति डिश में फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के साथ भरा सालवी सेते हैं, 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हुड में पकवान रहते हैं।
    3. एक सिरिंज में निष्फल डि पानी के 2 मिलीलीटर ड्रा और साल्वी के प्रवेश के साथ सिरिंज कनेक्ट। धीरे-धीरे 10 मिनट में पानी के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन सिरिंज को हटाने, और इनलेट और साल्वी की दुकान से कनेक्ट।
      नोट: यदि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित, खुर्दबीन के नीचे सालवी की जांच सुनिश्चित करने के लिए कि पाप झिल्ली TOF-एस विश्लेषण से पहले बरकरार है। अब सालवी डिवाइस के लिए तैयार है TOF-एस एकalysis।

3. TOF-एस Loadlock चैंबर में सालवी स्थापित करें

नोट: दस्ताने हर समय पहना जाना चाहिए जब सालवी डिवाइस से निपटने और सतह के विश्लेषण के दौरान संभावित संदूषण से बचने के लिए TOF-एस मंच पर इसे स्थापित।

  1. स्टेज पर माउंट साल्वी
    1. एक फ्लैट और साफ सतह पर TOF-एस चरण निर्धारित करना। सिलिकॉन वेफर और पाप झिल्ली ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ मंच पर सालवी डिवाइस रखो। सालवी चार धातु clamping टुकड़ों का उपयोग फिक्स और धातु की थाली में चार शिकंजा द्वारा डिवाइस के कोने पकड़े धातु के टुकड़े पेंच।
    2. धीरे PFTE microfluidic चैनल से जुड़े ट्यूबिंग रोल। कड़ी हिस्सा नीचे पकड़ करने के लिए चार धातु के टुकड़े और चार शिकंजा प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि डिवाइस एस मंच पर खुली जगह में तैनात है ताकि यह विश्लेषण के दौरान प्राथमिक आयन बीम के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। अतिरिक्त छवि और साल्वी fabricat का चित्रणआयन और स्थापना पिछले प्रकाशनों में उपलब्ध हैं। 8,9,11
  2. मंच पर फैराडे कप माउंट
    1. एक पेंच द्वारा मंच पर फैराडे कप को ठीक करें।
  3. स्टेज में लोड TOF-एस Loadlock चैंबर
    1. TOF-एस loadlock खोलें, पकड़ और लदान मंच पर क्षैतिज मंच तैयार है, और loadlock दरवाजा बंद करो।

4. TOF-एस डाटा अधिग्रहण

  1. वैक्यूम पंप पर बारी और उपयुक्त वैक्यूम सुनिश्चित (जैसे, 10 -6 मिलीबार या Torr के आदेश पर) loadlock कक्ष में पहुँच जाता है।
  2. एक बार वैक्यूम के बारे में 30 मिनट के बाद स्थिर है सालवी मुख्य कक्ष में ले जाएँ।
    नोट: वैक्यूम डाटा अधिग्रहण के दौरान मुख्य कक्ष में कम से कम 5 एक्स 10 -6 मिलीबार वैक्यूम होना चाहिए। अन्यथा, उच्च वैक्यूम सालवी प्रणाली में एक दरार का संकेत है।
  3. एक साथ प्राथमिक आयन बीम और TOF-एस के विश्लेषक समायोजित करेंनिर्माता की सिफारिशों के अनुसार लगभग 400 एनएम के स्थानिक संकल्प। जबकि समय चक्र डीसी मोड के तहत 30 μsec है प्राथमिक किरण के मौजूदा 1,200 प्रति वर्ष है।
    नोट: इस प्रक्रिया में बड़े पैमाने पर निर्माता की सिफारिशों के बाद।
  4. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग microfluidic चैनल का पता लगाएं। एक संदर्भ के रूप में ऑप्टिकल छवि केंद्र का उपयोग करें और यह पंक्ति माध्यमिक आयन छवि केन्द्र के अनुरूप हो।
  5. प्रत्येक माप से पहले, ~ के लिए एक 500 x 500 माइक्रोन 2 क्षेत्र के साथ पाप खिड़की पर स्कैन करने के लिए 15 सेकंड के सतह संक्रमण को दूर करने के लिए एक 1 कीव हे 2 + किरण (~ 40 एनए) का उपयोग करें। इसके अलावा, सभी माप के दौरान सतह चार्ज की भरपाई के लिए एक इलेक्ट्रॉन बाढ़ बंदूक का उपयोग करें। इस कदम के लिए डिफ़ॉल्ट मोड में बाढ़ बंदूक का स्वत: समारोह का प्रयोग करें।
  6. डाटा अधिग्रहण से पहले सकारात्मक या नकारात्मक मोड का चयन करें। सभी मापन में प्राथमिक आयन बीम के रूप में 25 कीव द्विपक्षीय 3 + बीम का प्रयोग करें।
    नोट: चरण समान चया सकारात्मक और नकारात्मक डेटा अधिग्रहण। अंतरिक्ष के हित के लिए, सकारात्मक मोड यहाँ विवरण में वर्णित है।
    1. गहराई रूपरेखा
      1. 32 पिक्सल संकल्प द्वारा 32 पिक्सल के साथ ~ 2 माइक्रोन की एक व्यास के साथ एक दौर क्षेत्र पर द्विपक्षीय 3 + किरण स्कैन करें।
      2. समय पंच के माध्यम से पाप झिल्ली की आवश्यकता को कम करने के लिए, एक लंबे पल्स चौड़ाई का उपयोग (यानी, 180 nsec, किरण मौजूदा 1.0 ~ 100 μsec का एक चक्र समय में देहात) द्वि 3 + किरण। तरल सतह वृद्धि से माध्यमिक आयनों प्रतिनिधि की तीव्रता जब पंच के माध्यम से पहुँच जाता है। पंच के माध्यम से समय पाप झिल्ली के बैच के आधार पर 300 सेकंड से 500 सेकंड के लिए भिन्न होता है।
        नोट: यह अंतर हमारे अनुभव के अनुसार पाप का अधिग्रहण झिल्ली के बैच से संबंधित होने लगता है। हालांकि, पंच के माध्यम से समय वास्तव में डेटा विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता।
      3. पाप झिल्ली के बाद पंच के माध्यम से, के बारे में 200 सेकंड के लिए एक ही चालू रखना2 डी छवि पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त करते हैं।
      4. डेटा संग्रह के लिए 80 nsec को पल्स चौड़ाई को कम बेहतर सामूहिक संकल्प के साथ स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए। के बारे में एक और 200 सेकंड के लिए इस अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें। चित्र 1 में दिखाया स्पेक्ट्रम डेटा इस क्षेत्र से प्राप्त कर रहे हैं।
    2. 2 डी इमेजिंग और जन स्पेक्ट्रा
      1. एक ही समय में 2 डी इमेजिंग और जन स्पेक्ट्रा डेटा लीजिए जब गहराई रूपरेखा डेटा को मापने। TOF-एस साधन प्रयोग के दौरान प्रत्येक स्थान की सभी जानकारी बचाता है। डिजिटल नियंत्रण सॉफ्टवेयर की (अलग से छवियाँ - स्पेक्ट्रा, FPanel - - प्रोफाइल और FPanel FPanel) के आंकड़ों के अलग विंडो में दिखाया जाता है। विवेकपूर्ण तरीके से डाटा अधिग्रहण के दौरान प्रत्येक कक्ष में डेटा की जाँच करें।

5. TOF-एस डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण शुरू में IonToF TOF-एस महत्वपूर्ण भूमिका निभाई सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।

  1. एक खुलाएस (मापन एक्सप्लोरर) और उसके बाद की alysis सॉफ्टवेयर क्लिक करें "प्रोफाइल ',' स्पेक्ट्रा 'और' छवि 'बटन, क्रमशः, गहराई प्रोफाइल, मी / z स्पेक्ट्रम, और छवि डेटा की प्रक्रिया करने के लिए।
  2. एक्सटेंशन ".ita" है कि डेटा फ़ाइलों को खोलें।
  3. , ब्याज की चोटियों का चयन करें "आयन" बॉक्स में प्रजाति का नाम टाइप करें, और उन्हें स्पेक्ट्रा में विभिन्न रंगों के साथ लेबल। एक्स अक्ष के साथ खींचें करने के लिए माउस स्क्रॉल व्हील का प्रयोग करें। शिखर ऊंचाई और चौड़ाई को समायोजित करने के लिए Ctrl और पुस्तक पहिया का प्रयोग करें। पत्र "एल" वाई अक्ष के साथ रैखिक और लॉग मोड के बीच स्विच।
  4. बड़े पैमाने पर अंशांकन से पहले आचार डेटा पुनर्निर्माण। अन्यथा, यह बड़े पैमाने पर अंशांकन कदम में चोटियों के बीच रिक्ति चयन करने के लिए मुश्किल है।
    1. ब्याज की गहराई रूपरेखा डेटा का चयन करें और गहराई प्रोफ़ाइल अस्थायी श्रृंखला के अनुसार स्पेक्ट्रा का पुनर्निर्माण किया।
    2. पुनर्निर्माण के बटन पर क्लिक करें। "प्रारंभ पुनर्निर्माण" विंडो में, पूर्णांक के स्कैन रेंज में टाइपerest। क्लिक करें "ठीक है" गहराई प्रोफ़ाइल डेटा को फिर से संगठित करने के लिए।
  5. एक बड़े पैमाने पर अंशांकन प्रदर्शन करना। प्रेस "F3" "जन अंशांकन" खिड़की खोलने के लिए। इस काम में विशिष्ट नमूने के आधार पर जांच के लिए चोटियों चुनें। 21, निम्नलिखित चोटियों का उपयोग सीएच 3 + (मी / z 15), एच 3+ (मी / z 19), सी 2 एच 5 + (मी / z 29 ), एच 5 हे 2 + (मी / z 37), सी 3 एच 7 + (मी / z 43), एच 73 + (मी / z 55), एच 9 हे 4 + (मी / z 71), एच 11 हे 5 + (मी / z 99) और सकारात्मक मोड के लिए एच 13 हे 6 + (मी / z 109)। निम्नलिखित चोटियों सीएच का प्रयोग करें - (मी / z 13), ओ - (मी / z 16), ओह - (मी / z 17), सी 2 एच - (मी / z 25), सी 3 एच - (मी / z 37), और सी 4 एच - नकारात्मक मोड के लिए (मी / z 49)।
    1. एक चोटी का चयन करें,सुनिश्चित करें कि नीचे तीर विंडो के बाएँ नीचे कोने में चोटी पर बताया जाता है। क्लिक करें "जोड़ें" उस चोटी पर क्लिक करें और "बड़े पैमाने पर अंशांकन" खिड़की में चोटी का नाम टाइप करें, और ब्याज की आयन मास अंशांकन में शामिल है।
    2. अंत में, "recalibrate" बटन पर क्लिक करें। जाँच करें अगर चोटियों के क्षेत्रों उनके द्रव्यमान के अनुपात में चार्ज करने के लिए के अनुसार सही स्थानों में हैं। "स्पेक्ट्रम" मेनू में, का चयन करें और क्लिक करें "लागू मास कैलिब्रेशन" "सभी स्पेक्ट्रा" या "चयनित स्पेक्ट्रा", विशिष्ट विश्लेषण के आधार पर आयोजित किया जा रहा है।
  6. शिखर चयन नमूना विश्लेषण के लिए आवश्यक है के रूप में, साहित्य या अन्य पिछले निष्कर्षों के अनुसार नमूने की विशेषता चोटियों का निर्धारण। मी / z स्पेक्ट्रा में ब्याज की चोटियों की तीव्रता की तुलना करें। यदि आवश्यक हो, नए चोटियों चोटी सूची में बेकार चोटियों जोड़ने या हटाने के।
    1. चोटियों जोड़ें। एक चोटी पर क्लिक करें, छोड़ दिया नीचे खिड़की पर लाल लाइनों पाते हैं। Holडी "Ctrl" कुंजी, शिखर चौड़ाई, जो स्वचालित रूप से चोटी की सूची पर एक चोटी कहते हैं परिभाषित करने के लिए क्षैतिज माउस स्क्रॉल। एक अन्य तरीका है एक चोटी से जोड़ने के लिए खिड़की के ऊपर क्लिक करने के लिए "पीक जोड़ें" बटन मुख्य स्पेक्ट्रम खिड़की में एक चोटी का चयन करें, और उसके बाद है। नए खुले विंडो में "स्पेक्ट्रम" मेनू में जोड़ने के लिए, "खोज चोटियों" का चयन करें, जाँच से संबंधित विनिर्देशों कई चोटियों देखते हैं, तो चोटियों जरूरत के रूप में जोड़ सकते हैं।
    2. "पीक सूची" मेनू में एक चोटी सूची निर्यात करने के लिए, चयन "itmil" प्रारूप में "सहेजें ..." पीक सूची। स्पेक्ट्रम साथ खींचें करने के लिए Ctrl और बाएँ बटन का प्रयोग करें। स्पेक्ट्रा विंडो में, ब्याज की एक चोटी का चयन करें और वांछनीय पदों के लिए दो धराशायी लाइनों खींचें।
    3. एक चोटी सूची आयात करने के लिए, "मास अंतराल सूची" मेनू में, चुनें "आयात ...", फाइल एक्सटेंशन ".ITPL" के साथ एक मौजूदा शिखर सूची फ़ाइल का पता लगाने। "ओपन" पर क्लिक करें।
    4. एक "itmil" पीक सूची का उपयोग करने के लिए,"मास अंतराल सूची" मेनू, क्लिक करें "खोलें ...", फ़ाइल मिल जाए, तो क्लिक करें "ओपन"।
  7. एक चोटी सूची आगे डेटा का विश्लेषण करने के लिए लागू करें। "स्पेक्ट्रा" खिड़की के बाएं नीचे, वहाँ एक खिड़की "मास अंतराल सूची" कहा जाता है। आयातित चोटी सूची यहां तक ​​दिखाया गया है।
    1. शिखर सूची फ़ाइल को राइट-क्लिक करें इस्तेमाल किया जाएगा, "सक्रिय स्पेक्ट्रम" या "सभी स्पेक्ट्रा" करने के लिए लागू होते हैं।
  8. डेटा प्रोफाइल देखें। "प्रोफाइल" विंडो में उपयोग पत्र 'एम' खिड़की (पूर्ण रेंज) और पत्र "एन" के लिए फिट करने के लिए y अक्ष को फिट करने के लिए। Ctrl का प्रयोग करें और पहिया स्क्रॉल प्रोफ़ाइल चौड़ाई समायोजित करने के लिए। या कुंजी बोर्ड पर उपयोग "/" और "*" वाई अक्ष रेंज और ऊंचाई बदलने के लिए।
  9. आगे प्रारंभिक विश्लेषण के बाद अन्य ग्राफिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर साजिश रचने के लिए निर्यात डेटा।
    1. , "प्रोफाइल" खिड़की में एक गहराई प्रोफ़ाइल निर्यात करने के लिए, "फाइल" मेनू पर क्लिक करें, फिर चुनें "निर्यात & #34 ;, और उसके बाद का चयन एक ".txt" फाइल "के रूप में सहेजें"।
    2. "स्पेक्ट्रा" खिड़की में एक मी / z स्पेक्ट्रम फ़ाइल को निर्यात करने के लिए, "फाइल" मेनू पर क्लिक करें, फिर चुनें "निर्यात", और उसके बाद का चयन एक ".txt" फाइल "के रूप में सहेजें"।
    3. "छवि" खिड़की, प्रिंट स्क्रीन में एक छवि फ़ाइल निर्यात, और छवि फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए।

6. TOF-एस डेटा की साजिश रचने और प्रस्तुति

नोट: के बाद एस डेटा भूमिका निभाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कार्रवाई कर रहे हैं डेटा की साजिश के लिए एक ग्राफिक उपकरण का उपयोग करें।

  1. डेटा आयात करने के लिए एक ग्राफिक उपकरण का उपयोग करें।
  2. एक साजिश एक्स अक्ष और y अक्ष खंगाला स्पेक्ट्रम दिखाने के रूप में शिखर तीव्रता के रूप में एम / z का उपयोग करें। एक उदाहरण चित्रा 1 में दी गई है।
  3. एक साजिश एक्स अक्ष और y अक्ष खंगाला गहराई प्रोफ़ाइल अस्थायी श्रृंखला को दिखाने के लिए के रूप में शिखर तीव्रता के रूप में धूम समय का उपयोग करें। एक उदाहरण figu में दी गई हैRe 2।
  4. अलग मी / z की खंगाला 2 डी छवियों का मिश्रण है और एक मैट्रिक्स आयन मानचित्रण दिखाने के रूप में। एक उदाहरण चित्रा 2 में दी गई है।

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Representative Results

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प्रतिनिधि परिणामों के एक जोड़े को प्रस्तावित प्रोटोकॉल के फायदे प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। सालवी microfluidic इंटरफ़ेस का उपयोग करके, प्राथमिक आयन बीम (द्विपक्षीय 3 +) सीधे डि पानी में हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म पर बौछार कर सकते हैं। इस प्रकार तरल सतह की आणविक रासायनिक मानचित्रण सफलतापूर्वक हासिल किया जा सकता है।

चित्रा 1 ए और हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म और डि पानी के सकारात्मक TOF-एस जन स्पेक्ट्रा दिखाने 1 बी, क्रमशः। पानी समूहों सहित हित की चोटियों (यानी, मी / z 19, 37, 55, 73, 91 और 109) और एमिनो एसिड के टुकड़े (यानी, मी / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, और 98) लाल तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। एमिनो एसिड के टुकड़े की विशेषता चोटियों, जो व्यापक रूप से सूखी प्रोटीन नमूने का उपयोग करने के लिए सूचित किया गया इसके अलावा, पानी समूहों की चोटियों में मनाया जाता हैडि पानी में हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म के जन स्पेक्ट्रा। इसके अलावा, इन पानी क्लस्टर चोटियों की तीव्रता डि पानी की जन स्पेक्ट्रा में उन लोगों से बहुत अलग हैं। इस परिणाम के आसपास के पानी के अणुओं की संपत्ति का और हाइड्रेटेड प्रोटीन अणुओं है कि एक सतह पर उनकी सोखना में एक भूमिका निभा अंदर प्रत्यक्ष प्रमाण है।

चित्रा 2A हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म और डि पानी की गहराई प्रोफ़ाइल समय श्रृंखला से पता चलता है। नमूना पाप झिल्ली के नीचे के रूप में है, चयनित दूसरे आयनों की तीव्रता नगण्य पहले पाप झिल्ली के माध्यम से मुक्का मारा जाता है (यानी, फ़ाइब्रोनेक्टिन के लिए 280 सेकंड और डि पानी के लिए 340 सेकंड)। एक बार जब पाप झिल्ली के माध्यम से मुक्का मारा जाता है, इन माध्यमिक आयनों की तीव्रता में काफी वृद्धि हुई है। लंबे पल्स चौड़ाई का उपयोग करते हैं, सामूहिक संकल्प अपेक्षाकृत कम है। इसलिए, कम पल्स चौड़ाई प्रक्रिया बेहतर सामूहिक संकल्प के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता हैछवि और पुनर्निर्माण के लिए स्पेक्ट्रम के रूप में चित्रा 2A में प्रकाश डाला। समय की अवधि के बाद (यानी, फ़ाइब्रोनेक्टिन के लिए 60 सेकंड और डि पानी के लिए 220 सेकंड), कम पल्स चौड़ाई बेहतर सामूहिक संकल्प के साथ मी / z स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अंतिम मी / z स्पेक्ट्रा गहराई प्रोफ़ाइल अस्थायी श्रृंखला में हरी छायांकित क्षेत्रों में प्रकाश डाला। चित्रा 2 बी हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म और डि पानी है, जो चित्रा 2A में हरी छायांकित क्षेत्र के अनुरूप से 2 डी छवियों से पता चलता 200 सेकंड माप से खंगाला गया। ये 2 डी छवियों नमूना से चयनित माध्यमिक आयनों की गिनती का प्रतिनिधित्व: माध्यमिक आयन गिनती उज्जवल छवि, अधिक है। इस तरह सहज ज्ञान युक्त छवियों विभिन्न नमूनों के बीच में चयनित माध्यमिक आयनों की एक स्पष्ट तुलना है, जो डेटा विश्लेषण करने में मददगार है आज। अपने अनुभवों के अनुसार, पाप पंच के माध्यम से समय में अंतर बैच से पाप झिल्ली के बैच को बदलता है। हालांकि, यह फिर से प्रभावित नहीं करता हैगतिशील TOF-एस के विश्लेषण के sults।

आकृति 1
चित्रा 1: हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन फिल्म और साल्वी microchannel में डि पानी की TOF-एस सकारात्मक स्पेक्ट्रा की तुलना (एक) खंगाला मी / z फ़ाइब्रोनेक्टिन के स्पेक्ट्रम।। (ख) डि पानी स्पेक्ट्रम।

चित्र 2
चित्रा 2:। गहराई प्रोफाइल और हाइड्रेटेड फ़ाइब्रोनेक्टिन और डि पानी के 2 डी छवियों (एक) सकारात्मक मोड में फ़ाइब्रोनेक्टिन और डि पानी की गहराई रूपरेखा समय श्रृंखला। (ख) 2 डी छवियों हरे रंग के लिए इसी खंगाला में गहराई प्रोफ़ाइल समय श्रृंखला के साथ छायांकित 200 सेकंड समय खंडों (क)। कई विशेषता बड़े पैमाने पर पानी समूहों के लिए प्रासंगिक के अनुपात को चार्ज करने के लिए(जैसे, मी / z 1, 19, 37, 55) में जाना जाता है एमिनो एसिड के टुकड़े के अलावा में दिखाया जाता है (जैसे, मी / z 30, 83, 98)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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सालवी एक microfluidic इंटरफेस है कि इस तरह के TOF-एस और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के रूप में वैक्यूम आधारित उपकरणों, गतिशील द्वारा तरल सतह और तरल ठोस इंटरफेस विश्लेषण की अनुमति देता है। कारण छोटे छिद्र के उपयोग के निर्वात में सीधे तरल को बेनकाब करने के लिए, किसी भी संशोधन के बिना सालवी कई बारीक ध्यान केंद्रित स्पेक्ट्रोस्कोपी और इमेजिंग तकनीक के लिए उपयुक्त है, 22 पोर्टेबिलिटी और microfluidics की चंचलता यह एक सच बहुविध इमेजिंग मंच बनाते हैं। विशिष्ट सुविधाओं और अन्य मौजूदा तकनीकों की तुलना में सालवी के महत्व को हाल ही में कई समीक्षा में संक्षेप हैं। 22-25 सालवी प्रौद्योगिकी के विकासकर्ता के रूप में, हमारे समूह सक्रिय रूप से गतिशील तरल सतहों और तरल ठोस इंटरफेस शामिल अध्ययन की एक किस्म के लिए आवेदन किया गया है । नए अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण स्तनधारी कोशिका झिल्ली, बैक्टीरिया biofilm लगाव, 15,16 या जलीय सतह oxidations का एक परिणाम के रूप में nanoparticle गठन शामिल हैं। इस फिलीस्तीनी अथॉरिटी मेंप्रति, हम पाप सतह पर adsorbed हाइड्रेटेड प्रोटीन पतली फिल्म की प्रारंभिक तरल TOF-एस के परिणाम प्रस्तुत करते हैं।

यह काफी सावधानी से प्रोटोकॉल में प्रकाश डाला कदम को संभालने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, जब चरण 1 और 2 में सिरिंज में तरल ड्राइंग, यकीन है कि वहाँ सिरिंज के अंदर किसी भी बुलबुले नहीं हैं कि सुनिश्चित करें। क्योंकि एक बार बुलबुले सालवी में इंजेक्ट कर रहे हैं, वे शून्य में रिसाव उत्पन्न हो सकता है। 9 प्रकार, यदि किसी भी बुलबुले मनाया जाता है, यह समझदारी सिरिंज ईमानदार स्थापना और धीरे बुलबुले बाहर धक्का द्वारा उनमें से छुटकारा मिल रहा है। इसके अलावा, यह अनुकूलित TOF-एस के विश्लेषण के लिए फ्लैट सालवी में पाप खिड़की, चरण 3 में वर्णित का पता लगाने के क्षेत्र के इस levelness सीधे TOF-एस के डिजाइन के अनुसार डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करता है के रूप में बनाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यह 26 नेत्रहीन एस मंच पर सब कुछ हासिल करने के बाद डिवाइस का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है। पाप खिड़की क्षैतिज नहीं है, तो शिकंजा समायोजित करने और ऊंचाई परिवर्तनसालवी डिवाइस के लिए सुनिश्चित करें कि सब कुछ जितना संभव हो उतना ही विमान पर है। इन नाजुक अंक अनुभव और सतर्कता, जो सफलता और पूरे प्रयोग की विश्वसनीयता निर्धारित की जरूरत है।

जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 बी, मी / z 19, 37, 55, 73, 91 और 109 उच्च मायने रखता है के साथ चोटियों। इससे संकेत मिलता है पानी समूहों की एक अच्छी संख्या में देखते हैं कि (एच ओ + 3, एच 5 हे 2 +, एच 73 + 4 + 9 हे एच, एच 11 हे 5 + और ​​एच 13 हे 6 +) में सकारात्मक माध्यमिक आयनों। अन्य पानी के समूहों (डेटा) नहीं दिखाया उच्च मी / z मूल्यों के साथ भी उनके पड़ोसी चोटियों के साथ तुलना में अपेक्षाकृत मजबूत चोटियों है। पानी समूहों के इन बड़ी मात्रा पाप पंच के माध्यम से करने के बाद डि पानी की सतह से उत्सर्जित कर रहे हैं। सकारात्मक मोड में जल क्लस्टर संकेतों पिछले w में नमूदार नहीं किया गया हैOrk; और इस तरह के प्राथमिक आयन बीम (यानी, द्विपक्षीय + बनाम रूप साल्वी और TOF-एस अधिग्रहण की स्थिति के अनुकूलन में लगातार प्रयास के साथ माध्यमिक आयनों और कम मायने रखता है TOF-एस अतीत में की स्थिति गैर अनुकूलित करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। 8 । द्वि 3 +), पल्स चौड़ाई और गहराई रूपरेखा के दौरान मौजूदा परिस्थितियों, यह अब संभव इस अखबार में प्रस्तुत शर्तों का उपयोग सकारात्मक मोड में 44 पानी समूहों अप करने के लिए निरीक्षण करने के लिए है। यहाँ दिखाए गए परिणाम आगे विभिन्न जैविक अणुओं और जैविक प्रणालियों की गतिशीलता में पानी की भूमिका की जांच करने का वादा कर रहे हैं।

यहाँ एक उदाहरण जैविक आणविक गतिशीलता के अध्ययन में साल्वी और TOF-एस के फायदे के रूप में वर्णन करने के लिए, फ़ाइब्रोनेक्टिन प्रोटीन की हाइड्रेशन पेश किया गया। मी / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, और 98 की चोटियों पिछली रिपोर्ट, 27,28 जो डि वाट के उन लोगों की तुलना में ज्यादा मजबूत कर रहे हैं के अनुसार एमिनो एसिड के टुकड़े करने के लिए संबंधितएर चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। फ़ाइब्रोनेक्टिन नमूने में अमीनो एसिड के टुकड़े की वृद्धि की तीव्रता में यह अंतर पता चलता है कि इन माध्यमिक आयनों प्रोटीन से खुद को वास्तव में कर रहे हैं। इसके अलावा, चित्रा 1 ए में पानी समूहों की चोटियों चित्रा 1 बी, जिसका मतलब यह है कि प्रोटीन सोखना सतह और इंटरफेसियल समाधान में पानी के अणुओं के गुणों को शुद्ध पानी में उन लोगों से बहुत अलग हो सकता है में डि पानी के उन लोगों की तुलना में ज्यादा मजबूत कर रहे हैं।

सालवी microchannel में फ़ाइब्रोनेक्टिन और डि पानी: चित्रा 2A दो अलग नमूनों की प्रतिनिधि गहराई रूपरेखा अस्थायी श्रृंखला से पता चलता। के रूप में पाप खिड़की लंबे पल्स चौड़ाई के साथ द्विपक्षीय 3 + प्राथमिक आयन बीम द्वारा बमबारी की जा रही थी गहराई रूपरेखा डेटा एकत्र किए गए थे। जैसा कि चित्र 2A में देखा, पाप खिड़की के आसपास 300 सेकंड में के माध्यम से मुक्का मारा है। इससे पहले सालवी में पाप खिड़की throug मुक्का मारा हैज, चयनित माध्यमिक आयनों की तीव्रता बहुत कम हैं। एक बार जब पाप खिड़की के माध्यम से मुक्का मारा है, माध्यमिक आयनों की तीव्रता तुरंत के रूप में तरल सतह प्राथमिक आयन बीम द्वारा बमबारी जा रहा शुरू होता है वृद्धि हुई है। उदाहरण के लिए, एच + की तीव्रता और एच 3+ एक बड़ी वृद्धि दिखाने के लिए, पानी की सतह के अवलोकन के संकेत मिलते हैं। 8,9 हालांकि तीव्रता पंच के माध्यम से या इंटरफेस में, वे अपेक्षाकृत स्थिर तक पहुंच सकता है के बाद अस्थिर सही कह रहे हैं समय की अवधि के बाद मानों (जैसे, fibronectin के लिए 60 सेकंड और डि पानी के लिए क्रमश: 220 सेकंड, चित्रा 2A में)। लंबे पल्स चौड़ाई ड्रिलिंग में अंतर वास्तव में, यहाँ सचित्र जब मी / z स्पेक्ट्रा (जैसे, चित्रा 1) के पुनर्निर्माण विश्लेषण के परिणाम को प्रभावित नहीं करता क्योंकि प्रभावी मी / z स्पेक्ट्रा पाप पंच के माध्यम से करने के बाद हासिल किया है। हालांकि, एक शोधकर्ता के सभी नमूनों के लिए के लिए एक ही परिस्थितियों का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैंआर स्थिरता और डेटा विश्लेषण के दौरान डेटा वर्गों को चुनने में आसानी। ताकि बेहतर सामूहिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए, पल्स चौड़ाई कम हो गया था और बाद में तीव्रता गहराई रूपरेखा प्रयोग के बाद के हिस्से में कमी आई है उसके अनुसार किया गया। एक और 200 सेकंड मी / z वर्णक्रम विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान करने के लिए गहराई प्रोफ़ाइल समय श्रृंखला लगातार एकत्र किए गए थे। समय के क्षेत्रों मी कि / z स्पेक्ट्रा खंगाला गया हरी छायांकित क्षेत्रों में डाला जाता है।

फ़ाइब्रोनेक्टिन व्यापक रूप से सतह सोखना सेल संवर्धन के लिए पूर्व के लिए इस्तेमाल किया गया है; कई अध्ययनों से पता चला है फ़ाइब्रोनेक्टिन कोशिका आसंजन और सेल biomaterial बातचीत के लिए जिम्मेदार है। 19,20,29 एक ताजा अध्ययन में ellipsometry का उपयोग कर (hydroxylethyl methacrylate) ब्रश पाली पर adsorbed फ़ाइब्रोनेक्टिन की मोटाई होती है। फ़ाइब्रोनेक्टिन पतली फिल्म 3-12 एनएम मोटी। 30 ऐसे मोटाई होना करने के लिए निर्धारित किया गया था एक जलीय समाधान में गहराई रूपरेखा विश्लेषण के लिए उचित हैtion। 8,9 सालवी के विकास के साथ, हाइड्रेटेड प्रोटीन ठोस सतह पर adsorbed के प्रत्यक्ष विश्लेषण अब संभव है। यह दृष्टिकोण संभावित ठोस सतहों गतिशील के साथ प्रोटीन की बातचीत के अध्ययन में विस्तृत आवेदन कर सकते हैं।

चित्रा 2 बी फ़ाइब्रोनेक्टिन और डि पानी के नमूनों से अलग माध्यमिक आयनों के चयनित 2 डी छवियों, क्रमशः पता चलता है। 2 डी छवियों चित्रा 2A में हरी छायांकित क्षेत्रों में गहराई रूपरेखा अस्थायी डेटा है, जो पाप के बाद तरल सतह के अनुरूप से प्राप्त कर रहे पंच के माध्यम के रूप में पहले बताया। चुने गए अमीनो एसिड टुकड़ा माध्यमिक आयनों की छवियों CH 4 एन +, सी एच 5 7+ और ​​सी 4 h 4 सं 2 + (यानी, मी / z 30, 83 और 98) फ़ाइब्रोनेक्टिन पतली फिल्म के लिए उन लोगों की तुलना में बहुत उज्जवल थे डि पानी के लिए। यह इंगित करता है कि अमीनो एसिड टुकड़ा माध्यमिक आयनों च मनाया जाता है2 माइक्रोन व्यास एपर्चर अंदर फ़ाइब्रोनेक्टिन अणुओं ROM। इसके अलावा, चयनित चोटियों की छवियों (जैसे, मी / z 1, 19, 37, और 55) फ़ाइब्रोनेक्टिन के कई समूहों के पानी के लिए इसी डि पानी की तुलना में उल्लेखनीय चमक रहे हैं। यह परिणाम यह दर्शाता है कि फ़ाइब्रोनेक्टिन की हाइड्रेशन बायोमोलिक्यूल डि पानी में पानी के अणुओं से अलग आसपास के पानी के अणुओं में आता है।

सारांश में, इस काम प्रोटीन हाइड्रेशन प्रेरित पानी के अणु संपत्ति परिवर्तन पर हड़ताली सबूत प्रदान की गई है। इस तरह के परिणाम संरचना, रचना, और जैविक तरल microenvironment में एक ठोस सतह पर adsorbed प्रोटीन की गतिविधि पर एक बेहतर बुनियादी समझ प्रदान कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

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साल्वी और TOF-एस द्वारा पानी में हाइड्रेटेड प्रोटीन की <em>सीटू</em> लक्षण वर्णन <em>में</em>
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Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

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