Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

In Situ Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet viser en protokoll for væskehåndtering og prøve innføring i en microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analyse av protein biomolekyler i en vandig oppløsning.

Abstract

Dette arbeidet viser in situ karakterisering av protein biomolekyler i vandig løsning ved hjelp av System for analyse i Liquid Vacuum Interface (SALVI) og time-of-flight sekundær ion massespektrometri (TOF-SIMS). Den fibronektin protein Filmen ble immobilisert på silisiumnitrid (SiN) membran som danner SALVI registreringsområdet. Under TOF-SIMS-analyse, ble tre modi for analyse utført inkludert høy romlig oppløsning massespektrometri, to-dimensjonale (2D) avbildning, og dybde profilering. Massespektra ble kjøpt i både positive og negative moduser. Avionisert vann ble også analysert som en referanseprøve. Våre resultater viser at fibronektin filmen i vann har flere distinkte og sterkere vann cluster topper sammenlignet med vann alene. Karakteristiske toppene aminosyre fragmenter er også observerbare i hydrert protein TOF-SIMS spektra. Disse resultatene illustrerer at proteinmolekyl adsorpsjon på en overflate kan studeres Dynamically hjelp SALVI og TOF-SIMS i væsken miljø for første gang.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrering er avgjørende for konstruksjonen, en konformasjon, 2 og biologisk aktivitet tre av proteiner. Proteiner uten vannmolekyler som omgir dem ville ikke ha livskraftige biologiske aktiviteter. Nærmere bestemt vannmolekyler kommuniserer med overflaten og indre struktur av proteiner, og forskjellige hydrering tilstander av proteiner gjøre slike interaksjoner tydelig. 4 Interaksjonen mellom proteiner med faste overflater er en grunnleggende fenomen med implikasjoner i nanoteknologi, biomaterialer og vev tekniske prosesser. Studier har lenge indikert at konformasjonelle forandringer kan oppstå som et protein oppstår en overflate. TOF-SIMS har blitt tenkt som den teknikk som har potensial til å studere protein-faststoffgrenseflaten. 5-7 er det viktig å forstå hydrering av proteiner på faste overflater, noe som potensielt gir en grunnleggende forståelse av mekanismen for deres struktur, konformasjon og biologiskal aktivitet.

Men hovedflate analytiske teknikker er for det meste vakuumbasert og direkte applikasjoner for flyktige flytende studier er vanskelig på grunn av den hurtige fordampning av flyktig væske under vakuum miljø. Vi utviklet et vakuum kompatibel microfluidic grensesnitt, System for analyse i Liquid Vacuum Interface (SALVI), for å muliggjøre direkte observasjoner av flytende overflater og væske solid samhandling ved hjelp av time-of-flight sekundær ion massespektrometri (TOF-SIMS). 8- 11 den unike aspekter omfatter følgende: 1) deteksjonsvinduet er en åpning på 2-3 mikrometer i diameter tillater direkte avbildning av væskeoverflaten, 2) overflatespenningen brukes til å holde væsken i åpningen, og 3) er SALVI portable mellom flere analytiske plattformer. 11,12

SALVI er sammensatt av et silisiumnitrid (SiN) membran som registreringsområdet, og en microchannel fremstilt av polydimetylsiloksan (PDMS). Det er fabricated i rent rom, og fabrikasjon og nøkkelen design faktorer har blitt beskrevet i tidligere artikler og patenter. 8-12 Søknadene av TOF-SIMS som et analytisk verktøy ble demonstrert ved hjelp av en rekke vannløsninger og komplekse flytende blandinger, noen av som inneholdt nanopartikler. 13-17 Nærmere bestemt tillater SALVI væske TOF-SIMS dynamisk sondering av væske-faststoffgrenseflaten av levende biologiske systemer (dvs. biofilm), enkeltceller, og faststoff-elektrolytt-grensesnittet, åpner nye muligheter for in situ kondensert fase studier inkludert væsker ved hjelp av TOF-SIMS. Men den nåværende utforming ikke tillate gass-væske interaksjoner ennå. Dette er en retning for fremtidig utvikling. SALVI har blitt brukt til å studere det hydratiserte proteinet filmen i dette arbeidet for første gang.

Fibronektin er et vanlig brukt protein dimer, som består av to nesten identiske monomerer forbundet av et par av disulfidbindinger, 18, ​​som jegs som er kjent for sin evne til å binde celler. 19,20 Det ble valgt som et modellsystem for å illustrere at det hydratiserte proteinet filmen kan være dynamisk analysert ved hjelp av SALVI flytende TOF-SIMS tilnærming. Proteinløsningen ble innført i microchannel. Etter inkubering i 12 timer, et hydratisert proteinfilm dannet på baksiden av SiN membranen. Deionisert (DI) vann ble anvendt for å skylle av kanalen etter at proteinet innledning. Informasjon ble samlet inn fra hydrerte fibronektin proteinmolekyler i SALVI microchannel bruker dynamisk TOF-SIMS. DI vann ble også undersøkt som en kontroll for å sammenligne med resultatene fra hydrert fibronektin tynn film. Det ble ikke observert tydelige forskjeller mellom hydrert protein film og DI vann. Dette arbeidet viser at protein adsorpsjon på overflaten i væsken miljøet kan studeres ved hjelp av romanen SALVI og væske TOF-SIMS tilnærming. Videoen protokollen er ment å gi teknisk veiledning for folk som er interesserti å utnytte denne nye analyseverktøy for ulike anvendelser av SALVI med TOF-SIMS og redusere unødvendige feil i væskehåndtering samt TOF-SIMS datainnsamling og analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Rengjøring og sterilisering av SALVI Mikro

  1. Sterilisering av Mikro i SALVI
    1. Tegn 2 ml av 70% etanol, vandig løsning i en sprøyte, kobler sprøyten med innløpsenden av SALVI, og langsomt injisere 1 ml av væsken i 10 min. Fjern sprøyten ved slutten av injeksjonen. Deretter kobler innløp og utløp av SALVI bruke en polyetereterketon (PEEK) union. Alternativt bruke en sprøytepumpe til å gjennomføre samme prosedyre. For eksempel sette flyten hastigheten 100 mL / min.
    2. Hold SALVI microchannel fylt med 70% etanolløsning ved romtemperatur i 4 timer.
  2. Introduser ionisert (DI) Vann til SALVI
    1. Tegn 2 ml sterilisert DI vann inn i en sprøyte, kobler sprøyten med innløpet av SALVI, og langsomt injisere 1 ml av væsken i 10 min. Fjern sprøyten, og koble innløp og utløp av SALVI bruke en PEEK union. Alternativt bruke en sprøytepumpe som nevnt itrinn 1.1.1.

2. Immobilisering av protein Film i SALVI

  1. Immobilize Protein Film i SALVI
    1. Tegn 2 ml fibronektin (10 ug / ml i fosfatbufret saltoppløsning, PBS) løsning i en sprøyte, kobler sprøyten med innløpet av Salvi langsomt injiseres 1 ml av væsken i 10 minutter, fjern sprøyten, og koble innløpet og utløp av SALVI bruke en PEEK union.
    2. Inkuber SALVI fylt med fibronektin oppløsning i en ren dyrkningsskål, holde fatet i hetten ved romtemperatur i 12 timer.
    3. Tegn 2 ml sterilisert DI vann inn i en sprøyte og koble sprøyten med innløpet til SALVI. Sakte injisere 1 ml vann i 10 minutter, fjern sprøyten og koble innløp og utløp av SALVI.
      Merk: Hvis motoren er utstyrt med et lysmikroskop, sjekk SALVI under mikroskop for å sikre at SiN membranen er intakt før TOF-SIMS analyse. Nå SALVI enheten er klar for TOF-SIMS enalysis.

3. Sett SALVI inn i TOF-SIMS Loadlock Chamber

Merk: Hansker skal til enhver tid ved håndtering av SALVI enheten og installere den på TOF-SIMS scenen for å unngå potensielle forurensninger under overflaten analyse.

  1. Mount SALVI på scenen
    1. Legg den TOF-SIMS scenen på en flat og ren overflate. Sett SALVI enhet på scenen med silikonplaten og SiN membranen vendt oppover. Fest SALVI med fire metallklemstykker og skru metall stykker som holder hjørnet av enheten i metallplaten med fire skruer.
    2. Forsiktig rulle opp den PFTE slange som er koblet til mikrofluidkanal. Bruk fire biter av metall og fire skruer for å holde den stive delen ned. Sørg for at enheten er plassert i den åpne plassen på SIMS scenen slik at det ikke forstyrrer den primære ion stråle under analysen. Tilleggs bilde og illustrasjon av SALVI fabrication og installasjon er tilgjengelig i tidligere publikasjoner. 8,9,11
  2. Monter Faraday Cup på scenen
    1. Fest Faraday cup på scenen med en skrue.
  3. Laste Stage inn i TOF-SIMS Loadlock Chamber
    1. Åpne TOF-SIMS loadlock, hold og satte scenen horisontalt på lasteplanet, og lukk loadlock døren.

4. TOF-SIMS Data Acquisition

  1. Slå på vakuumpumpen og sikre passende vakuum (for eksempel i størrelsesorden 10 mbar eller -6 Torr) blir nådd i loadlock kammeret.
  2. Flytt SALVI inn i hovedkammeret når vakuumet er stabilisert etter ca. 30 min.
    Merk: Vakuumet bør være lavere enn 5 x 10 -6 mbar vakuum i hovedkammeret under datainnsamling. Ellers er høyere vakuum indikasjon på en lekkasje i den SALVI systemet.
  3. Juster den primære ion stråle og analysator fra TOF-SIMS med enromlig oppløsning på ca 400 nm i henhold til produsentens anbefalinger. Den nåværende av primærbjelken er 1200 pA mens syklustiden er 30 usek i henhold til DC-modus.
    Merk: Denne prosessen i stor grad følger produsentens anbefalinger.
  4. Finn microfluidic kanal med optisk mikroskop. Bruk den optiske bilde sentrum som referanse og justere den til å være i samsvar med den sekundære ion bildet sentrum.
  5. Før hver måling, bruk en en KeV O 2 + bjelke (~ 40 nA) for å skanne på SiN vindu med en 500 x 500 mikrometer 2 område for ~ 15 sek for å fjerne støv. Også bruke et elektron flom pistol for å kompensere overflaten lading under alle målinger. Bruk den automatiske funksjonen av flom pistol i standardmodus for dette trinnet.
  6. Velg positiv eller negativ modus før datainnsamling. Bruk 25 keV Bi 3 + bjelke som den primære ionestrålen i alle målingene.
    Merk: Trinnene er lik feller positive og negative data oppkjøp. For interessen til plass, er den positive måte som er beskrevet i detaljer her.
    1. dybde Profilering
      1. Skanne Bi 3 + strålen på et rundt område med en diameter på ~ 2 mikrometer med 32 bildeelementer av 32 piksler oppløsning.
      2. For å minimere tiden det tar å punch-gjennom SiN membran, bruk en lang puls bredde (dvs. 180 ns, strålestrømmen ~ 1,0 Pa ved en syklus tid på 100 usekunder) Bi 3 + bjelke. Intensitetene av sekundære ioner som er representative fra væskeoverflaten øker når stansegjennom er nådd. Den slag-through Tiden varierer fra 300 sekunder til 500 sekunder, avhengig av batchen av SiN membranen.
        Merk: Denne forskjellen ser ut til å være relatert til batch av SiN membraner ervervet i henhold til vår erfaring. Imidlertid ikke punsj-gjennom tiden egentlig ikke påvirke dataanalyse.
      3. Etter SiN membran punch-gjennom, holde den samme strømmen for ca 200 sek tilskaffe tilstrekkelige data for 2D-bilde rekonstruksjoner.
      4. Reduser pulsbredden til 80 nanosekunder for datainnsamling for å skaffe spektra med bedre masse oppløsning. Fortsett denne oppkjøp for om en annen 200 sek. De spektrumdata er vist i figur 1 er hentet fra denne regionen.
    2. 2D-avbildning og Mass Spectra
      1. Samle 2D-avbildning og massespektra eller data samtidig ved måling av dybde profildata. Den TOF-SIMS instrument lagrer all informasjon om hver flekk under forsøket. Dataene er vist i forskjellige vinduer (FPanel - Spectra, FPanel - Profiler og FPanel - Bilder separat) av digital kontroll programvare. Sjekk dataene i hvert panel judiciously under datainnsamling.

5. TOF-SIMS dataanalyse

Merk: Data analyse er i utgangspunktet utført ved hjelp av IonToF TOF-SIMS instrumental programvare.

  1. Åpne enalysis programvare av SIMS (Måling Explorer), og klikk deretter på "profiler", "spektra" og "bilde" knapper, henholdsvis å behandle dybde profil, m / z spekteret, og bildedata.
  2. Åpne datafiler som har filtypen ".ita".
  3. Velg topper av interesse, skriver artsnavnet i "ion" boksen, og merke dem med forskjellige farger i spekteret. Bruk rullehjulet på musen til å dra langs x-aksen. Bruk Ctrl og rullehjulet for å justere topphøyder og bredder. Bokstaven "L" veksler mellom lineære og Log moduser langs y-aksen.
  4. Gjennomføre data rekonstruksjon før masse kalibrering. Hvis ikke, er det vanskelig å velge avstanden mellom toppene i massen kalibreringstrinnet.
    1. Velg dybde profilering data av interesse og rekonstruere spektra henhold til dybden profilen tidsbestemte serie.
    2. Klikk på gjenoppbygging knappen. I "Start Reconstruction" vinduet, skriv inn en skanning rekke interest. Klikk "OK" for å rekonstruere dybde profildata.
  5. Utfør en masse kalibrering. Trykk "F3" for å åpne "mass kalibrering" -vinduet. Velg topper for kalibrering basert på den spesifikke prøven. 21 I dette arbeidet bruker følgende topper CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) og H 13 O 6 + (m / z 109) for den positive modus. Bruke følgende topper CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C-2 H - (m / z 25), C3-H - (m / z 37), og C-4 H - (m / z 49) for den negative modus.
    1. Velg en topp,sørge for at pilen nedover peker på topp i nedre venstre hjørne av vinduet. Klikk på at topp og skriv toppen navn i "mass kalibrering" -vinduet, klikk på "Legg til", og ion av renter er inkludert i massen kalibrering.
    2. Til slutt klikker du på "Omkalibrer" -knappen. Sjekk om de områdene av toppene er på riktig sted i henhold til deres masse å lade forholdstall. I "Spectrum" -menyen, velg og klikk "Apply Mass Calibration" til "All Spectra" eller "Valgt spektra", avhengig av den spesifikke analysen blir gjennomført.
  6. Som topp-valget er nødvendig for analyse av prøver, bestemme karakteristiske topper i prøven i henhold til litteratur eller andre tidligere funn. Sammenligne intensiteten av toppene av interesse i m / z spektra. Om nødvendig, legge til nye topper eller slette ubrukelige topper i toppen listen.
    1. Legg toppene. Klikk på en topp, finner de røde linjene på venstre nederste vinduet. Hold "Ctrl" -tasten, rull musen horisontalt for å definere toppens bredde, som legger en topp til topp listen automatisk. En annen måte å legge til en topp, er å velge en topp i hoved spekteret vinduet, og deretter klikke på "legg til peak" knappen over vinduet. Hvis det er mange topper å legge til, i "Spectrum" -menyen, velg "Søk topper", sjekk relaterte spesifikasjoner i det nyåpnede vinduet, og deretter legge topper etter behov.
    2. Slik eksporterer en topp liste, i "Peak List" -menyen, velg "Lagre ..." peak listen i "itmil" format. Bruk Ctrl og venstre knapp for å dra langs spekteret. I spektra vinduet velger du en topp på interesse og dra de to stiplede linjene til attraktive stillinger.
    3. Slik importerer du en topp liste, i "Mass intervall List" -menyen, velg "Import ...", finn en eksisterende topp liste fil med filtypen ".ITPL". Klikk "Open".
    4. For å bruke en "itmil" peak-listen iden "Mass Intervall List" menyen, klikk "Åpne ...", finne filen og klikk "Åpne".
  7. Påfør en topp liste for å analysere data. På venstresiden av "Spectra" vinduet, det er et vindu som heter "Mass Interval List". Den importerte topp liste er vist her oppe.
    1. Høyreklikk på topp liste filen som skal brukes, gjelder det til "aktiv spekteret" eller "alle spektra".
  8. Vis dataprofilene. I "Profil" vindu, for å bruke bokstaven "M" passer til vindu (full range) og bokstaven "N" for å passe til y-aksen. Bruk Ctrl og rullehjul for å justere profilen bredde. Eller bruk "/" og "*" på nøkkelen bord å endre y-aksen rekkevidde og høyde.
  9. Eksport av data for videre plotting med annen grafisk programvare etter den første analysen.
    1. For å eksportere en dybde profil, i "Profil" -vinduet, klikk på "File" -menyen, velg deretter "Export & #34 ;, og velg "Lagre som" a ".txt" fil.
    2. Slik eksporterer du en m / z spekteret fil, i "Spectra" -vinduet, klikk på "File" -menyen, velg deretter "Export", og velg deretter "Lagre som" a ".txt" fil.
    3. Slik eksporterer en bildefil, i "Image" vinduet, print screen og lagre som bildefilen.

6. TOF-SIMS data Plotting og Presentasjon

Merk: Bruk en grafisk verktøy for å plotte data etter The Sims opplysningene behandles med instrumental programvare.

  1. Bruk en grafisk verktøy for å importere dataene.
  2. Lage et plott med m / z som x-aksen og toppintensitet som y-aksen for å vise den rekonstruerte spektrum. Et eksempel er gitt i figur 1.
  3. Lage et plott ved hjelp av frese tid som x-aksen og toppintensitet som y-aksen for å vise den rekonstruerte dybdeprofilen tidsbestemte serie. Et eksempel er gitt i Figure to.
  4. Kombiner rekonstruerte 2D-bilder av forskjellige m / z og danne en matrise for å vise ion kartlegging. Et eksempel er gitt i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et par representative resultater er presentert for å demonstrere fordelene med den foreslåtte protokoll. Ved hjelp av SALVI mikrofluidgrensesnittet, kan primær ionestrålen (Bi 3 +) direkte bombardere på det hydratiserte fibronektin filmen i DI-vann. Således molekyl kjemisk kartlegging av væskeoverflaten kan med hell ervervet.

Figur 1a og 1b viser den positive TOF-SIMS massespektra av det hydratiserte fibronektin film og DI vann, respektivt. Toppene av interesse, inkludert vann klynger (dvs. m / z 19, 37, 55, 73, 91 og 109), og aminosyre-fragmenter (dvs. m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, og 98) er angitt med røde piler. I tillegg til de karakteristiske topper i aminosyre-fragmenter, som har vært mye rapportert bruk av tørre proteinprøver, er toppene av vann klynger observert imassespektra av hydrert fibronektin film i DI vann. Videre er intensitetene av disse vann klase toppene er svært forskjellige fra de i den massespektra av DI vann. Dette resultatet tilveiebringer direkte bevis for egenskapen av vannmolekyler omgir og inne i hydratiserte proteinmolekyler som spiller en rolle i deres adsorpsjon på en overflate.

Figur 2a viser den dybdeprofilen tidsserier av det hydratiserte fibronektin film og DI vann. Som prøven er under SiN membran, intensiteten av utvalgte andre ioner er ubetydelig før SiN membranen slo gjennom (dvs. 280 sek for fibronektin og 340 sek for DI vann). Når SiN membranen slo gjennom, intensiteten av disse sekundære ioner øke betydelig. Ved bruk av lange pulsbredde, er massen oppløsningen forholdsvis lav. Derfor er den korte bredde prosessen puls benyttet for å oppnå data med bedre oppløsning massefor bilde- og spektrum rekonstruksjoner som uthevet i figur 2a. Etter en periode av tid (dvs. 60 sekunder for fibronektin og 220 sek for DI-vann), den reduserte pulsbredde er anvendt for å oppnå m / z spektre med bedre masse oppløsning. De endelige m / z-spektra ble rekonstruert fra 200 sek målinger fremhevet i grønne skraverte områder i dybdeprofilen tidsbestemte serie. Figur 2b viser 2D bildene fra det hydratiserte fibronektin film og DI-vann, noe som tilsvarer den grønne skraverte området i figur 2a. Disse 2D-bilder representerer grevene av utvalgte sekundære ioner fra prøven: lysere bildet, jo høyere annenhånds ion teller. Slike intuitive bilder gi en klar sammenligning av utvalgte sekundære ioner mellom forskjellige prøver, noe som er nyttig i dataanalyse. Ifølge våre erfaringer, forskjellen i SiN punch-gjennom tiden varierer fra parti til parti av synden membraner. Men det betyr ikke påvirke retene av den dynamiske TOF-SIMS analyse.

Figur 1
Figur 1: Sammenligning av den TOF-SIMS positiv spektra av det hydratiserte fibronektin film og DI vann i SALVI microchannel (a) Den rekonstruerte m / z spektrum av fibronektin.. (B) DI vann spektrum.

Figur 2
Fig. 2: Dybde profiler og 2D-bilder av hydratisert fibronektin og DI-vann (a) dyp profilering tidsserier av fibronektin og DI vann i den positive modus. (B) 2D-bilder rekonstruert som tilsvarer den grønne skraverte 200 sek tidssegmenter langs dybdeprofilen tidsserier i (a). Flere karakteristiske masse å belaste Nøkkeltall av relevans for vann klynger(F.eks, m / z 1, 19, 37, 55) er vist i tillegg til kjente aminosyre fragmenter (f.eks, m / z 30, 83, 98). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI er en microfluidic grensesnitt som lar dynamisk væskeoverflaten og væske-solid grensesnitt analyse av vakuumbaserte instrumenter, for eksempel TOF-SIMS og scanning elektronmikroskopi (SEM). På grunn av bruken av små åpninger for å utsette væsken direkte i vakuum, er SALVI egnet for mange fint fokuserte spektroskopi og bildeteknikker uten noen modifikasjoner, 22 portabilitet og allsidighet MicroFluidics gjør det til en sann multimodal bildebehandling plattformen. Forskjellige funksjoner og betydningen av SALVI forhold til andre eksisterende teknikker er oppsummert i flere nyere anmeldelser. 22-25 Som utvikler av SALVI teknologi, har vår gruppe vært aktivt bruke det på en rekke studier som involverer dynamiske flytende overflater og væske solid grensesnitt . Noen eksempler på nye anvendelser inkluderer pattedyrcellemembraner, bakterier biofilm feste, 15,16 eller nanopartikkeldannelse som følge av vandige overflate oksidasjoner. I dette paper presenterer vi første flytende ToF-SIMS resultatene av hydrert protein tynn film adsorbert på SiN overflaten.

Det er helt avgjørende å nøye håndtere de uthevede trinnene i protokollen. For eksempel når tegning væske inn i sprøyten i trinn 1 og 2, sørg for at det ikke er noen bobler inni sprøyten. Fordi når boblene blir injisert i SALVI, kan de forårsake lekkasje i vakuum. 9 Derfor, hvis noen bobler er observert, er det klokt å bli kvitt dem ved å sette sprøyten oppreist og forsiktig skyve bobler ut. I tillegg er det svært viktig å gjøre SiN vinduet i SALVI flat for optimalisert TOF-SIMS analyse, som beskrevet i trinn 3. Dette jevnheten av registreringsområdet direkte påvirker datakvalitet i henhold til design av TOF-SIMS. 26 Det er nødvendig for å visuelt inspisere enheten etter å sikre alt på SIMS scenen. Hvis SiN vinduet ikke er vannrett, juster skruene og endre høydenav Salvi enheten for å sikre at alt er i det samme plan som mye som mulig. Disse delikate punkter trenger erfaring og nøyaktighet, som avgjør suksessen og pålitelighet av hele forsøket.

Som vist i figur 1b, toppene med m / z 19, 37, 55, 73, 91 og 109 har høye tellinger. Dette indikerer at det finnes en god del vann klynger (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + og H 13 O 6 +) i den positive sekundære ioner. De andre vann klynger (data ikke vist) med høyere m / z-verdier har også forholdsvis sterke topper sammenlignet med deres tilgrensende topper. Disse store mengder vann klynger sendes ut fra DI vannoverflaten etter SiN slag gjennom. Vann klynge signaler i positiv modus har ikke vært observerbare i den foregående work; og dette ble tilskrevet den lave tellinger av sekundære ioner og ikke-optimaliserte ToF-SIMS forhold i fortiden. 8 Med kontinuerlig innsats i å optimalisere Salvi og ToF-SIMS oppkjøps forhold som den primære ion stråle (dvs. Bi + vs . Bi 3 +), pulsbredde og strømforhold under dybde profilering, er det nå mulig å observere opptil 44 vannklasene i positiv modus ved hjelp forholdene presenteres i denne artikkelen. Resultatene som vises her er lovende for ytterligere å undersøke hvilken rolle vann i dynamikken i ulike biologiske molekyler og biologiske systemer.

Her som et eksempel for å illustrere fordelene ved SALVI og TOF-SIMS i å studere biologiske molekyldynamikk ble hydrering av fibronektin protein presenteres. Toppene m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83 og 98 hører til aminosyre-fragmentene i henhold til den tidligere rapport, 27,28 som er mye sterkere enn de av DI water vist i figur 1b. Denne forskjellen i økt intensitet til aminosyrere fragmenter i fibronektin prøven antyder at disse sekundære ioner er faktisk fra proteiner i seg selv. I tillegg toppene av vann klynger i figur 1a er mye sterkere enn de av DI vann i figur 1b, noe som innebærer at egenskapene til vannmolekyler i protein adsorpsjon overflate og grenseflate løsning kan være meget forskjellige fra de i rent vann.

Figur 2a viser representative dybde profilering tidsbestemte serie av to forskjellige prøver: fibronektin og DI vann i SALVI microchannel. Dybde profilering data ble samlet som SiN vinduet ble bombardert av Bi 3 + primære ion stråle med lang pulsbredde. Som vist i figur 2a, er SiN vinduet slo gjennom på rundt 300 sek. Før SiN vinduet i SALVI er stanset through, intensitetene av utvalgte sekundære ioner er ganske lav. Når SiN vinduet er stanset igjennom, intensitetene til de sekundære ioner umiddelbart øke etter hvert som væskeoverflaten begynner å bli bombardert av primær ionestrålen. For eksempel er intensitetene av H + og H 3 O + viser en stor økning, noe som viser observasjon av vannflaten. 8,9 Selv om intensitetene er ustabile rett etter slag-gjennom eller ved grenseflaten, kan de nå forholdsvis stabil verdier etter en viss tid (for eksempel 60 sekunder for fibronektin og 220 sek for DI-vann, henholdsvis i figur 2a). Forskjellen i det lange borepulsbredde ikke virkelig påvirke analyseresultatene illustrert her når rekonstruere m / z spektra (f.eks figur 1), fordi de effektive m / z spektra er ervervet etter SiN slag gjennom. Imidlertid kan en forsker velger å bruke de samme vilkår for alle prøvene for konsistens og lette i å velge data seksjoner under dataanalyse. For å oppnå bedre masse oppløsning, ble den pulsbredden reduseres deretter og intensitetene ble redusert tilsvarende i den sistnevnte del av dybde profilering eksperimentet. Den dybdeprofilen tidsserien ble kontinuerlig oppsamlet for ytterligere 200 sekunder for å tilveiebringe gode data for m / z spektralanalyse. Segmentene tid som m / z spektra ble rekonstruert er uthevet i grønne skraverte områder.

Fibronektin har blitt mye brukt for overflateadsorpsjon forut for celledyrking; Mange studier har vist fibronektin er ansvarlig for celleadhesjon og celle-interaksjoner biomateriale. 19,20,29 En nyere studie karakterisert tykkelsen av fibronectin absorbert på poly (metakrylat) hydroxylethyl børstene ved hjelp av ellipsometry. Fibronektinet tynn film ble bestemt til å være 3-12 nm. 30 En slik tykkelse er rimelig i forhold til dybde profilering analyse i en vandig oppløsesjon. 8,9 Med utviklingen av Salvi er direkte analyse av det hydratiserte proteinet adsorbert på den faste overflate nå mulig. Denne tilnærmingen potensielt kan ha brede programmer i å studere interaksjoner mellom proteiner med faste overflater dynamisk.

Figur 2b viser de valgte 2D-bilder av forskjellige sekundære ioner fra fibronectin og DI vannprøver, henholdsvis. 2D-bilder er hentet fra dybde profilering temporale data fra grønne skyggelagte områder i figur 2a, som tilsvarer væskeoverflaten etter at SiN kraft mot gjennom som beskrevet tidligere. Bildene av valgte aminosyre fragmentsekundærioner CH 4 N +, C 5 H 7 O + og C-4 H 4-NO 2 + (dvs. m / z 30, 83 og 98) for fibronektin tynne filmen var mye lysere enn de som er for DI vann. Dette indikerer at aminosyren fragment sekundære ioner observert fROM fibronektin molekylene inne i diameter blenderåpning 2 mikrometer. Videre er bilder av valgte topper (f.eks m / z 1, 19, 37, og 55) som svarer til flere vann klynger av fibronektin er bemerkelsesverdig lysere enn de av DI vann. Dette resultat viser at hydrering av fibronektin gjør vannmolekyler omgir biomolekyl forskjellig fra vannmolekyler i DI-vann.

Oppsummert har dette arbeidet gitt slående bevis på protein hydration indusert vannmolekyl eiendoms endringer. Slike resultater kan tilveiebringe en forbedret grunnleggende forståelse av strukturen, konformasjon, og biologisk aktivitet av proteiner adsorbert på en fast overflate i væskemikromiljøet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>In Situ</em> Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter