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Neuroscience

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53709
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

Catódica transcraniana estimulação de corrente contínua (ETCC) induz efeitos supressores sobre as apreensões resistentes aos medicamentos. Para executar ações efetivas, os parâmetros de estimulação (por exemplo, orientação, força de campo, e duração de estimulação) precisam ser examinadas em preparações fatia ratos cerebrais. Testes e providenciar a orientação do eléctrodo em relação à posição da fatia de cérebro ratinhos são viáveis. O presente método preserva a via thalamocingulate para avaliar o efeito de DCS sobre as actividades do tipo convulsivas córtex cingulado anterior. Os resultados das gravações de matriz multicanal indicou que catódica DCS diminuiu significativamente a amplitude das respostas evocadas por estimulação e a duração de 4-aminopiridina e perda de consciência induzida por bicuculina. Este estudo também descobriu que as aplicações DCS catódica em 15 min causou depressão a longo prazo na via thalamocingulate. O presente estudo investiga os efeitos da DCS em thalamocingulate plasticidade sináptica e atividades agudas apreensão-like. O processo actual pode testar os parâmetros de estimulação óptima incluindo a orientação, intensidade de campo, e a duração de uma estimulação in vitro no modelo de ratinho. Além disso, o método pode avaliar os efeitos da DCS sobre as atividades do tipo convulsivas corticais em ambos os níveis celulares e de rede.

Protocol

Procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pelo Cuidado Institucional Animal e Comité de Utilização, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

1. Preparar Solução Experimental e Equipamentos para multieletrodo gravação matriz

  1. Prepare artificial fluido cerebrospinal (aCSF; NaCI 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM de NaH 2 PO 3, MgSO 2 mM de 4, 2 mM de CaCl2, mM de NaHCO 25, 3, e 10 mM de glucose, borbulhado com 95% de O 2 e 5% de CO 2).
  2. Usar dois tipos de sondas MEA: 6 x 10 planar MEA e 8 x 8 MEA. O ex capas de sonda da região que compreende o córtex, corpo estriado, e tálamo. A última sonda abrange apenas a região cortical.
  3. Usar um amplificador de 60 canais com um filtro passa-faixa situada entre 0,1 Hz e 3 kHz a 1.200 amplificação. Aquisição de dados em uma taxa de amostragem de 10 kHz.
  4. Coloque dois fios de prata AgCl-revestidos no interior da câmara de MEA para DCS. Use o AgClfios de prata -Revestido para produzir campos elétricos que são gerados por um estimulador isolado.
  5. Coloque um eletrodo de tungstênio (diâmetro, 127 mm, comprimento, 7,62 cm; 8 ° AC ponta cônica, resistência, 5 mohms) para a estimulação do tálamo, e colocar o eletrodo de referência na câmara de MEA. Entregar correntes do eléctrodo de tungsténio usando um estimulador isolado que é controlado por um gerador de impulsos.

2. Cérebro Slice Preparação

  1. Utilizar ratos machos C57BL / 6J, 4-8 semanas de idade. Casa os animais em uma sala com ar condicionado (21-23 ° C, 50% de umidade; 12 horas de luz / 12 h / ciclo escuro, luzes acesas às 08:00) com livre acesso a comida e água.
  2. Tomar uma aliquota de 250 ml da aCSF que foi preparado no passo 1.1, e coloque-o num copo que contém gelo. Ao mesmo tempo, o fornecimento de gás contínua, que é composto por 95% de O2 e 5% de CO 2.
  3. Cirurgia
    1. Anestesiar os animais com 4% de isoflurano em um copoBox para cerca de 3 min. Uma vez que o animal atinge uma profundidade cirúrgico de anestesia (indicado pela falta de uma resposta a pitada tep), coloque-o em uma bandeja rasa que é preenchido com gelo picado e remover a cabeça com uma tesoura.
    2. Expor o crânio, e retire o músculo remanescente. Em seguida, utilizando fórceps, descascar a superfície dorsal do crânio a partir do cérebro. Aparar os lados do crânio utilizando fórceps. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com uma solução de etanol a 75%.
    3. Com uma espátula, cortar os bulbos olfativos e ligações nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro, e remover o cérebro. Após a decapitação, o cérebro rapidamente transferir para um recipiente cheio com aCSF oxigenado gelado.
  4. Preparação da Medial Tálamo (MT) -ACC Cérebro Slice
    Nota: Prepare fatias que contêm o caminho do MT para ACC 13.
    1. Mão-cortar o bloco cérebro com dois cortes sagital 2,0 mm lateral à linha mediana em cada hemisfériopara exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça dois cortes em ângulo. Adicione o primeiro corte transversal paralelo ao tracto fibra visível no corpo estriado.
    2. Adicione o segundo corte transversal a partir da ligação entre o cerebelo e córtex visual para o ponto médio entre a comissura anterior e trato óptico que são ventral e paralela à via thalamocingulate.
    3. Fixe o bloco cérebro para uma placa angular (~ 120 °) com adesivo de cianoacrilato, e fazer um corte um pouco acima do ponto de viragem da via. Desdobrar a placa, alise-o e cole-o palco das câmaras de um vibratome.
    4. Faça fatias de cérebro tálamo-ACC medial (500 mm de espessura) e, em seguida, mergulhe-os em gelada oxigenados fatias aCSF.Transfer para a câmara de gravação, e mantenha a 32 ° C sob perfusão contínua (12 ml / min) com aCSF oxigenado para 1 h.

3. Preparação de Perfusão Câmara para multieletrodo gravação matriz

  1. Preparaçãode Perfusão Câmara
    1. Coloque uma sonda MEA em um sistema multi-canal e usar dois tubos de polietileno separados para conectar a sonda a uma bomba peristáltica. Utilizar um tubo para guiar o aCSF para a câmara de MEA e o outro tubo para guiar o aCSF para fora da câmara. Finalmente, continuamente perfundir a preparação com água morna (29-30 ° C) aCSF oxigenado (8 mL / min).
  2. Transferir fatia do cérebro para MEA. Mantenha pressionada a fatia do cérebro sobre o MEA com um cotonete molhado. mover cuidadosamente a fatia do cérebro para garantir a ACC é orientada acima dos eletrodos.
  3. Use kits de âncora fatia e mantêm-downs para pressionar a fatia do cérebro. Esta etapa garante uma boa conexão elétrica entre a fatia e eletrodos.

4. Geração de campos elétricos pela DCS

Nota: A definição da orientação do campo eléctrico baseou-se na direcção do eixo axodendritic no ACC. As orientações de dendríticos e Soma compartimentos foramconfirmada usando Golgi coloração 12.

  1. Coloque a AgCl (definida como o ânodo) proximal ao ACC, e colocar o outro eléctrodo (definidos como o cátodo) distai em relação à ACC. Grave a intensidade do campo que é gerada pelas duas orientações de campo (paralelas e perpendiculares às fibras axodendritic ACC) de MEA, e entregar as correntes dos campos eléctricos, utilizando um estimulador.
  2. Fixar a distância dos eléctrodos de AgCl (cerca de 1,5-2 cm), e ajustar a intensidade de corrente do estimulador para fazer o DCS entre 0,5 e 2 mA.

5. induzidas eletricamente respostas corticais Synaptic

Nota: induzir respostas sinápticas no ACC por estimulação eléctrica no MT, em que um gerador de estímulo eléctrico programável produz impulsos de corrente bifásica rectangulares.

  1. Repita Seção 3 acima.
  2. Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar pulsos do estimulador à Thalregião Amic das fatias através de eléctrodos de tungsténio bipolares.
  3. Use várias intensidades de corrente para determinar o limiar que provoca uma resposta ACC. Aqui, utilizar uma intensidade de ± 150 mA e a duração de 200 ms, o que induziu uma resposta máxima de 80% na maioria dos ACC em fatias.
  4. Mova o eletrodo de tungstênio ao longo da via thalamocingulate (de MT para corpo caloso) na fatia MT-ACC para obter os perfis de resposta ideais.
  5. Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, e usar o software para automaticamente a média de todos os ACC evocado por estimulação MT. O resultado iss as respostas sinápticas em ACC induzidas a partir de estimulação MT pela MT-ACC via.

6. perda de consciência induzida eletricamente

Nota: perda de consciência foi induzida pela aplicação de 4-aminopiridina (4-AP; 250 uM) e bicuculina (5 uM). estudos de controle de tempo anteriores mostraram que as respostas máximas e estáveis ​​apareceu2-3 horas após a aplicação do fármaco 14.

  1. Repita Seção 5 acima.
  2. Adicionar drogas para a solução de perfusão. Use 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM). Misturar as drogas uniformemente, e continuar a perfusão de 2-3 horas.
  3. Para facilitar a perda de consciência, a manutenção da bomba de perfusão a uma taxa relativamente rápida de perfusão (8 ml / min), que também pode ajudar a prevenir a acumulação de um gradiente de pH.
  4. Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar a estimulação elétrica (150 mA, 200 ms de duração) para obter perfis de resposta ACC.
  5. Faça 10-20 varreduras e calcular a média das respostas.
  6. Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas. Repita o passo 6.5.

7. Teste de Efeito da DCS em respostas corticais evocados

  1. Repita as secções 3 e 4. Certifique-se que os campos eléctricos uniformes são geradas pela passagem de correntes entre dois fios de prata AgCl revestidas paralelas que são colocados dentro do Mcâmara de EA. Se não houver problemas, a DCS fica entre 0,5 e 2 mA.
  2. Desligue o DCS, e colocar um eletrodo de tungstênio para estimular o tálamo (± 150 mA, 200 ms de duração). Para obter respostas sinápticas máximas na ACC, fazer 10-20 varreduras e calcular a média das respostas.
  3. Simultaneamente ligar o DCS (2 mV / mm força DCS) e estimulação do tálamo (350 mA, 200 ms de duração). Avaliar as alterações da amplitude da resposta evocada ACC-estimulação talâmica durante DCS.
  4. Desligue o DCS, e adicionar 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM) para a solução de perfusão. Então espere 2-3 hr. Quando as drogas afetam a fatia do cérebro, a fatia produz respostas apreensão corticais.
  5. Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, em seguida, medir a amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados elétricos.
  6. Após o passo 7.5, ligue simultaneamente no DCS (2 mV / mm DCS força) e estimulação do tálamo (150 mA, 200 duratiem ms). Avaliar as alterações na amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados durante a aplicação DCS.
  7. Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas, e repita os passos 7.2 e 7.3.
  8. Recolher todos os dados de gravação, e agrupar os dados em diferentes condições experimentais. Avaliar a amplitude e a duração das respostas convulsivos corticais sob diferentes condições experimentais.

Análise 8. Dados

  1. Use software (por exemplo, software cremalheira MC) para calcular a média automaticamente as respostas gravadas, e exportar os dados brutos para uma planilha. Analisar a amplitude e a duração dos dados em bruto e gerar dados de cor.
  2. Para detectar eventos apreensão oscilatórios, usar o software para medir o valor da linha de base e desvios padrão (SD). Set 3 SD do nível de ruído como o limiar. Amplitudes dos picos durante um evento de oscilação que ultrapassam esse limite são automaticamente detectarEd.
  3. Realizar a análise estatística utilizando teste t de Student.
  4. Medições Express e one-way análise de variância (ANOVA) resulta no texto como média ± SE, com n indicando o número de fatias estudou 12.

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Representative Results

Preparação do Setup Thalamocingulate Fatia e MEA Sistema de Gravação

A fatia MT-ACC de ratinhos é uma preparação fatia especial que permite a exploração das propriedades electrofisiológicas da via thalamocingulate. A Figura 1A mostra a maneira na qual a fatia MT-ACC foi preparado. O cérebro de rato foi rapidamente removido e mantido em aCSF oxigenado fresco (Figura 1A, a, b). Para revelar a anatomia subcortical, o cérebro foi cortado 2,0 milímetros lateral, a partir da linha média de cada hemisfério para adquirir blocos sagital do cérebro (Figura 1A, c, d). Dois cortes angulares ventrais foram feitas nos blocos de cérebro para reter a via thalamocingulate. O primeiro corte transversal foi feito na parte frontal do cérebro de bloco, paralela ao tracto fibra visível no corpo estriado. O segundo corte transversal foi feito na parte de trás do bloco de cérebro de ligação a apostaween o cerebelo eo córtex visual para o ponto médio entre a comissura anterior e trato óptico. Após os cortes foram feitos, o bloco de cérebro foi colada sobre uma placa de plástico angular (120 ° do ângulo), e um corte foi feito no lado dorsal directamente através do córtex (Figura 1A, por exemplo). A placa do bloco cérebro estava colado a um vibratome e submerso em aCSF fresco oxigenado. Finalmente, algumas fatias (500 mm de espessura) foram tomadas a partir do bloco de cérebro e incubadas em aCSF oxigenado (Figura 1A, H, I).

A Figura 1B mostra a configuração do sistema de gravação de MEA. O diagrama esquemático que mostra os sistemas de perfusão e MEA ligados a um computador de gravação. Uma sonda de MEA vazio foi colocado no interior do amplificador, e começou a perfusão a um caudal de 8 ml / min. A fatia de cérebro-MT ACC foi colocada na sonda MEA assegurando ao mesmo tempo que a zona de gravação foi tão próximo quanto possível do centro. Um estimulador foi o usod para estimular a fatia de cérebro e gerar o campo eléctrico. Depois de todos os passos foram concluídas, o sistema gravadas as propriedades electrofisiológicas da via thalamocingulate.

A Figura 1C mostra o diagrama de área de gravação e o modo pelo qual a fatia de cérebro-MT ACC foi colocada na sonda MEA. Figura 1C-A mostra a aparência da sonda MEA. A linha preta (seta vermelha) na sonda ajudou o usuário determinar a direção correta da sonda no interior do amplificador. Figura 1C-b mostra o principal circuito da sonda MEA. Figura 1C-c mostra a matriz elétrica que foi sobreposto ao tecido cortical.

Respostas de teste Evocado

Para confirmar a preservação da via thalamocingulate na preparação fatia, este estudo estimularam otálamo e gravado no ACC nos experimentos eletrofisiológicos. Somente fatias com potencial pós-sináptico no ACC enquanto fornece uma pequena quantidade de corrente na MT foram utilizadas na experiência. A Figura 2A apresenta as posições dos eléctrodos de estimulação e de registo e de respostas evocadas por estimulação talâmicos típicos no ACC. Para induzir a perda de consciência, 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM) foram usadas para induzir a actividade epileptiforme. Típico 4-AP com a actividade convulsiva-espontânea como induzida por bicuculina foi composto por um início ictal, seguida por uma fase tónica e longa duração. Os vestígios foram selecionados para a ampliação na Figura 2B. Este estudo também tentativa para entregar a estimulação no MT após a indução de convulsões induzidas por drogas. 4-aminopiridina / actividade epileptiforme evocadas por bicuculina foi induzido após estimulação eléctrica (Figura 2C).

ensaioOrientação de DCS e fatia

Estudos clínicos anteriores mostraram que a orientação do campo eléctrico de catódica DCS afecta a actividade evocada por estimulação do tálamo. A Figura 3A mostra as diferentes orientações do campo eléctrico, o qual foi disposto em paralelo ou perpendicular à orientação de dendrite e Soma compartimentos no ACC. Quando o campo eléctrico disposto paralelamente às células neuronais, a estimulação catódica suprimidas respostas evocadas por estimulação talâmicos na parte medial da ACC (Figura 3B, painel superior). Quando o campo eléctrico foi dispostos perpendicularmente às células neuronais, não foram observados efeitos significativos nas respostas evocadas pela estimulação do tálamo (Figura 3B, painel inferior). Cathodal paralelo DCS também suprimiu 4-AP e perda de consciência induzido por bicuculina na parte medial do ACC (Figura 3C, painel superior).Ele encurtou a duração da perda de consciência, e nenhum efeito significativo de cathodal perpendicular DCS foi observado (Figura 3C, painel inferior). Estes resultados confirmaram que a orientação do campo eléctrico era importante na regulação da transmissão sináptica na via thalamocingulate.

Efeito da DCS na atividade de apreensão

A aplicação clínica da estimulação magnética transcraniana, ETCC, e DCS oferece uma abordagem não invasiva para o tratamento de convulsões resistentes aos medicamentos. Estudos anteriores mostraram que a estimulação de campo modulado plasticidade sináptica e a actividade epileptiforme influenciado em várias regiões do cérebro. Os resultados deste estudo mostraram que ETCC catódica deprimido thalamocingulate transmissão sináptica. A amplitude das respostas evocadas por estimulação e duração da perda de consciência estavam deprimidos (9 de 11 fatias, 81,82%; Figure 4A, painel da esquerda). A figura 4A (painel direito) mostra que 15 minutos de catódica DCS eficazmente induzida depressão a longo prazo (LTD) na via de MT-ACC e deprimido respostas evocadas (N = 11, p <0,05). Figura 4B (painel esquerdo) mostra que a estimulação do tálamo evocado perda de consciência robusto no córtex cingulado. Trinta minutos após 15 min cathodal aplicação DCS, a duração da perda de consciência evocadas por estimulação do tálamo foi encurtado. Os resultados também mostraram que a duração da crise foi significativamente reduzida após DCS catódica 15 min em comparação com nenhuma aplicação DCS (n = 9, p <0,05; Figura 4B, painel da direita).

figura 1
Figura 1:. Preparação do Setup Thalamocingulate Fatia e MEA Sistema de Gravação (A) pro fatia MT-ACCprocedimento (a) Remover o cérebro e (b) a transferência para esfriar aCSF oxigenado. (C) Faça dois cortes parassagitais da linha média. View (d) Lado da parte medial do bloco cérebro. (E) Faça dois cortes ventral angulares do bloco cérebro. (F) Cole o bloco cérebro sobre uma placa de plástico em ângulo. (G) Faça um corte dorsal e desdobrar o bloco cérebro. (H) Cole o bloco cerebral em um vibratome. (I) Recolha fatias do bloco cérebro. Configuração do sistema (B) de gravação MEA. (C) MEA área de gravação. (A) sonda MEA. (B) Circuito de MEA. (C) A ACC da fatia do cérebro foi orientada acima das sondas de eléctrodos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

e = "1"> Figura 2
Figura 2: Diferentes respostas evocadas para Thalamic estimulação e estimulação induzida por drogas respostas evocadas por estimulação talâmicos (A) no ACC.. (B) 4-Aminopyridine- e perda de consciência induzido por bicuculina. (C) stimulation- Thalamic e perda de consciência induzido por drogas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Efeito de diferentes orientações de DCS (A) diferentes orientações do campo elétrico. (B) as respostas evocadas por estimulação talâmicos com DCS. (C) Efeito da cathodal DCS na perda de consciência.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53709/53709fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Efeito da catódica ETCC na apreensão de atividade (A) Quinze minutos cathodal LTD induzida DCS e deprimido atividade evocada.. (B) A ocorrência de perda de consciência diminuído durante a estimulação catódica. A supressão da perda de consciência por DCS catódica 15 min suportou mesmo quando a aplicação da DCS foi encerrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

No presente estudo, foram testados os efeitos da duração e orientação da DCS na perda de consciência ACC. Para obter dados estáveis ​​em fatias de cérebro de rato, como para manter a integridade da via-MT ACC e para evitar danos que é fundamental, em especial os passos no qual dois cortes angulares ventral e dorsal de um corte do córtex são feitas. Além disso, o tempo necessário para preparar a fatia de cérebro também pode afectar a actividade da fatia do cérebro, o que deve ser o menor tempo possível, para manter o cérebro fresco e forte. Um estudo anterior mostrou que os danos eletroquímico para o tecido alvo pode ocorrer em uma preparação in vivo 15. Uma preparação fatia cerebral in vitro pode ser utilizado para evitar este problema. Em uma preparação in vitro, o tecido não contactar directamente o eléctrodo, minimizando assim efeitos electroquímicos 16. Os efeitos do DCS foram comparados com eléctrodos que foram orientadas em diferentes direcções. Quando o eléctrodo deES foram orientadas a 90 ° e 270 °, DCS não afectou a actividade evocada (Figura 3). Assim, este experimento controlado excluiu a possibilidade de quaisquer efeitos secundários de reações eletroquímicas para DCS que danificaram o tecido em nosso estudo. O método de recuperação de protecção das fatias de cérebro é outra chave; A fórmula aCSF neste estudo fornece uma alternativa ao método de corte protectora e é altamente eficaz para a preservação de neurónios em fatias de cérebro de animais 4 a 8 semanas de idade. O método não é projetado para uso com animais de todas as idades; o uso de Tris aCSF parece ser eficaz em ratos jovens, como é o uso do método de recuperação de protecção NMDG em ratos com idade de 6 semanas e mais velhos. Portanto, os usuários devem ter em mente as equivalências idade relativa entre espécies para escolher o melhor método para o experimento.

Usando um MEA para gravar fatias de cérebro é uma técnica comum, mas combinando um campo elétrico com uma gravação MEA sysTEM geralmente não é feito. Afetando um campo DC em solução condutora do sistema de gravação MEA é uma abordagem interessante, especialmente para períodos de muitos segundos a minutos. Um estudo anterior demonstrou que a aplicação DCS não alterou o pH na solução de aCSF, indicando que o pH da solução era condutora estável nesta configuração experimental 12. A taxa de perfusão relativamente rápida (de 8 mL / min) foi mantida para facilitar a perda de consciência, e quaisquer produtos de transformação química no sonda MEA foram lavadas para fora pela perfusão, evitando assim a formação de um gradiente de pH. tecnologia de gravação matriz multieletrodo é muitas vezes limitado pelo tipo de fatia de cérebro e gama do eléctrodo de registo. O tipo de fatia de cérebro determina que via circuito é gravado e o intervalo do eléctrodo de registo determina se núcleos cerebrais únicos ou múltiplos são gravadas. Estas condições devem ser confirmado antes da experiência.

Pré riores estudos mostraram que os efeitos a longo prazo de DCS ocorrer por meio da modulação da transmissão sináptica 17. No presente estudo, cathodal DCS causada LTD na via MT-ACC. O LTD ou depotentiation de potenciação relacionadas com crises foi proposta para fazer parte do mecanismo subjacente de supressão de convulsões, sugerindo que o aumento do resultado do tratamento ETCC pode ser possível. No entanto, nenhum estudo publicado tem incidido sobre a intensidade de campo no córtex cingulado. A localização profunda do córtex cingulado na parte medial do córtex é difícil de teste. Por exemplo, é inevitável que o fluxo de corrente pode afectar os tecidos e vasos que estão mais próximas da superfície. A dificuldade de atingir tecidos profundos por ETCC pode limitar a aplicação da ETCC para estudo in vivo. Portanto, para entender como DCS afeta as atividades neuronais, uma preparação fatia do cérebro deve ser usado, como efeitos vasculares não-específicos precisam ser excluídos.

jove_content "> Para o propósito de estabelecer um modelo experimental, a apreensão descrito é induzida em um cérebro saudável. As atividades do tipo convulsivas foram ainda induzida por um pulso elétrico. O momento da ocorrência de apreensão poderia ser controlado com precisão quando a DCS foi aplicado . os resultados podem fornecer mais informações para o tratamento ETCC. Outra descoberta notável foi o de longa duração mudanças na excitabilidade cortical regional que foram induzidos por ETCC. no futuro, se o mecanismo subjacente da ETCC pode ser elucidado, em seguida, a combinação de DCS e a terapia farmacológica para melhorar LTD no tratamento da epilepsia pode ser um desenvolvimento muito interessante.

Em conclusão, foi fornecida uma metodologia para investigar os efeitos da DCS em thalamocingulate e plasticidade sináptica transcalosa e convulsões agudas. Os efeitos a longo prazo da DCS na perda de consciência em nossa preparação fatia do cérebro ocorreu através de um mecanismo LTD-like.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Name Company Catalog Number Comments
aCSF (total:1 L):
D(+)-Glucose MERCK 1.08337.1000 10 mM
Sodium hydrogen carbonate MERCK 1.06329.0500 25 mM
Sodium chloride MERCK 1.06404.1000 124 mM
(+)-Sodium L-ascorbate, >=98% SIGMA A4034-100G 0.15 g/2 c.c
Magnesium sulfate, anhydrous, ReagentPlus SIGMA M7506-500G 2 mM
Calcium chloride dihydrate MERCK 1.02382.1000 2 mM
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate MERCK 1.06346.1000 1 mM
Potassium chloride May & Baker LTD Dagenham England MS 7616 4.4 mM
Name Company Catalog Number Comments
Drugs:
(+)-Bicuculline TOCRIS 0130 5 µM in aCSF
4-Aminopyridine TOCRIS 0940 250 µM in aCSF
Name Company Catalog Number Comments
Brain slice Preparation:
Vibratome Vibratome Series 1000 Block slicing into 500 µm thick slices
Name Company Catalog Number Comments
MEA system:
Multielectrode array (MEA) probes: 6 x 10 planar MEA Multi Channel Systems 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10 electrode diameter, 30 µm; electrode spacing, 500 µm; impedance, 50 kΩ at 200 Hz
Multielectrode array (MEA) probes: 8 x 8 MEA  Ayanda Biosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8 pyramidal-shaped electrode; diameter, 40 µm; tip height, 50 µm; electrode spacing, 200 µm; impedance, 1,000 kΩ at 200 Hz
A 60-channel amplifier was used with a band-pass filter set between 0.1 Hz and 3 KHz at 1,200X amplification Multi-Channel Systems MEA-1060-BC
MC Rack software at a 10 KHz sampling rate Multi-Channel Systems Software for data collect and recordings
control of a pulse generator Multi-Channel Systems STG 1002
slice anchor kits and hold-downs Warner Instruments SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltic Pump-minipuls3 Gilsom MINIPULS3 perfusion rate : 8 ml/min
Name Company Catalog Number Comments
Stimulation system:
Isolated stimulator A-M Systems Model 2100 intensity of ±350 μA , duration of 200 μsec
Tungsten electrode A-M Systems 575300 placed in thalamus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociência Edição 112 anterior córtex cingulado apreensão plasticidade sináptica a estimulação de corrente contínua o sistema tálamo-cortical
A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação
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Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W.… More

Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W. P., Shyu, B. C. Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation. J. Vis. Exp. (112), e53709, doi:10.3791/53709 (2016).

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