Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.

Abstract

이 작업은 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석법으로 분석 시스템을 사용하여 수용액의 단백질의 생체 시츄 특성화 보여준다. 피브로넥틴 단백질 막을 SALVI 감지 영역을 형성하는 상기 실리콘 질화물 (SIN) 막 상에 고정화 하였다. 으로 ToF-SIMS 분석에서, 분석의 세 개의 모드는 높은 공간 분해능 질량 분석법, 2 차원 영상 및 깊이 프로파일 링을 포함하여 수행 하였다. 질량 스펙트럼을 양성 및 음성 모드를 모두 취득 하였다. 탈 이온수는 기준 샘플로서 분석 하였다. 우리의 결과는 물에 피브로넥틴 영화는 혼자 물에 비해 더 독특하고 강한 물 클러스터 피크를 가지고 있음을 보여준다. 아미노산 단편의 특징적인 피크는 단백질 수화으로 ToF-SIMS 스펙트럼에서 관찰 가능하다. 이러한 결과는 표면에 단백질 분자의 흡착 dynamica을 연구 할 수있는 예시에서야 처음으로 액체 환경에서 SALVI 및으로 ToF-SIMS를 사용하여.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

수화 구조, 형태 1, 2 단백질의 생물학적 활성을 3 중요하다. 그들을 둘러싼 물 분자가없는 단백질은 실행 가능한 생물학적 활성이없는 것입니다. 특히, 물 분자가 표면 단백질의 내부 구조와 상호 작용 단백질의 상이한 수화 상태는 별개 이러한 상호 작용을 만든다. (4) 고체 표면과 단백질의 상호 작용은 나노, 바이오 물질 및 조직 공학 프로세스의 의미와 기본적인 현상이다. 연구는 긴 단백질이 표면에 발생으로 구조적인 변화가 발생할 수 있음을 지적했다. 으로 ToF-SIMS는 단백질 - 고체 계면을 연구 할 수있는 잠재력을 가지고 기술로서 구상되었다. 5-7 이는 잠재적으로 그 구조의기구의 기본적인 이해를 제공 고체 표면에 단백질의 수화를 이해하는 것이 중요 형태 및 생물학적등 활동.

그러나, 주 표면 분석 기술은 주로 진공 기반 휘발성 액체 연구 직접 애플리케이션 인해 진공 분위기 하에서 휘발성 액체의 신속한 증발하기 어렵다. 우리는 액체 표면과 액체 - 고체 상호 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석기를 사용하여 직접 관찰을 가능하게하는 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에서 분석 호환 미세 인터페이스 시스템에 진공을 개발 하였다. 8- 2) 표면 장력이 개구 내에 상기 액체를 보유하기 위해 사용되는 1) 검출 창 액면 직접 촬상 있도록 직경 2-3 μm 인 개구이며 3) SALVI는 11 독특한 양상은 다음과 같다 여러 분석 플랫폼 사이의 휴대용. (11, 12)

SALVI은 검출 영역 및 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 마이크로으로서 실리콘 질화막 (SiN) 막으로 구성된다. 그것은 fabr입니다클린 룸에서 icated하고, 제조 및 핵심 설계 요소는 이전의 논문 및 특허에 자세히 설명되어있다. 8-12 분석 도구 등으로 ToF-SIMS의 응용 프로그램의 일부 수용액 복잡한 액체 혼합물의 다양한 사용하여 시연 하였다 이는 나노 입자가 포함되어 있습니다. 13-17 구체적으로는, SALVI 액으로 ToF-SIMS는 현장 응축 단계에서 새로운 기회를 열어, 라이브 생물학적 시스템 (즉, 바이오 필름), 단일 세포 및 고체 전해질 인터페이스의 액체 - 고체 계면의 프로빙 동적 수 있습니다 으로 ToF-SIMS를 사용하여 액체를 포함하는 연구. 그러나, 현재의 디자인은 아직 기체 - 액체의 상호 작용을 허용하지 않습니다. 이것은 미래의 발전을위한 방향이다. SALVI 처음 본 연구에서 수화 된 막 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.

피브로넥틴은 거의 동일한 두 개의 이황화 결합에 의해 연결된 한 쌍의 단량체 (18)로 이루어진, 일반적으로 사용되는 단백질 이량 인 I세포에 결합하는 능력에 대해 잘 알려지. 그것은 모델 시스템으로 선택되었다 (19, 20)을 수화 단백질 막 동적 SALVI 액으로 ToF-SIMS를 사용하는 방식 프로브 될 수 있음을 설명하기 위해. 단백질 용액은 마이크로 채널에 도입 하였다. 12 시간 동안 배양 한 후에, 수화 된 막 단백질의 SiN 막의 배면 측에 형성되어있다. 탈 이온수 (DI) 물은 단백질 도입 한 후의 채널을 씻어 하였다. 정보는 동적으로 ToF-SIMS를 사용하는 마이크로 채널 SALVI 수화 피브로넥틴 단백질 분자로부터 수집 하였다. DI 물은 수화 피브로넥틴 박막에서 얻은 결과와 비교 대조군으로 연구 하였다. 뚜렷한 차이점은 수화 단백질 막 및 DI 물 사이에서 관찰되었다. 이 작업은, 액체 환경에서 표면 단백질 흡착은 신규 SALVI 액상으로 ToF-SIMS 방식을 사용하여 조사 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 비디오 프로토콜은 관심이있는 사람들을위한 기술지도를 제공하기위한 것입니다으로 ToF-SIMS와 SALVI의 다양한 애플리케이션을위한 새로운 분석 도구를 활용하고으로 ToF-SIMS 데이터 수집 및 분석뿐만 아니라 액체 처리에 불필요한 실수를 줄일 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI 마이크로 채널 1. 청소 및 살균

  1. SALVI의 마이크로 채널의 살균
    1. 주사기 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구 단부와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 사출의 끝에서 주사기를 제거한다. 다음으로, 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 대안 적으로, 동일한 절차를 수행하기 위해 주사기 펌프를 사용한다. 예를 들어, 100 μL / 분으로 유동 속도를 설정한다.
    2. 4 시간 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 채워진 마이크로 채널 SALVI 유지.
  2. SALVI에 탈 (DI) 물을 소개
    1. 주사기로 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 주사기를 제거하고, PEEK 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 에서 언급 한 바와 같이 교대로 시린지 펌프를 사용하여1.1.1.

SALVI에서 단백질 2 막의 고정화

  1. SALVI에서 단백질 막을 고정화
    1. 주사기로 (인산염 완충 염수 중 10 ㎍ / ㎖, PBS) 용액 피브로넥틴 2 ㎖ 그리기 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입, SALVI의 입구와 주사기를 연결 주사기를 제거하고, 유입 연결 및 SALVI의 출구 PEEK 조합을 사용하여.
    2. 깨끗한 배양 접시에 피브로넥틴 용액을 가득 SALVI 부화 실온에서 12 시간 동안 접시 후드 유지.
    3. 주사기에 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리고 SALVI의 입구에 주사기를 연결합니다. 천천히 10 분에서 물 1 ㎖를 주입 주사기를 제거 SALVI의 입구와 출구를 연결한다.
      참고 : 광학 현미경을 갖춘 경우, 죄의 막으로 ToF-SIMS 분석 전에 그대로 있는지 확인하기 위해 현미경으로 SALVI을 확인합니다. 이제 SALVI 장치가 준비으로 ToF-SIMSalysis.

3.으로 ToF-SIMS로드 락 챔버에 SALVI 설치

참고 : SALVI 장치를 처리하고 표면 분석시 발생할 수있는 오염을 방지하기 위해으로 ToF-SIMS 단계에 그것을 설치할 때 장갑은 항상 착용해야합니다.

  1. 스테이지로 마운트 SALVI
    1. 평평하고 깨끗한 표면으로 ToF-SIMS 단계를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼의 SiN 막 위쪽으로 향하게 스테이지로 SALVI 장치를 넣습니다. 네 개의 금속 클램프를 사용 SALVI를 해결하고 네 개의 나사에 의해 금속판에 장치의 모서리를 들고 금속편 스크류.
    2. 부드럽게 미세 유체 채널에 연결 PFTE 튜브를 굴립니다. 딱딱한 부분을 누르고 네 개의 금속 조각과 네 개의 나사를 사용합니다. 이 분석에서 차 이온 빔을 방해하지 않도록 장치가 SIMS 스테이지 개방 공간 내에 위치되어 있는지 확인. 추가 이미지와 SALVI의 fabricat의 그림이온 및 설치 이전의 출판물에서 사용할 수 있습니다. 8,9,11
  2. 스테이지로 패러데이 컵을 탑재
    1. 나사에 의해 무대에 패러데이 컵을 수정합니다.
  3. 로 스테이지를 넣으로 ToF-SIMS로드 락 챔버
    1. ,으로 ToF-SIMS의로드 록을 열고 상태에서 로딩 플랫폼에 수평으로 무대를 설정하고,로드 록 도어를 닫습니다.

4.으로 ToF-SIMS 데이터 수집

  1. (10-6 밀리바 또는 토르의 순서에, 예를 들면) 진공 펌프를 켜고 적당한 진공을 보장하기는로드 락 챔버에 도달한다.
  2. 진공이 약 30 분 후 안정화되면 메인 챔버로 SALVI 이동합니다.
    참고 : 진공는 데이터 수집 동안 주요 챔버에서보다 낮은 5 × 10-6 mbar의 진공을해야합니다. 그렇지 않으면, 높은 진공 SALVI 시스템의 누출을 나타낸다.
  3. 함께으로 ToF-SIMS의 기본 이온 빔 분석기를 조정제조업체의 권장 사항에 따라 약 400 나노 미터의 공간 해상도. 사이클 타임은 DC 모드에서 30 마이크로 초 동안 기본 빔 전류는 pA 1200이다.
    참고 :이 과정은 주로 제조업체의 권장 사항을 따른다.
  4. 광학 현미경을 이용하여 미세 유체 채널을 찾을 수 있습니다. 참고로 광학 이미지 센터를 이용하여 이차 이온 화상 중심과 일치하도록 정렬.
  5. 각 측정하기 전에, 표면 오염을 제거하기 위해 ~을위한 500 X 500 μm의 2 영역으로 죄 창에 15 초를 스캔 한 KeV의 O 2 + 빔 (~ 40 nA의)를 사용합니다. 또한, 모든 측정시 표면 충전을 보상하기 위해 전자 홍수 총을 사용합니다. 이 단계에 대한 기본 모드에서 홍수 총의 자동 기능을 사용합니다.
  6. 데이터 수집 전에 양 또는 음의 모드를 선택합니다. 모든 측정의 기본 이온 빔으로 25 keV의 양방향 3 + 빔을 사용합니다.
    참고 : 단계가 유사한 F입니다또는 양성 및 음성 데이터 취득. 공간 관심 포지티브 모드는 여기서 상세하게 설명한다.
    1. 깊이 프로파일 링
      1. 32 픽셀 해상도로 32 픽셀 ~ 2 ㎛의 직경 라운드 영역의 양방향 3 + 빔을 스캔합니다.
      2. 천공 통과하도록 된 SiN 막에 필요한 시간을 최소화하기 위해, 긴 펄스 폭을 사용하여 (예를 들어, 180 나노초 100 마이크로 초 사이클 시간에서 빔 전류 1.0 ~ PA) 3 + 양방향 빔. 액면 상승에 이차 이온 대표 농도는 펀치 쓰루가 도달 할 때. 펀치 - 스루 시간은 죄 멤브레인의 배치에 따라, 300 초에서 500 초로 다릅니다.
        참고 :이 차이가 우리의 경험에 따라 획득 된 SiN 막의 배치 관련이있을 것으로 보인다. 그러나, 펀치 - 스루 시간은 실제로 데이터 분석에 영향을 미치지 않는다.
      3. 죄 막 후-을 통해 펀치에 약 200 초 동안 같은 최신 상태로 유지2D 이미지 복원을위한 충분한 데이터를 얻을 수 있습니다.
      4. 더 나은 질량 해상도 스펙트럼을 얻기 위해 데이터 수집을 위해 80 나노초에 펄스 폭을 줄일 수 있습니다. 에 대한 또 다른 200 초 동안 이번 인수를 계속합니다. 도 1에 도시 된 스펙트럼 데이터는이 영역에서 얻어진다.
    2. 2D 이미징 및 질량 스펙트럼
      1. 깊이 프로파일 데이터를 측정 할 때 동일한 시간에 2 차원 촬상 및 질량 스펙트럼 데이터를 수집한다. 으로 ToF-SIMS 장비는 실험 기간 동안 각 지점의 모든 정보를 저장합니다. (- 스펙트럼, FPanel - 프로필 및 FPanel - 별도 이미지 FPanel) 디지털 제어 소프트웨어의 데이터는 다른 창에 표시됩니다. 신중하게 데이터 수집시 각 패널의 데이터를 확인합니다.

5.으로 ToF-SIMS 데이터 분석

주 : 데이터 분석은 초기 IonToF으로 ToF-SIMS 계기 소프트웨어를 이용하여 수행된다.

  1. 를 엽니 다다음, SIMS (측정 탐색기) 그리고 alysis 소프트웨어 깊이 프로파일, m / z 스펙트럼 화상 데이터를 처리하기 위해, 각각, "정보", "스펙트라"및 "화상"버튼을 클릭.
  2. 확장 ".ita"이 데이터 파일을 엽니 다.
  3. 관심 피크를 선택 "이온"상자에 종의 이름을 입력 한 스펙트럼에서 다른 색깔로 레이블을 붙입니다. x 축을 따라 끌어 마우스 스크롤 휠을 사용합니다. 피크의 높이와 폭을 조정 Ctrl 키와 스크롤 휠을 사용합니다. y 축을 따라 선형 및 로그 모드 사이의 문자 "L"로 전환됩니다.
  4. 질량 교정하기 전에 데이터 재구성을 실시한다. 그렇지 않으면 질량 교정 단계에서 피크들 사이의 간격을 선택하는 것이 곤란하다.
    1. 관심의 깊이 프로파일 링 데이터를 선택하고 깊이 프로파일 시간 시리즈에 따라 스펙트럼을 재구성.
    2. 복원 버튼을 클릭합니다. INT의 스캔 범위에서 "시작 재건"창에 입력erest. 깊이 프로파일 데이터를 재구성하는 "OK"를 클릭합니다.
  5. 질량 보정을 수행합니다. 보도는 "F3"는 "질량 교정"창을 엽니 다. 특정 샘플에 따라 교정을위한 피크를 선택합니다. (21) 본 연구에서는 다음과 같은 피크를 사용 CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71) H 11 O 5 + (m / z 99)와 긍정적 인 모드 H 13 O 6 + (m / z 109). 다음 봉우리 CH 사용 - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), 및 C 4 H - (m / z 49) 부의 모드.
    1. 피크를 선택,아래쪽 화살표가 윈도우의 왼쪽 하단 모서리에 절정에 지적되어 있는지 확인하십시오. 피크를 클릭하고 "질량 교정"창에서 피크 이름을 입력 "추가"를 클릭 한 관심의 이온은 질량 교정에 포함되어 있습니다.
    2. 마지막으로, "다시 보정"버튼을 클릭합니다. 피크의 영역 비율을 부과하는 그들의 질량에 따라 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. "스펙트럼"메뉴에서 선택하여 수행되는 특정 분석에 따라 "적용 질량 교정"을 "모든 스펙트럼"또는 "선택한 스펙트럼"을 클릭합니다.
  6. 피크 선택 시료 분석에 필요한 바와 같이, 문헌 또는 다른 이전 결과에 따라 샘플의 특징적인 피크를 결정한다. m / Z 스펙트럼에 대한 관심의 피크의 강도를 비교합니다. 필요한 경우, 피크 목록 쓸모 피크 새로운 피크를 추가하거나 삭제할.
    1. 피크를 추가합니다. , 피크를 클릭하면 왼쪽 아래 창에 붉은 줄을 찾을 수 있습니다. 홀리D 'Ctrl 키 "키 자동 피크 목록에 추가 피크의 피크 폭을 정의하는 가로 스크롤 마우스. 피크를 추가하는 또 다른 방법은 창 위의 '피크를 추가 "버튼을 클릭 한 다음 주 스펙트럼 창에서 피크를 선택하는 것입니다. 새롭게 문을 연 창에 관련 사양, "스펙트럼"메뉴에 추가 "검색 봉우리"를 선택, 확인하는 많은 봉우리가있는 경우 필요에 따라 다음 피크를 추가 할 수 있습니다.
    2. "피크 목록"메뉴에서, 피크 목록을 내보내려면 선택 "itmil"형식으로 피크 목록 "... 저장". 스펙트럼을 따라 드래그 Ctrl 키와 왼쪽 버튼을 사용합니다. 스펙트럼 창에서 관심의 피크를 선택하고 원하는 위치에 두 개의 점선을 끕니다.
    3. 피크 목록을 가져 오려면, "대용량 간격 목록"메뉴에서 "가져 오기 ...", 파일 확장자 ".ITPL"와 기존의 피크 목록 파일의 위치를​​ 선택합니다. "열기"를 클릭합니다.
    4. 에, "itmil"피크 목록을 사용하려면"대용량 간격 목록"메뉴는 "열기 ..."를 클릭하여 파일을 찾을 후 "열기"를 클릭합니다.
  7. 추가 데이터를 분석하는 피크 목록을 적용합니다. "스펙트럼"윈도우의 왼쪽 하단에 "대용량 간격 목록"라는 창이있다. 수입 피크 목록은 여기에 표시됩니다.
    1. , 사용 피크 목록 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 "활성 스펙트럼"또는 "모든 스펙트럼 '에 적용합니다.
  8. 데이터 프로파일을 볼 수 있습니다. "프로필"창에서 사용 문자 "M"은 y 축에 맞게 창 (전체 범위) 및 문자 "N"을에 맞게. Ctrl 키를 사용하여 프로파일 폭을 조정 휠을 스크롤합니다. 또는 Y 축 범위와 높이를 변경 키 보드의 "*", "/"를 사용하고.
  9. 또한 초기 분석 후 다른 그래픽 소프트웨어를 사용하여 플롯에 대한 데이터 내보내기.
    1. "파일"메뉴를 클릭 "프로필"창에서, 깊이 프로파일을 내보내려면 다음 "내보내기 & #을 선택(34), 및 다음 선택 "이 .txt"파일 "로 저장"을 선택합니다.
    2. , "스펙트럼"창에서, m / Z 스펙트럼 파일을 내보내 '파일'메뉴를 클릭 한 다음 "내보내기"를 선택한 후 "이 .txt"파일 "로 저장 '을 선택합니다.
    3. "이미지"창, 인쇄 화면에서 이미지 파일을 내 보낸 이미지 파일로 저장합니다.

6.으로 ToF-SIMS 데이터 플로팅 및 프리젠 테이션

참고 : SIMS 데이터가 쓸모 소프트웨어를 사용하여 처리 한 후 데이터를 플롯하는 그래픽 도구를 사용합니다.

  1. 데이터를 가져 그래픽 도구를 사용합니다.
  2. 재구성 된 스펙트럼을 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 m / z를 사용하여 곡선을 만든다. 예를 그림 1에 제시되어있다.
  3. 재구성 된 깊이 프로파일의 시간 시리즈를 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 스퍼터 시간을 사용하여 곡선을 만든다. 예를 Figu에 제시되어있다2를 다시.
  4. 다른 m / z의 복원 된 2 차원 영상을 결합 이온 매핑을 표시하는 매트릭스를 형성한다. 예를 그림 2에 제시되어있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

대표적인 결과의 커플은 제안 된 프로토콜의 장점을 보여주기 위해 제공됩니다. SALVI 미세 인터페이스를 사용하여, 기본 이온빔 (BI + 3)가 직접 DI 물에서 수화 피브로넥틴 필름 포격있다. 따라서 액체 표면의 분자 화학 매핑 성공적 얻을 수있다.

도 1a 각각 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물의 양으로 ToF-SIMS 질량 스펙트럼을 표시 1B. 물 클러스터를 포함하여 관심의 피크 (즉, m / z 19, 37, 55, 73, 91, 109) 및 아미노산 조각 (즉, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, 98) 빨간색 화살표로 표시됩니다. 널리 건조 단백질 시료를 사용하여보고 된 아미노산 단편의 특징적인 피크 이외에, 물의 클러스터의 피크가 관찰되고DI 물에서 수화 피브로넥틴 필름의 질량 스펙트럼. 또한,이 물 클러스터 피크의 강도는 DI 물의 질량 스펙트럼에서와 매우 다르다. 이 결과는 주변의 물 분자의 속성과 그 표면에 흡착하는 역할을 수화 단백질 분자 내부 직접적인 증거를 제공한다.

도 2a는 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물의 깊이 프로파일 시계열을 나타낸다. 샘플이 죄 막 아래로 죄 막을 통해 펀칭하기 전에, 선택된 제 2 이온의 농도가 무시할 수 (즉, 피브로넥틴 280 초 및 탈 이온수 340 초). 죄 막을 통해 펀칭되면, 이러한 이차 이온의 농도가 크게 증가. 긴 펄스 폭을 사용하는 경우, 질량 해상도가 비교적 낮다. 따라서, 짧은 펄스 폭 처리가 더 질량 분해능으로 데이터를 획득하는 데 사용이미지와 스펙트럼 복원에 관해서는도 2a에 강조했다. 일정 기간 후 (즉, 피브로넥틴, 60 초 및 DI 물 220 초)는, 감소 된 펄스 폭보다 질량 분해능으로 m / z 스펙트럼을 획득하기 위해 사용된다. 최종 m / z 스펙트럼 깊이 프로파일 시간적 직렬 녹색 음영 영역으로 표시.도 2b는도 2a에 녹색 음영 지역에 해당하는 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물에서 2 차원 영상을 도시 200 초의 측정들로부터 재구성되었다. 이 2 차원 이미지는 샘플에서 선택되는 이차 이온의 수를 나타낸다 : 이온 이차 횟수 이상 밝은 화상. 이러한 직관적 인 이미지는 데이터 분석에 도움이되는 다른 샘플 사이의 선택 이차 이온의 명확한 비교를 제공합니다. 우리의 경험에 의하면, 죄 펀치를 통해 시간의 차이는 배치에서의 SiN 막의 배치에 따라 다릅니다. 그러나, 다시 영향을 미치지 않는다동적으로 ToF-SIMS 분석의 sults.

그림 1
도 1 : SALVI 마이크로 채널에서 수화 피브로넥틴 막 및 DI 워터으로 ToF-SIMS 양 스펙트럼을 비교 피브로넥틴 (a) 재구성 m / z 스펙트럼.. (b) DI 물 스펙트럼.

그림 2
그림 2. 깊이 프로파일 및 수화 피브로넥틴 및 DI 물 2D 이미지 (a) 양극 모드에서 피브로넥틴과 DI 물의 깊이 프로파일 시계열. (b)는 2 차원 영상에 대응하는 녹색 재구성의 깊이 프로파일 시계열을 따라 200 초 시간 세그먼트 음영 (a). 여러 특성 질량은 물 클러스터에 관련성의 비율을 충전(예를 들어, m / z 1, 19, 37, 55) 알려진 아미노산 조각에 추가로 표시됩니다 (예를 들어, m / z 30, 83, 98). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI 등으로 ToF-SIMS 및 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 진공 기반기구에 의해 동적 액면과 액체 - 고체 계면 분석을 허용 미세 인터페이스이다. 작은 구멍의 사용은 직접 진공 액체에 노출하기 때문에, SALVI은 수정없이 많은 미세하게 초점을 맞춘 분광기 및 이미징 기술에 적합한 22 이동성과 미세 유체의 다양성이 진정한 멀티 모달 이미징 플랫폼입니다. 별개의 기능 및 기존의 기술에 비해 SALVI의 중요성이 최근 여러 후기에 요약되어있다. SALVI 기술의 개발로 22-25 우리 그룹 적극적 동적 액체 표면과 고액 인터페이스를 포함하는 다양한 연구에 적용되어 . 새로운 애플리케이션의 예로는 포유 동물 세포막 세균 생물막 부착 수성 표면 산화 반응의 결과로 15, 16 또는 나노 입자의 형성을 포함한다. 이 포장 된당, 우리는 죄의 표면에 흡착 수화 단백질 박막의 초기 액체으로 ToF-SIMS 결과를 제시한다.

신중하게 프로토콜 강조 단계를 처리하는 것은 매우 중요하다. 1 단계와 2 단계에서 주사기로 액체를 그릴 때 예를 들어, 주사기 내부에 거품이없는 있는지 확인하십시오. 거품이 SALVI에 주입되면 있기 때문에 진공 누설을 야기 할 수 있음. 어떤 거품이 관찰되는 경우 (9) 따라서, 똑바로 주사기를 설정하고 조심스럽게 밖으로 거품을 밀어 그들을 없애 신중한이다. 또한, 3 단계에서 설명 된 검출 영역이 수평도 직접적으로 ToF-SIMS의 설계에 따라 데이터 품질에 영향을 주므로, 최적으로 ToF-SIMS 분석 SALVI에 죄 창 평면 있도록하는 것이 매우 중요하다. (26)이 시각적으로 SIMS의 무대에 모든 것을 확보 후 장치를 검사 할 필요가있다. 사인 윈도우가 수평이 아닌 경우, 나사를 조정하여 높이를 변경SALVI 장치의 모든 가능한 한 동일 평면에있을 것을 보장한다. 이러한 섬세한 점은 전체 실험의 성공과 신뢰성을 결정하는 경험과 정중가 필요합니다.

도 1b에 도시 된 바와 같이, m / z 19, 37, 55, 73, 91, 109이 높은 카운트를 갖는 피크. 이것은 (H 3 O + H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + 및 O 6 + H 13) 물의 클러스터의 좋은 수 있다는 것을 포지티브 나타낸다 이차 이온. 높은 m / z 값을 가지는 다른 물 클러스터 (데이터 미도시) 또한 인접 피크에 비해 비교적 강한 피크를 갖는다. 물 클러스터의 이러한 많은 양의는 죄 펀치 - 스루 후 DI 물 표면에서 방출된다. 긍정적 인 모드에서 물 클러스터 신호는 w 이전에 관찰되지 않았습니다오크; 이는 TOF-SIMS의 과거에 조건 비는 최적화 된 이차 이온과의 낮은 수가에 기인했다. 8 SALVI 및으로 ToF-SIMS 인수 조건을 최적화 지속적인 노력으로 이러한 즉, 기본 이온 빔 (양방향 + 대로 . 양성 3 +)는 펄스 폭과 깊이 프로파일 링 동안 현재의 조건은,이 논문에서 제시 한 조건을 사용하여 긍정적 인 모드에서 44 물 클러스터까지 관찰 할 수있게되었습니다. 여기에 표시된 결과는 더 다양한 생물 분자 생물학적 시스템의 역학에서 물의 역할을 조사하기 위해 약속한다.

여기서 생체 분자 역학 연구에서와 SALVI으로 ToF-SIMS의 장점을 설명하기 위해 예로서, 피브로넥틴 단백질 수화 제시 하였다. m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 및 98의 피크 DI 와트보다 훨씬 강하다 이전 보고서 27,28 따른 아미노산 단편에 속하는ER도 1b에 도시. 피브로넥틴 샘플 아미노산 단편의 증가 강도의 차이는 이러한 이차 이온은 단백질 자체에서 참임을 시사한다. 또한,도 1a에서의 물의 클러스터의 피크는 단백질 흡착 표면 및 계면 용액 중의 물 분자의 특성은 순수와는 매우 상이 할 수 있다는 것을 의미도 1B에서 DI 물보다 훨씬 더 강하다.

SALVI 마이크로 채널에서 피브로넥틴과 DI 물 : 그림 2a는 두 개의 서로 다른 샘플의 대표 깊이 프로파일 시간 시리즈를 보여줍니다. 사인 윈도우가 긴 펄스 폭을 갖는 양성 3 + 일차 이온 빔에 의해 포격되었을 깊이 프로파일 데이터를 수집 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 사인 윈도우가 약 300 초로 통해 천공된다. SALVI의 죄 창이 통해 서 펀칭하기 전에시간은 선택된 보조 이온의 농도는 매우 낮다. 죄 창을 통해 천공되면, 이차 이온 강도를 즉시 액체 표면 차 이온 빔에 의해 포격 시동 높이기. 예를 들어, H +의 강도와 H 3 O + 물 표면의 관찰을 나타내는 큰 증가를 나타낸다. 8,9 강도는 펀치 - 스루 또는 계면에서, 그들은 비교적 안정 달할 수 후 불안정 오른쪽 있지만 일정 기간 이후에 값 (예, 피브로넥틴, 60 초 및도 2a에 각각 DI 물, 220 초). 유효 m / z 스펙트럼 죄 펀치 스루 이후에 수집되기 때문에 긴 펄스 폭을 드릴링의 차이는 정말 m / z 스펙트럼 (예,도 1) 재구성 할 때 여기에 설명 된 분석 결과에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 연구는 모든 샘플 FO 동일한 조건을 사용하도록 선택할 수도R 일관성 및 데이터 분석에서 데이터 섹션을 선택 완화. 더 질량 분해능을 얻기 위해, 펄스 폭은 감소하고,이어서 강도를 깊이 프로파일 실험 후반부에 따라 감소 하였다. 또 200 초 m / z 스펙트럼 분석에 충분한 데이터를 제공하기 위해 깊이 프로파일 시계열로 연속적으로 수집 하였다. 복원 된 / Z 스펙트럼을 해요 시간 세그먼트는 녹색 음영 지역에서 강조 표시됩니다.

피브로넥틴 널리 세포 배양에 앞서 표면 흡착에 사용되었다; 많은 연구 피브로넥틴은 세포 부착 및 세포 바이오 물질의 상호 작용에 대한 책임이 보였다. 19,20,29 최근 연구 (히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) 브러쉬 엘립 소메 트리를 사용하여 폴리에 흡착 피브로넥틴의 두께를 특징으로한다. 피브로넥틴 박막 3-12 nm 두께. 30 그러한 두께로 측정되었다 수성 SOLU의 깊이 프로파일 분석 합리적인기. SALVI의 발달로 8,9, 고체 표면에 흡착 된 단백질의 수화 직접적인 분석이 가능해. 이 방법은 잠재적으로 동적으로 고체 표면 단백질의 상호 작용을 연구하는 다양한 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.

도 2b는 각각, 피브로넥틴 및 DI 물 샘플 상이한 이차 이온의 선택된 2 차원 영상을 도시한다. 2D 이미지를 죄 후 액면에 대응도 2a 녹색 음영 영역에서 깊이 프로파일 시간 데이터로부터 얻어진 펀치 - 스루 전술 한 바와 같이. 선택된 아미노산 단편 이차 이온의 이미지 메탄 N + C 5 H 7 O + 및 C 4 H 4 NO 2 + (즉, m / z 30, 83, 98) 피브로넥틴 박막은보다 훨씬 더 밝은이었다 DI의 물. 이것은 아미노산 단편 이온 이차 F에 관찰되는 것을 나타낸다2 ㎛의 직경의 개구 내부 피브로넥틴 분자 ROM. 또한, 선택된 피크의 이미지 (예를 들어, m / z 1, 19, 37, 55) 피브로넥틴의 몇몇 물의 클러스터에 대응하는 DI 워터보다 현저히 더 밝다. 이 결과는 피브로넥틴 수화 DI 물에 물 분자와 구별 생체 둘러싼 물 분자를 만드는 것을 보여준다.

요약하면,이 작품은 단백질의 수화에 의한 물 분자 속성 변경에 눈에 띄는 증거를 제공하고 있습니다. 이러한 결과는 미세 액체의 고체 표면에 흡착 된 단백질의 구조, 형태 및 생물학적 활성에 대한 개선 기본적인 이해를 제공 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 <em>제자리의 특성에</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter