Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Непосредственное определение характеристик гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS

doi: 10.3791/53708 Published: February 15, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Эта работа представляет собой протокол для жидкого обработки и ввода пробы для микроканале для на месте времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрического анализа белковых биомолекул в водном растворе.

Abstract

Эта работа демонстрирует Непосредственное определение характеристик белковых биомолекул в водном растворе при помощи системы для анализа на жидкостные вакуумные интерфейса (SALVI) и времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрии (TOF-SIMS). Фибронектин белок фильм был иммобилизован на нитрид кремния (SiN) мембраны, которая формирует зону обнаружения SALVI. При анализе ToF-SIMS, были проведены три режима анализа в том числе высокое пространственное разрешение масс-спектрометрии, двумерный (2D) изображений, и глубине профилирования. Масс-спектры получали в положительных и отрицательных режимах. Деионизированную воду также анализировали качестве образца сравнения. Наши результаты показывают, что фибронектин пленка в воде имеет более четкие и сильные воды кассетные пики по сравнению с водой в одиночку. Характерные пики фрагментов аминокислотных также наблюдаемая в гидратированном белка спектров ToF-SIMS. Эти результаты показывают, что адсорбция молекула белка на поверхности могут быть изучены DynamicaLLY использованием SALVI и TOF-SIMS в жидкой среде впервые.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гидратация имеет решающее значение для структуры, 1 конформации, 2 и биологической активности 3 белков. Белки без молекул воды вокруг них не было бы жизнеспособных биологических активностей. В частности, молекулы воды взаимодействуют с поверхностью и внутренней структуры белков, а также различные гидратации состояния белков сделать такие взаимодействия различны. 4 Взаимодействие белков с твердыми поверхностями является фундаментальным явлением с последствиями в области нанотехнологий, биоматериалов и тканевой инженерии процессов. Исследования уже давно показали, что конформационные изменения могут происходить как белок обнаруживает поверхность. ToF-SIMS было предусмотрено как метод, который имеет потенциал для изучения белок твердый интерфейс. 5-7 Важно понимать гидратации белков на твердых поверхностях, которые потенциально обеспечивает глубокое понимание механизма их структуры, конформации, и биологическаяаль деятельность.

Тем не менее, основной поверхности аналитические методы в основном вакуумной основе и прямые заявки на летучих жидких исследований сложно из-за быстрого испарения летучей жидкости под вакуумной среде. Мы разработали вакуум совместимы Микрожидкостных интерфейс, система анализа на жидкий вакуум (SALVI), чтобы позволить прямые наблюдения поверхности жидкости и жидкость-твердое взаимодействий с использованием времени пролета вторичной ионной масс-спектрометрии (TOF-SIMS). 8- 11 уникальных аспектов относятся следующие: 1) окно обнаружения апертура 2-3 мкм в диаметре, допускающие непосредственное визуализации поверхности жидкости, 2) поверхностное натяжение используется для хранения жидкости внутри апертуры, и 3) SALVI является переносимыми между несколькими аналитическими платформами. 11,12

SALVI состоит из нитрида кремния (SiN) мембраны в качестве зоны детектирования и микроканале из полидиметилсилоксана (PDMS). Это РаЬгльные в чистом помещении, а также изготовления и ключ конструктивные особенности были подробно описаны в предыдущих работах и патентов. 8-12 Применения TOF-SIMS в качестве аналитического инструмента были продемонстрированы с использованием различных водных растворов и сложных жидких смесей, некоторые из который содержал наночастицы. 13-17 частности, SALVI жидкость ToF-SIMS позволяет динамическое зондирование жидкость-твердое интерфейс живых биологических системах (т.е., биопленки), одиночных клеток, и интерфейс с твердым электролитом, что открывает новые возможности для месте конденсированной фазе в исследования, включающие жидкостей с помощью TOF-SIMS. Тем не менее, текущий дизайн не позволяет газожидкостных взаимодействий пока. Это направление для будущего развития. SALVI был использован для изучения гидратированного белковой пленки в этой работе впервые.

Фибронектин является широко используемым белковый димер, состоящий из двух почти идентичных мономеров, соединенных парой дисульфидных связей, 18, ​​которые яы хорошо известен своей способностью связывать клетки. 19,20 он был выбран в качестве модельной системы для иллюстрации того, что гидратированная белок фильм мог быть динамически исследовали с помощью SALVI жидкость TOF-SIMS подхода. Белковый раствор вводят в микроканале. После инкубации в течение 12 ч, гидратированный белок пленка формируется на задней стороне мембраны SiN. Деионизованной водой (DI) был использован, чтобы смыть канал после введения белка. Информация была собрана из гидратированных фибронектин белковых молекул в микроканале SALVI использованием динамического TOF-SIMS. DI вода также изучалась в качестве контроля для сравнения с результатами, полученными из гидратированного фибронектина тонкой пленки. наблюдались отчетливые различия между гидратной пленки белка и дистиллированной водой. Эта работа показывает, что адсорбция белка на поверхности в жидкой среде могут быть изучены с использованием нового SALVI и жидкого ToF-SIMS подход. Видео протокол предназначен для обеспечения технического руководства для тех, кто интересуетсяпри использовании этого новый аналитический инструмент для разнообразных применений SALVI с TOF-SIMS и сократить ненужные ошибки в жидкой обработки, а также сбора данных ToF-SIMS и анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Очистка и Стерилизация Микроканал SALVI

  1. Стерилизация Микроканал в SALVI
    1. Draw 2 мл 70% этанола водный раствор в шприц, соединить шприц с входным концом SALVI, и медленно вводят 1 мл жидкости за 10 мин. Удалите шприц в конце инъекции. Затем подключите вход и выход из SALVI помощью полиэфирэфиркетоновой (PEEK) союз. С другой стороны, использовать шприцевой насос, чтобы провести ту же процедуру. Например, установить скорость потока при 100 мкл / мин.
    2. Хранить SALVI микроканал заполненную 70% -ным раствором этанола при комнатной температуре в течение 4 ч.
  2. Представьте деионизированной (ДИ) воды в SALVI
    1. Draw 2 мл стерилизованной дистиллированной водой в шприц, соединить шприц с входом SALVI, и медленно вводят 1 мл жидкости за 10 мин. Удалите шприц, и подключить вход и выход из SALVI использованием PEEK союз. С другой стороны, использовать шприцевой насос, как указано вшаг 1.1.1.

2. Иммобилизация белковой пленки в SALVI

  1. Остановите белковой пленки в SALVI
    1. Draw 2 мл фибронектина (10 мкг / мл в фосфатно-солевом буфере, PBS), раствор в шприц, соединить шприц с входом SALVI, медленно вдохнуть 1 мл жидкости за 10 мин, удалить шприц, и соединить впуск и выход SALVI использованием PEEK союз.
    2. Инкубируйте SALVI наполнена раствором фибронектина в чистом культуральной чашке, держать блюдо в шкафу при комнатной температуре в течение 12 ч.
    3. Draw 2 мл стерилизованной дистиллированной водой в шприц и подсоединения шприца с входным отверстием SALVI. Медленно введите 1 мл воды в течение 10 мин, удалите шприц, и подключить вход и выход из SALVI.
      Примечание: Если система оборудована световым микроскопом, проверить SALVI под микроскопом, чтобы убедиться, что мембрана SiN цела перед анализом ToF-SIMS. Теперь устройство SALVI готов к ВП SIMSalysis.

3. Установите SALVI в ToF-SIMS Loadlock палаты

Примечание: необходимо надевать перчатки при всех случаях при обращении устройство SALVI и установка его на сцену ToF-SIMS, чтобы избежать возможных загрязнений во время анализа поверхности.

  1. Маунт SALVI на сцену
    1. Положите этап ToF-SIMS на плоской и чистой поверхности. Поместите устройство SALVI на сцену с кремниевую пластину и SiN мембраны вверх. Закрепить SALVI помощью четырех металлических зажима частей и винтовых металлических деталей, удерживающие угол устройства в металлической пластине при помощи четырех винтов.
    2. Аккуратно скатать ПТФЭ трубки, подключенного к микрожидком канала. Используйте четыре металлических деталей и четыре винта провести жесткую часть вниз. Убедитесь, что устройство позиционируется в открытом космосе на стадии SIMS так, чтобы он не мешал первичным ионным лучом во время анализа. Дополнительное изображение и иллюстрация изго SALVIионов и установка имеются в предыдущих публикациях. 8,9,11
  2. Установите Фарадея в рабочую
    1. Закрепить цилиндр Фарадея на сцене с помощью винта.
  3. Загрузите сцены в TOF-SIMS Loadlock палата
    1. Откройте loadlock ToF-SIMS, удерживать и подготовить почву горизонтально на погрузочной платформе, и закройте дверцу loadlock.

4. ToF-SIMS сбора данных

  1. Включите вакуумный насос и обеспечить подходящую вакуум (например, порядка 10 -6 мбар или Торр) достигается в loadlock камере.
  2. Перемещение SALVI в основную камеру после того, как вакуумная стабилизируется после примерно 30 мин.
    Примечание: вакуум должен быть ниже, чем 5 · 10 -6 мбар в основной камере во время сбора данных. В противном случае, высокий вакуум свидетельствует об утечке в системе SALVI.
  3. Регулировка пучка первичных ионов и анализатор TOF-SIMS сПространственное разрешение приблизительно 400 нм в соответствии с рекомендациями производителя. Ток первичного пучка 1200 пА, а время цикла составляет 30 мкс в режиме постоянного тока.
    Примечание: Этот процесс во многом соответствует рекомендациям производителя.
  4. Найти микрожидкостных канал с помощью оптического микроскопа. Используйте оптический центр изображения в качестве ориентира и приведения его в соответствие с вторичного центра иона изображения.
  5. Перед каждым измерением, использовать 1 кэВ O 2 + пучок (~ 40 нА) для сканирования в окне SiN с площадью 500 х 500 мкм 2 для ~ 15 сек, чтобы удалить поверхностные загрязнения. Кроме того, использовать наводнения пистолет электронов для компенсации поверхности загрузки в ходе всех измерений. Используйте автоматическую функцию наводнений пистолета в режиме по умолчанию для этого шага.
  6. Выберите положительное или отрицательное режим перед сбором данных. Используйте 25 кэВ Bi 3 + луч в качестве первичного ионного пучка во всех измерениях.
    Примечание: шаги аналогичны еили положительные и отрицательные поглощений данных. Для экономии места, положительный режим описан в деталях здесь.
    1. Глубина профилирования
      1. Сканирование Би 3 + луч на круглом области диаметром ~ 2 мкм с 32 пикселей на разрешение 32 точек.
      2. Чтобы свести к минимуму время, необходимое для сквозной мембраны SiN, использовать длинный длительность импульса (т.е. 180 нс, ток пучка ~ 1,0 Па при времени цикла 100 мкс) Bi 3 + пучка. Интенсивности вторичных ионов представителя из жидкой увеличения поверхности при сквозной достигается. Сквозной время варьируется от 300 сек до 500 сек, в зависимости от партии мембраны SiN.
        Примечание: Эта разница, кажется, связано с серией SiN мембраны приобретенных в соответствии с нашим опытом. Тем не менее, сквозной время на самом деле не влияет на анализ данных.
      3. После мембраны SiN сквозной, держать тот же ток около 200 сек доПолучены достаточные данные для реконструкций 2D изображения.
      4. Уменьшить ширину импульса 80 нс для сбора данных о приобретении спектры с лучшей массового разрешения. Продолжить это приобретение еще примерно 200 сек. Данные спектров показаны на рисунке 1, получены из этой области.
    2. 2D изображений и Масс-спектры
      1. Сбор 2D изображений и данных масс-спектров, в то же время, когда измерения данные глубина профилирования. Прибор ToF-SIMS сохраняет всю информацию о каждом месте в ходе эксперимента. Данные приведены в разных окнах (FPanel - Spectra, FPanel - профили и FPanel - изображения отдельно) цифрового управляющего программного обеспечения. Проверьте данные в каждой панели рассудительно во время сбора данных.

Анализ 5. ToF-SIMS данных

Примечание: Анализ данных сначала осуществляется с помощью IonToF ToF-SIMS инструментальную программу.

  1. Откройте апalysis программное обеспечение SIMS (Проводник Измерение) и нажмите кнопку «Профили», «спектры 'и' кнопки изображение ', соответственно, обрабатывать глубина профиля, м / г спектр и данные изображения.
  2. Открыть файлы данных, которые имеют расширение ".ita".
  3. Выберите пики интереса, введите имя вида в окне "ионного", и обозначить их разными цветами в спектрах. Используйте колесо прокрутки мыши, чтобы перетащить на оси абсцисс. Используйте Ctrl и колесо прокрутки для регулировки высоты пиков и ширины. Буква "L" переключается между режимами линейных и журналов вдоль оси у.
  4. Провести реконструкцию данных перед калибровкой массового. В противном случае, трудно выбрать интервал между пиками на стадии массового калибровки.
    1. Выбор глубины профилирования данных, представляющих интерес и реконструировать спектры в зависимости от глубины профиля временных рядов.
    2. Нажмите кнопку восстановления. В окне "Старт реконструкции", тип в диапазоне сканирования Interest. Нажмите "OK", чтобы восстановить данные глубина профиля.
  5. Выполните калибровку масс. Пресс "F3", чтобы открыть окно "масса калибровки". Выберите пики калибровки на основе конкретного образца. 21 В этой работе, использовать следующие пики СН 3 + (м / з 15), H 3 O + (м / з 19), C 2 H 5 + (м / з 29 ), Н 5 O 2 + (м / з 37), С 3 Н 7 + (м / з 43), H 7 O 3 + (м / з 55), H 9 O 4 + (м / з 71), H 11 O 5 + (м / з 99) и Н 13 O 6 + (м / з 109) для положительного режиме. Используйте следующие пики CH - (м / з 13), O - (м / з 16), ОН - (м / з 17), С 2 Н - (м / з 25), С 3 Н - (м / з 37), и C 4 H - (м / з 49) для отрицательного режиме.
    1. Выберите пик,убедитесь, что стрелка вниз направлен на пике в левом нижнем углу окна. Нажмите, что пик и введите имя пик в окне "масса калибровки», нажмите кнопку "Добавить", и ион интерес входит в калибровке массового.
    2. Наконец, нажмите кнопку "Перекалибруйте". Проверьте если площади пиков в нужных местах в соответствии с их массы к заряду отношения. В меню "Спектрум", выбрать и нажмите кнопку "Применить калибровочной массы" на "Все спектры" или "Выбранные спектры", в зависимости от конкретного анализа проводится.
  6. Как пик выбор необходим для анализа проб, определения характеристических пика образца в соответствии с литературой или другими предыдущими результатами. Сравните интенсивность пиков, представляющих интерес в спектрах M / Z. При необходимости, добавлять новые пики или удалить ненужные пики в списке пика.
    1. Добавить пики. Нажмите на пике, найти красные линии в левом нижнем углу окна. Хольd клавишу "Ctrl", выделите мышью по горизонтали, чтобы определить пиковую ширину, которая добавляет пик к списку пика автоматически. Еще один способ добавить пик является выбор своего пика в главном окне спектра, а затем нажать на кнопку "добавить пик" над окном. Если есть много пиков добавить в меню "Спектрум", выберите "Поиск пиков", проверьте соответствующие спецификации в открывшемся окне, затем добавьте пики по мере необходимости.
    2. Чтобы экспортировать пиковую список, в меню "Пик список", выберите "Сохранить ..." список пик в формате "itmil". Используйте Ctrl и левую кнопку, чтобы перетащить по спектру. В окне спектров, выберите пик интереса и перетащить два пунктирные линии к желаемым позициям.
    3. Чтобы импортировать пиковую список, в меню "Mass Список интервал", выберите "Импорт ...", найти существующий пик-лист файл с расширением файла ".ITPL". Нажмите кнопку "Открыть".
    4. Для использования "itmil« пиковую список, вменю "Массовый Список Интервал", нажмите кнопку "Открыть ...", найдите файл, затем нажмите кнопку "Открыть".
  7. Применить список пик для дальнейшего анализа данных. В левой нижней части окна "Spectra", появляется окно называется "Масс Интервал Список". Импортируется список пик показано здесь.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши файл списка пиков, которые будут использоваться, применить его к "активному спектру" или "всех спектров".
  8. Просмотр анкет данных. В окне "Профиль", использования буква «М», чтобы соответствовать к окну (полный диапазон) и буквой "N", чтобы соответствовать оси ординат. Используйте Ctrl и колесо прокрутки для регулировки ширины профиля. Или использовать "/" и "*" на клавиатуре, чтобы изменить диапазон по оси Y. и высоту.
  9. Экспорт данных для дальнейшего построения с помощью других графических программ после первоначального анализа.
    1. Чтобы экспортировать профиль глубины, в окне "Профиль", выберите в меню "Файл", затем выберите "Экспорт & #34 ;, а затем выберите "Сохранить как" файл ".txt".
    2. Чтобы экспортировать файл M / Z спектра, в окне "Spectra", выберите в меню "Файл", затем выберите "Экспорт", а затем выберите "Сохранить как" файл ".txt".
    3. Чтобы экспортировать файл изображения, в "Изображение" окна, экран печати и сохранить как файл изображения.

6. ToF-SIMS данных Построение и представление

Примечание: Используйте графический инструмент для построения данных после данных SIMS обрабатываются с использованием инструментальной программы.

  1. Используйте графический инструмент для импорта данных.
  2. Сделать участок с помощью M / Z в качестве оси абсцисс и пиковой интенсивности как оси ординат, чтобы показать восстановленную спектр. Приводится пример на рисунке 1.
  3. Сделать участок через время распылением как ось х и пиковой интенсивности как оси ординат, чтобы показать восстановленную глубина профиля временные ряды. Пример приведен в FIGURE 2.
  4. Зерноуборочный реконструированные изображения 2D различной т / г и образуют матрицу, чтобы показать отображением ионов. Приводится пример на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Пару представительных результатов представлены для демонстрации преимущества предлагаемого протокола. При использовании микрожидкостных интерфейс SALVI, первичный ионный пучок (Bi 3+) может непосредственно бомбардируют на гидратной фибронектина фильма в ДИ воды. Таким образом, молекулярная химическая отображение поверхности жидкости может быть успешно достигнута.

Рисунок 1a и 1b показывают положительную масс-спектры ToF-SIMS гидратированного фибронектин пленки и DI воды, соответственно. Пики интереса включая кластеров воды (т.е., м / з 19, 37, 55, 73, 91 и 109) фрагменты и аминокислотные (т.е. м / з 30, 44, 61, 74, 81, 83, и 98) обозначены красными стрелками. В дополнение к характеристическими пиками фрагментов аминокислотных, которые были широко сообщалось использованием сухих образцов белка, пики кластеров воды наблюдаются вмасс-спектры гидратированной фибронектина фильма в ДИ воды. Кроме того, интенсивность этих кластеров воды пиков очень сильно отличаются от тех, в масс-спектрах дистиллированной водой. Этот результат обеспечивает прямое доказательство собственности молекул воды, окружающих и внутри гидратированных белковых молекул, которые играют определенную роль в их адсорбции на поверхности.

На рисунке 2а показаны временные ряды глубина профиля гидратированного фибронектина пленки и дистиллированной водой. Как образец находится под мембраной SiN, интенсивностей выбранных вторых ионов незначительны, прежде мембрана SiN пробито через (т.е. 280 сек для фибронектина и 340 сек для ДИ воды). После того, как мембрана SiN пробито через, интенсивности этих вторичных ионов значительно возрастет. При использовании длинный ширину импульса, масса разрешение является относительно низким. Таким образом, быстрый процесс длительность импульса используется для получения данных с лучшей массовой разрешениемдля изображения и спектра реконструкций как было подчеркнуто на рисунке 2а. После определенного периода времени (т.е. 60 сек для фибронектина и 220 сек для ДИ воды), приведенная ширина импульса используется для получения M / Z спектры с лучшей разрешением масс. Окончательные M / Z-спектры были восстановлены из 200 измерений сек выделены зеленым цветом затененных участков в глубину профильной временного ряда. показаны изображения 2D из гидратированного фибронектина пленки и DI воды, которые соответствуют зеленой заштрихованной площади на рисунке 2а. Эти 2D изображения представляют подсчет некоторых вторичных ионов из образца: тем ярче изображение, тем выше вторичный подсчет ион. Такие интуитивные образы дают ясное сравнение выбранных вторичных ионов между различными образцами, которая может помочь в анализе данных. По нашему опыту, разница в SiN сквозной функции времени варьируется от партии к партии мембран SiN. Тем не менее, это не влияет на ретаты динамического анализа ToF-SIMS.

Рисунок 1
Рисунок 1: Сравнения ToF-SIMS положительного спектров гидратированной фибронектина пленки и DI воды в микроканале SALVI (а) Реконструированный м / з спектр фибронектина.. (Б) Спектр DI воды.

фигура 2
Рисунок 2:. Глубина профилей и 2D изображения гидратированного фибронектина и DI воды (а) профилирование по глубине временной ряд фибронектина и DI воды в положительном режиме. (Б) 2D изображения реконструированы соответствующий зеленого затененных 200 временных сегментов сек вдоль временного ряда глубина профиля в (а). Несколько характеристика массы к заряду отношения, имеющие отношение к кластеров воды(Например, м / г 1, 19, 37, 55) приведены в дополнение к известным фрагментов аминокислот (например, м / г 30, 83, 98). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SALVI является Микрожидкостных интерфейс, который позволяет динамически поверхность жидкости и анализ раздела жидкость-твердое вещество на основе вакуумных приборов, таких как ToF-SIMS и сканирующей электронной микроскопии (SEM). Благодаря использованию малых отверстий подвергать жидкость непосредственно в вакууме, SALVI подходит для многих хорошо сфокусированные спектроскопии и визуализации методов без каких-либо модификаций; 22 портативность и универсальность микрофлюидики сделать его истинным мультимодальные платформы визуализации. Отличительные черты и значение SALVI по сравнению с другими существующими методами обобщены в ряде недавних обзоров. 22-25 Как разработчик технологии SALVI, наша группа активно применяя его к различным исследований с участием динамических жидких поверхностей и жидкость-твердое тело интерфейсы , Некоторые примеры новых приложений включают млекопитающих клеточные мембраны, бактерии биопленки вложение, 15,16 или образование наночастиц в результате водных поверхностных окисления. В этом раза приведем первоначальные результаты жидкость ToF-SIMS гидратированного белка тонкой пленки, адсорбированной на поверхности SiN.

Это довольно критично бережно обращаться выделенные шаги в протоколе. Например, при рисовании жидкость в шприц в шагах 1 и 2, чтобы убедиться, что нет никаких пузырьков внутри шприца. Потому что как только пузырьки вводятся в SALVI, они могут вызвать утечку в вакууме. 9 Таким образом, при соблюдении пузырьки, это разумно, чтобы избавиться от них, установив шприц вертикально и осторожно нажав пузыри из. Кроме того, очень важно, чтобы сделать окно грех в SALVI плоским для оптимизации анализа ToF-SIMS, как описано в шаге 3. Это Ровность зоне обнаружения непосредственно влияет на качество данных в соответствии с дизайном TOF-SIMS. 26 Это необходимо визуально проверить устройство после обеспечения всем на сцену SIMS. Если окно грех не горизонтально, настроить винты и изменить высотуустройства SALVI чтобы гарантировать, что все в одной плоскости, насколько это возможно. Эти тонкие моменты требуют опыта и тщательности, которые определяют успех и надежность всего эксперимента.

Как показано на фиг.1b, пики с M / Z 19, 37, 55, 73, 91 и 109 имеют высокие отсчеты. Это указывает на то, что есть большое количество водных кластеров (H 3 O +, H 5 O 2 +, H 7 O 3 +, H 9 O 4 +, H 11 O 5 + и Н 13 О 6 +) в положительном вторичные ионы. Другие кластеры воды (данные не показаны) с более высокими значениями / г м также имеют относительно сильные пики по сравнению с их соседними пиками. Эти большие количества кластеров воды выбрасываются с поверхности DI воды после SiN сквозной функции. кассетные Вода сигналы в режиме положительных не были наблюдаемы и в предыдущем шорк; и это было связано с низким числом вторичных ионов и неоптимизированные ToF-SIMS условий в прошлом. 8 С непрерывным усилием в оптимизации условий приобретения SALVI и ToF-SIMS, таких как первичного ионного пучка (т.е. Bi + против . Би 3 +), длительность импульса и текущих условий в течение глубины профиля, то теперь можно наблюдать до 44 кластеров воды в положительном режиме, используя условия, представленные в этой статье. Результаты, показанные здесь являются перспективными для дальнейшего изучения роли воды в динамике различных биологических молекул и биологических системах.

Здесь в качестве примера, чтобы проиллюстрировать преимущества SALVI и TOF-SIMS в изучении биологических молекулярной динамики, был представлен гидратация фибронектина белка. Пики M / Z 30, 44, 61, 74, 81, 83, и 98 принадлежат к фрагментам аминокислотных согласно предыдущему отчету, 27,28 которые гораздо сильнее, чем у DI очистэ показано на рисунке 1b. Эта разница в повышенной интенсивности фрагментов аминокислот в образце фибронектина предполагает, что эти вторичные ионы действительно от самих белков. Кроме того, пики кластеров воды в рисунке 1a гораздо сильнее, чем у дистиллированной водой на рисунке 1b, которая подразумевает, что свойства молекул воды на поверхности адсорбции белка и межфазного раствора может быть очень отличаются от тех, в чистой воде.

На рисунке 2а показывает представительный глубина профилирования временную серию из двух различных образцов: фибронектин и ДИ воды в микроканале SALVI. Были собраны данные профилирования глубины, как окно SiN была бомбардировке в Би 3 + первичного пучка ионов с длинной шириной импульса. Как видно на рисунке 2а, окно SiN пробито через примерно 300 сек. Перед окно SiN в SALVI пробито через вч, интенсивности отдельных вторичных ионов довольно низка. Как только окно SiN пробито через, интенсивности вторичных ионов немедленно увеличить как поверхность жидкости начинает бомбардировке первичного пучка ионов. Например, интенсивность Н + и Н 3 О + показать большое увеличение, указывающее наблюдение водной поверхности. 8,9 Хотя интенсивности неустойчивы сразу после сквозной функцией или на границе раздела, они могут достигать относительно стабильным значения после определенного периода времени (например, 60 сек для фибронектина и 220 сек для ДИ воды, соответственно, на фиг.2а). Разница в долгосрочной широтно-импульсной бурения на самом деле не влияют на результаты анализа, проиллюстрированные здесь при реконструкции M / Z спектры (например, рисунок 1), так как эффективные M / Z спектры приобрела после SiN сквозной функции. Тем не менее, исследователь может выбрать использовать те же условия для всех образцов FOг консистенции и легкости в выборе сегментов данных при анализе данных. Для того чтобы получить лучшую массовое разрешение, ширина импульса была затем восстанавливают и интенсивности были соответственно уменьшилось в последней части эксперимента глубина профилирования. Временные ряды глубина профиля непрерывно собирали для еще 200 сек, чтобы обеспечить достаточное данные для M / Z спектрального анализа. Сегменты времени были реконструированы, что M / Z спектры выделены зеленым затененных областях.

Фибронектина широко используется для поверхностной адсорбции до культивирования клеток; многие исследования показали, фибронектин несет ответственность за клеточной адгезии и клеточной биоматериал взаимодействий. 19,20,29 Недавнее исследование характеризуется толщину фибронектина адсорбированного на поли (гидроксиэтил метакрилат) кисти с помощью эллипсометрии. Фибронектин тонкопленочный было определено в размере 3-12 нм. 30 Такое толщина разумно для анализа глубина профилирования в водной Солуции. 8,9 С развитием SALVI, непосредственный анализ гидратированного белка, адсорбированного на твердой поверхности теперь это возможно. Этот подход потенциально может иметь широкое применение в изучении взаимодействия белков с твердыми поверхностями динамично.

показаны выбранные 2D изображений различных вторичных ионов из фибронектина и DI воды образцов, соответственно. 2D изображения получаются из глубины профилирования временных данных в зеленых затененных областей на рисунке 2а, которые соответствуют поверхности жидкости после SiN сквозной, как описано ранее. Образы выделенного фрагмента аминокислотный вторичных ионов CH 4 N +, C 5 H 7 O + и C 4 H 4 NO 2 + (т.е. м / з 30, 83 и 98) для фибронектина тонкой пленки были намного светлее, чем те, для дистиллированной воды. Это указывает на то, что вторичные ионы аминокислотного фрагмента наблюдаются еПЗУ молекулы фибронектина внутренний диаметр апертуры 2 мкм. Кроме того, образы выбранных пиков (например, м / з 1, 19, 37, и 55), соответствующую нескольким водных кластеров фибронектина удивительно ярче тех ДИ воды. Этот результат демонстрирует, что гидратация фибронектина делает молекулы воды, окружающие биомолекулы, отличную от молекул воды в деионизированной воде.

Таким образом, эта работа обеспечила яркое свидетельство о белок гидратации индуцированной водных изменений молекула собственности. Такие результаты могут обеспечить улучшенное фундаментальное понимание о структуре, конформации и биологической активности белков, адсорбированных на поверхности твердого тела в жидкой микросреды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK Union Valco ZU1TPK for connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Syringe BD 309659 1 ml
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 ml
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µl
Centrifuge Tube Corning 430791 15 ml
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 1 mg/ml
Ethanol Thermo Fisher Scientific S25310A 95% Denatured
Gibco PBS Thermo Fisher Scientific 10010-023 pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M. Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, (11), 861-866 (2006).
  4. Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (47), 18461-18466 (2007).
  5. Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18, (10), 4090-4097 (2002).
  6. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, (1), 110-115 (2004).
  7. Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19, (5), 1708-1715 (2003).
  8. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29, (6), 061101 (2011).
  10. Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
  11. Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. 8,555,710 B2 (2013).
  12. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. 20,140,038,224 A1 (2014).
  13. Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5, (10), 2515-2522 (2013).
  14. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46, (4), 224-228 (2014).
  15. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  16. Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9, (3), 031101 (2015).
  17. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, (5), 855-859 (2014).
  18. Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115, (20), 3861-3863 (2002).
  19. Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26, (2), 259-267 (1981).
  20. Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20, (1), 1-5 (1977).
  21. Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, (4), 514-523 (2006).
  22. Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15, (6), 725-744 (2013).
  23. Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5, (6), 3035-3060 (2015).
  24. Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838, (12), 3171-3190 (2014).
  25. Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841, (8), 1108-1119 (2014).
  26. Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31, (5), 050819 (2013).
  27. Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115, (49), 24247-24255 (2011).
  28. Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38, (4), 191-193 (2006).
  29. Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19, (4), 1839-1850 (2008).
  30. Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. 17-25 (2014).
<em>Непосредственное определение характеристик</em> гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).More

Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (108), e53708, doi:10.3791/53708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter