Abstract
المهبطي عبر الجمجمة التحفيز التيار المباشر (tDCS) يدفع الآثار القمعية على المضبوطات المقاوم للأدوية. لتنفيذ إجراءات فعالة، والمعلمات التحفيز (على سبيل المثال، والتوجه، والقوة الميدانية، ومدة التحفيز) تحتاج إلى دراسة في الأعمال التحضيرية شريحة الفئران الدماغ. اختبار وترتيب اتجاه القطب المتعلقة موقف شريحة الفئران الدماغ مجدية. هذا الأسلوب يحافظ على مسار thalamocingulate لتقييم تأثير DCS على أنشطة مثل الاستيلاء القشرة الحزامية الأمامية. وأشارت نتائج التسجيلات مجموعة متعددة أن المهبطي DCS انخفضت بشكل ملحوظ في اتساع استجابات أثار التحفيز ومدة 4 aminopyridine والنشاط مثل الاستيلاء الناجم عن bicuculline. وجدت هذه الدراسة أيضا أن التطبيقات DCS المهبطي في 15 دقيقة تسبب الاكتئاب على المدى الطويل في مسار thalamocingulate. الدراسة الحالية تبحث آثار DCS على thalamocingulatالبريد اللدونة متشابك والأنشطة مثل الاستيلاء الحادة. الإجراء الحالي يمكن اختبار المعلمات التحفيز الأمثل بما في ذلك التوجه، والقوة الميدانية، ومدة التحفيز في المختبر في نموذج الفأر. أيضا، يمكن للطريقة تقييم آثار DCS على أنشطة مثل الاستيلاء القشرية على المستويين الخلوية والشبكة.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على موضوعات الحيوانية رعاية المؤسسية الحيوان واللجنة استخدام، أكاديمية سينيكا، تايبيه، تايوان.
1. إعداد الحل التجريبي والمعدات اللازمة لتسجيل صفيف Multielectrode
- إعداد الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (ACSF، 124 مم كلوريد الصوديوم، 4.4 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 3، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 25 مم NaHCO 3، و 10 ملي الجلوكوز، فقاعات مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2).
- استخدام نوعين من تحقيقات الشرق الأوسط وأفريقيا: 6 × 10 MEA مستو و 8 × 8 الشرق الأوسط وأفريقيا. ويشمل التحقيق السابق للمنطقة التي تضم القشرة، المخطط، والمهاد. ويشمل التحقيق الأخير فقط من المنطقة القشرية.
- استخدام مكبر للصوت 60 قناة مع فلتر الفرقة تمرير يقع بين 0.1 هرتز وكيلو هرتز 3 في 1200 التضخيم. الحصول على البيانات بمعدل أخذ العينات 10 كيلو هرتز.
- وضع اثنين من الأسلاك الفضة المطلية أجكل-داخل غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا لDCS. استخدام أجكلأسلاك الفضة المغلفة لإنتاج الحقول الكهربائية التي يتم إنشاؤها من قبل مشجعا معزولة.
- وضع التنغستن القطب (قطر، 127 ميكرون، طول، 7.62 سم، 8 ° AC طرف مدبب، ومقاومة، 5 MΩ) لتحفيز مهادي، ووضع القطب المرجعية في غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا. تقديم تيارات القطب التنغستن باستخدام منشط المعزولة التي يتم التحكم بواسطة مولد نبض.
2. إعداد شريحة الدماغ
- استخدام الذكور C57BL / 6J الفئران، 4-8 أسابيع من العمر. بيت الحيوانات في غرفة مكيفة الهواء (21-23 درجة مئوية، و 50٪ الرطوبة؛ 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام، أضواء على في 08:00) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
- اتخاذ قسامة 250 مل من ACSF التي أعدت في الخطوة 1.1، ووضعه في كوب يحتوي على الجليد. في نفس الوقت، وتوفير الغاز المستمر الذي يتكون من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- العملية الجراحية
- تخدير الحيوان مع 4٪ الأيزوفلورين في كوبمربع لحوالي 3 دقائق. عندما يصل الحيوان عمق الجراحية التخدير (المشار إليها لعدم وجود استجابة لقرصة اصبع القدم)، وضعه على صينية ضحلة مليء الثلج المجروش، وإزالة الرأس باستخدام مقص.
- فضح الجمجمة، وتقليم قبالة العضلات المتبقية. التالي، وذلك باستخدام رينجرز، قشر بعيدا السطح الظهري من الجمجمة من الدماغ. تقليم بعيدا جانبي الجمجمة باستخدام رينجرز. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع حل الإيثانول 75٪.
- باستخدام ملعقة، وقطع بصيلات الشم وصلات عصبية على طول السطح البطني من الدماغ، وإزالة المخ. بعد قطع الرأس، بسرعة نقل الدماغ إلى دورق مملوء ACSF الاوكسيجين الجليد الباردة.
- إعداد الإنسي المهاد (MT) -ACC الدماغ شريحة
ملاحظة: إعداد شرائح التي تحتوي على مسار من طن متري إلى ACC 13.- ومن ناحية قطع كتلة الدماغ مع اثنين من التخفيضات السهمي 2.0 مم الوحشي على خط الوسط في كل الكرة الأرضيةلعرض تشريح تحت القشرية. ثم جعل اثنين من التخفيضات الزاوية. جعل الأول عبر قطع بالتوازي مع الجهاز الألياف مرئية في المخطط.
- جعل الثاني عبر قطع من الاتصال بين المخيخ والقشرة البصرية إلى نقطة الوسط بين الصوار الأمامي والجهاز البصري التي هي بطني وبالتوازي مع المسار thalamocingulate.
- إرفاق كتلة الدماغ على لوحة الزاوي (~ 120 درجة) بمادة لاصقة cyanoacrylate، وجعل قطع فقط فوق نقطة تحول في مسار. تتكشف لوحة، وتمهيدها، والغراء على خشبة المسرح غرفة من vibratome.
- جعل سطي شرائح الدماغ المهاد لجنة التنسيق الإدارية (500 ميكرون سميكة) ثم تزج بهم في الجليد الباردة المؤكسج شرائح aCSF.Transfer إلى غرفة تسجيل، والحفاظ على 32 درجة مئوية تحت نضح مستمر (12 مل / دقيقة) مع الاوكسيجين ACSF ل1 ساعة.
3. إعداد غرفة الإرواء للتسجيل صفيف Multielectrode
- تجهيزغرفة الإرواء
- وضع مسبار الشرق الأوسط وأفريقيا على نظام متعدد القنوات، واستخدام اثنين من أنابيب البولي ايثيلين منفصلة لربط التحقيق لمضخة تحوي. استخدام أنبوب واحد لتوجيه ACSF في غرفة الشرق الأوسط وأفريقيا وأنبوب آخر لتوجيه ACSF من الغرفة. وأخيرا، يروي باستمرار إعداد مع الدافئة (29-30 درجة مئوية) ACSF الاوكسيجين (8 مل / دقيقة).
- نقل شريحة الدماغ إلى الشرق الأوسط وأفريقيا. اضغط باستمرار على شريحة الدماغ على الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام قطعة من القطن مبللة. بعناية نقل شريحة الدماغ لضمان ACC موجه فوق الأقطاب.
- استخدام مجموعات مرساة شريحة وعقد هبوطا في الضغط على شريحة الدماغ. هذه الخطوة يضمن الربط الكهربائي جيد بين شريحة والأقطاب الكهربائية.
4. الجيل من الحقول الكهربائية التي DCS
ملاحظة: تم يستند تعريف التوجه المجال الكهربائي على اتجاه محور محواري تغصني في لجنة التنسيق الإدارية. كانت توجهات التغصنات وسوما مقصوراتأكد باستخدام جولجي تلطيخ 12.
- وضع القطب أجكل (كما هو موضح الأنود) الأقرب إلى لجنة التنسيق الإدارية، ووضع القطب الآخر (كما هو موضح الكاثود) البعيدة إلى ACC. تسجيل قوة الحقل الذي تم إنشاؤه بواسطة التوجهات المجال اثنين (متوازية ومتعامدة مع الألياف محواري تغصني ACC) من الشرق الأوسط وأفريقيا، وتسليم تيارات الحقول الكهربائية باستخدام مشجعا.
- إصلاح مسافة الأقطاب أجكل (حوالي 1.5-2 سم)، وضبط قوة مشجعا الحالية لجعل DCS بين 0.5 و 2 مللي أمبير.
5. الناجم كهربائيا-الردود القشرية متشابك
ملاحظة: الحث على ردود متشابك في لجنة التنسيق الإدارية عن طريق تحفيز الكهربائي في MT، فيه برمجة مولد التحفيز الكهربائي تنتج نبضات الحالية ثنائية الطور مستطيلة.
- كرر القسم 3 أعلاه.
- وضع التنغستن القطب في MT، وتقديم البقول من التحفيز والتشجيع للثالالمنطقة AMIC من شرائح عبر الأقطاب الكهربائية التنغستن القطبين.
- استخدام مختلف الكثافات الحالية لتحديد العتبة التي يتسبب استجابة ACC. هنا، استخدام كثافة ± 150 أمبير ومدة 200 μsec، الامر الذى أدى إلى استجابة القصوى 80٪ في لجنة التنسيق الإدارية في معظم شرائح.
- نقل التنغستن القطب على طول الطريق thalamocingulate (من طن متري إلى الجسم الثفني) في شريحة MT-ACC للحصول على لمحات استجابة المثلى.
- جعل 10-20 الاحتلالات الردود ACC، واستخدام البرنامج تلقائيا متوسط كل من لجنة التنسيق الإدارية التي حركها التحفيز طن متري. النتيجة محطة الفضاء الدولية الردود متشابك في لجنة التنسيق الإدارية الناجمة من التحفيز طن متري بحلول MT-ACC الطريق.
6. يسببها كهربائيا، مثل الاستيلاء آخر
ملاحظة: تم يسببها مثل الاستيلاء النشاط من تطبيق 4-aminopyridine (4-AP، 250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر). وأظهرت دراسات التحكم في الوقت السابقة التي الردود القصوى ومستقرة ظهرت2-3 ساعة بعد تطبيق الدواء 14.
- كرر القسم 5 أعلاه.
- إضافة المخدرات إلى حل التروية. استخدام 4-AP (250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر). مزج الأدوية بانتظام، ومواصلة نضح لمدة 2-3 ساعة.
- لتسهيل النشاط مثل الاستيلاء، والحفاظ على مضخة نضح بمعدل سريع نسبيا التروية (8 مل / دقيقة)، والتي يمكن أن تساعد أيضا في منع تراكم التدرج درجة الحموضة.
- وضع التنغستن القطب في MT، وتقديم التحفيز الكهربائي (150 أمبير، 200 μsec مدة) للحصول على لمحات استجابة ACC.
- جعل 10-20 الاحتلالات ومتوسط الاستجابات.
- استبدال الحل نضح مع ACSF جديدة لتغسل المخدرات. كرر الخطوة 6.5.
7. اختبار تأثير DCS على الردود القشرية مستدعى
- كرر القسمين 3 و 4. تأكد يتم إنشاؤها أن الحقول الكهربائية الموحدة عن طريق تمرير التيارات بين اثنين موازية أسلاك الفضة المطلية أجكل التي يتم وضعها داخل MEA غرفة. إذا كان هناك أي مشاكل، وDCS يبقى بين 0.5 و 2 مللي أمبير.
- إيقاف DCS، ووضع القطب الكهربائي التنغستن لتحفيز المهاد (± 150 أمبير، 200 μsec المدة). للحصول على ردود متشابك القصوى في لجنة التنسيق الإدارية، وجعل 10-20 الاحتلالات ومتوسط الاستجابات.
- تتحول في وقت واحد على DCS (2 بالسيارات / مم قوة DCS) والتحفيز مهادي (350 أمبير، 200 μsec المدة). تقييم التغيرات في مدى الاستجابة ACC-أثار التحفيز مهادي خلال DCS.
- إيقاف DCS، وإضافة 4-AP (250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر) إلى حل التروية. ثم الانتظار 2-3 ساعة. عندما تؤثر على المخدرات شريحة الدماغ، وشريحة تنتج استجابات الاستيلاء القشرية.
- جعل 10-20 الاحتلالات الردود جنة التنسيق الإدارية، ومن ثم قياس السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية أثار الكهربائية.
- بعد الخطوة 7.5، تتحول في وقت واحد على DCS (2 القوة بالسيارات / مم DCS) والتحفيز مهادي (150 أمبير، 200 duratiعلى μsec). تقييم التغيرات في السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية أثار خلال تطبيق DCS.
- استبدال الحل نضح مع ACSF جديدة لتغسل المخدرات، وكرر الخطوات من 7.2 و 7.3.
- جمع كل من تسجيل البيانات، ومجموعة البيانات في ظروف تجريبية مختلفة. تقييم السعة ومدة ردود الاستيلاء القشرية تحت ظروف تجريبية مختلفة.
تحليل 8. البيانات
- استخدام برنامج (على سبيل المثال، MC البرمجيات الرف) إلى متوسط الردود المسجلة تلقائيا، وتصدير البيانات الخام إلى جدول بيانات. تحليل السعة ومدة البيانات الخام وتوليد الأرقام اللون.
- للكشف عن أحداث الاستيلاء متذبذبة، استخدام البرنامج لقياس قيمة خط الأساس والانحرافات المعيارية (SD). تعيين 3 SD لمستوى الضوضاء كما العتبة. سعة من قمم خلال حدث التذبذب التي تفوق هذا الحد يتم الكشف عن تلقائياأد.
- إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب ر -test.
- قياسات صريحة وتحليل التباين الأحادي النتائج (أنوفا) في النص يعني ± SE، مع ن تشير إلى عدد من شرائح درس 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد إعداد Thalamocingulate شريحة ونظام تسجيل الشرق الأوسط وأفريقيا
شريحة MT-لجنة التنسيق الإدارية من الفئران هي إعداد شريحة خاص يسمح استكشاف الخصائص الكهربية لمسار thalamocingulate. ويبين الشكل 1A الطريقة التي أعد بها شريحة MT-ACC. تمت إزالة دماغ الفأر بسرعة والاحتفاظ بها في ACSF الاوكسيجين بارد (الشكل 1A، أ، ب). للكشف التشريح تحت القشرية، وقطعت الدماغ 2.0 ملم الوحشي من خط الوسط في كل نصف الكرة للحصول على كتل الدماغ السهمي (الشكل 1A، ج، د). وقدمت اثنين من التخفيضات بطني الزاوية في كتل الدماغ على الاحتفاظ مسار thalamocingulate. وجاء أول عبر قطع في الجزء الأمامي من كتلة الدماغ، بالتوازي مع الجهاز الألياف مرئية في المخطط. وجاء عبر قطع الثاني في الجزء الخلفي من كتلة الدماغ من الرهان اتصالوين المخيخ والقشرة البصرية إلى نقطة الوسط بين الصوار الأمامي والجهاز البصري. بعد إجراء التخفيضات، تم لصقها كتلة الدماغ على صفيحة بلاستيكية الزاوية (120 درجة زاوية)، وإجراء خفض على الجانب الظهري مباشرة من خلال القشرة (الشكل 1A، على سبيل المثال). تم لصقها على لوحة كتلة الدماغ على vibratome والمغمورة في ACSF الاوكسيجين بارد. وأخيرا، تم اتخاذ بضع شرائح (500 ميكرون سميكة) من كتلة الدماغ وحضنت في ACSF الاوكسيجين (الشكل 1A، ح، ط).
ويبين الشكل 1B الإعداد MEA نظام تسجيل. ويوضح الرسم التخطيطي نظم الارواء والشرق الأوسط وأفريقيا وصله بجهاز الكمبيوتر تسجيل. وضعت لجنة التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا فارغة داخل مكبر للصوت، وبدأ نضح بمعدل تدفق 8 مل / دقيقة. وضعت شريحة الدماغ MT-ACC على التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا في حين التأكد من أن منطقة تسجيل كانت أقرب وقت ممكن إلى المركز. وكان مشجعا استخدامد لتحفيز شريحة الدماغ ويولد المجال الكهربائي. بعد أن تم الانتهاء من جميع الخطوات، سجل نظام الخصائص الكهربية من مسار thalamocingulate.
ويبين الشكل 1C الرسم البياني منطقة تسجيل والطريقة التي وضعت شريحة الدماغ MT-ACC على التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا. ويبين الشكل 1C-لظهور التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا. ساعد الخط الأسود (السهم الأحمر) على التحقيق للمستخدم تحديد الاتجاه الصحيح للتحقيق داخل مكبر للصوت. الشكل 1C-ب تظهر الدائرة الكبرى لجنة التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا. الشكل 1C-ج تظهر مجموعة الكهربائية التي كانت موضوعة على الأنسجة القشرية.
اختبار مستدعى الردود
لتأكيد الحفاظ على مسار thalamocingulate في إعداد شريحة، حفزت هذه الدراسةالمهاد والمسجلة في لجنة التنسيق الإدارية في التجارب الكهربية. فقط شرائح مع إمكانات بعد المشبكي في ACC بينما كان يلقى كمية صغيرة من التيار في MT استخدمت في التجربة. ويبين الشكل 2A مواقف التحفيز وأقطاب تسجيل واستجابات أثار التحفيز مهادي نموذجية في لجنة التنسيق الإدارية. للحث على النشاط مثل الاستيلاء، 4-AP (250 ميكرون) وbicuculline (5 ميكرومتر) كانت تستخدم للحث على النشاط صرعي. وتألفت نموذجي 4-AP مع الناجم عن bicuculline عفوية مثل مصادرة النشاط من بداية نشبي، تليها مرحلة منشط ومدة طويلة. وقد تم اختيار آثار للتضخم في الشكل 2B. حاولت هذه الدراسة أيضا إلى تقديم التحفيز في MT بعد حمل المضبوطات المخدرات التي يسببها. وكان المستحث 4 Aminopyridine / نشاط صرعي-أثار bicuculline بعد التحفيز الكهربائي (الشكل 2C).
تجريبتوجه DCS وشريحة
وأظهرت الدراسات السريرية السابقة أن التوجه للمجال الكهربائي من المهبطي DCS يؤثر مهادي النشاط أثار التحفيز. ويبين الشكل 3A توجهات مختلفة من الحقل الكهربائي، والتي تم ترتيبها بالتوازي أو عمودي على اتجاه التغصنات وسوما مقصورات في لجنة التنسيق الإدارية. عندما تم ترتيب الحقل الكهربائي موازية للخلايا العصبية، قمعت التحفيز المهبطي الردود مهادي، أثار التحفيز في الجزء الأنسي من ACC (الشكل 3B، اللوحة العليا). عندما تم ترتيب الحقل الكهربائي عموديا على الخلايا العصبية، لم يلاحظ أي آثار كبيرة على استجابات أثار التحفيز مهادي (الشكل 3B، اللوحة السفلى). كما قمعت المهبطي مواز DCS 4 املوافقة ونشاط يقوم به bicuculline مثل مصادرة في الجزء الأنسي من ACC (الشكل 3C، لوحة العليا).ذلك تقصير مدة النشاط مثل الاستيلاء، ولم يلاحظ أي تأثير كبير من المهبطي عمودي DCS (الشكل 3C، اللوحة السفلى). وأكدت هذه النتائج أن اتجاه المجال الكهربائي مهم في تنظيم انتقال متشابك في مسار thalamocingulate.
تأثير DCS على آخر الاستيلاء
التطبيق السريري من التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة، ويوفر tDCS، وDCS نهج موسع لعلاج نوبات المقاوم للأدوية. وأظهرت دراسات سابقة أن التحفيز الحقل التضمين اللدونة متشابك والنشاط صرعي أثرت في مناطق الدماغ المختلفة. وأظهرت النتائج الحالية التي tDCS المهبطي الاكتئاب thalamocingulate انتقال متشابك. والاكتئاب اتساع استجابات أثار التحفيز ومدة النشاط مثل مصادرة (9 من 11 شرائح، 81.82٪، الشكللدى عودتهم 4A، اللوحة اليسرى). الشكل 4A (اللوحة اليمنى) يظهر أن 15 دقيقة من المهبطي DCS يسببها بشكل فعال الاكتئاب على المدى الطويل (LTD) في مسار MT-ACC والاكتئاب أثار ردود (N = 11، ع <0.05). الشكل 4B (يسار لوحة) يدل على أن التحفيز مهادي أثار النشاط القوي مثل الحجز في القشرة الحزامية. ثلاثون دقيقة بعد 15 دقيقة المهبطي تطبيق DCS، تم اختصار مدة النشاط مثل الاستيلاء مهادي، أثار التحفيز. كما أظهرت النتائج أن مدة الاستيلاء عليها انخفضت بشكل ملحوظ بعد DCS المهبطي 15 دقيقة مقارنة مع أي تطبيق DCS (N = 9، ص <0.05، الشكل 4B، اللوحة اليمنى).
الشكل 1: إعداد إعداد Thalamocingulate شريحة ونظام تسجيل الشرق الأوسط وأفريقيا (A) MT-ACC شريحة الموالية cedure (أ) إزالة الدماغ و (ب) نقل إلى تهدئة ACSF الاوكسيجين. (ج) تقديم اثنين من التخفيضات سهمي من خط الوسط. عرض (د) جانب من جزء وسطي من كتلة الدماغ. (ه) تقديم اثنين من التخفيضات بطني الزاوية من كتلة الدماغ. (و) الغراء كتلة الدماغ على لوحة بلاستيكية الزاوية. (ز) اجراء خفض ظهري وتتكشف كتلة الدماغ. (ح) الغراء كتلة الدماغ في vibratome. (ط) جمع شرائح من كتلة الدماغ. إعداد النظام (ب) تسجيل الشرق الأوسط وأفريقيا. (C) MEA منطقة تسجيل. (أ) MEA التحقيق. (ب) دائرة الشرق الأوسط وأفريقيا. (ج) وقد وجهت لجنة التنسيق الإدارية من شريحة الدماغ فوق تحقيقات القطب. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ه = "1"> 
الشكل 2: الردود مستدعى مختلفة لمهادي تحفيز وتنشيط الناجم عن المخدرات (A) ردود مهادي، أثار التحفيز في لجنة التنسيق الإدارية. (ب) 4-Aminopyridine- والنشاط مثل الاستيلاء الناجم عن bicuculline. (C) stimulation- مهادي والمخدرات التي يسببها النشاط مثل النوبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تأثير توجهات مختلفة من DCS (A) توجهات مختلفة من الحقل الكهربائي. (ب) ردود مهادي، أثار التحفيز مع DCS. (ج) تأثير المهبطي DCS على النشاط مثل النوبة.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53709/53709fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير المهبطي tDCS على آخر الاستيلاء (A) خمسة عشر دقيقة المهبطي يسببها DCS-LTD والاكتئاب النشاط منبهات المسموعة. (ب) حدوث النشاط مثل الاستيلاء انخفض خلال التحفيز المهبطي. قمع النشاط مثل الاستيلاء عليها DCS المهبطي 15 دقيقة تحملت حتى عندما تم إنهاء تطبيق DCS. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، تم اختبار آثار مدة وتوجه DCS على النشاط مثل مصادرة لجنة التنسيق الإدارية. للحصول على بيانات مستقرة في شرائح دماغ الفأر، وكيفية الحفاظ على سلامة مسار MT-ACC، وتجنب الضرر الذي هو مفتاح الحل، خصوصا الخطوات التي تتم اثنين من التخفيضات بطني الزاوية وقطع ظهري من القشرة. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت لإعداد شريحة الدماغ يمكن أن تؤثر أيضا على النشاط من شريحة الدماغ، التي ينبغي أن تكون أقصر وقت ممكن للحفاظ على الدماغ جديدة وقوية. وأظهرت دراسة سابقة أن الضرر الكهروكيميائية إلى الأنسجة المستهدفة يمكن أن يحدث في إعداد في الجسم الحي 15. لإعداد شريحة الدماغ في المختبر يمكن استخدامها لتجنب هذه المشكلة. في إعداد في المختبر، والأنسجة لا اتصال مباشرة القطب، وبالتالي التقليل من آثار الكهروكيميائية 16. وتمت مقارنة آثار DCS مع الأقطاب التي كانت موجهة في اتجاهات مختلفة. عندما electrodوقد توجه وفاق على 90 درجة و 270 درجة، DCS لم يؤثر على نشاط أثار (الشكل 3). وبالتالي، استبعدت هذه التجربة سيطر على إمكانية أي آثار جانبية من التفاعلات الكهروكيميائية لDCS التي تلف الأنسجة في دراستنا. أسلوب الاسترداد واقية من شرائح الدماغ هو مفتاح آخر. الصيغة ACSF في هذه الدراسة تقدم بديلا للطريقة قطع واقية وفعالة للغاية للحفاظ على الخلايا العصبية في الدماغ شرائح من 4 إلى الحيوانات القديمة الاسبوع-8. لم يتم تصميم طريقة للاستخدام مع الحيوانات من جميع الأعمار. يظهر استخدام تريس ACSF أن تكون فعالة في الفئران الشابة كما هو استخدام أسلوب الاسترداد واقية NMDG في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 6 أسابيع، وكبار السن. وبالتالي، يجب على المستخدمين أن نضع في اعتبارنا معادلات النسبية سن عبر الأنواع لاختيار أفضل طريقة لتجربة.
يستخدم الشرق الأوسط وأفريقيا لتسجيل شرائح الدماغ هو أسلوب شائع، ولكن الجمع بين المجال الكهربائي مع تسجيل الشرق الأوسط وأفريقيا SYSلا يتم عادة تيم. التي تؤثر على المجال DC في حل موصل من نظام تسجيل MEA هو نهج مثيرة للاهتمام، وخاصة بالنسبة للفترات تصل إلى عدة ثواني إلى دقائق. وأظهرت دراسة سابقة أن تطبيق DCS لم تتغير درجة الحموضة في حل ACSF، مشيرا إلى أن الرقم الهيدروجيني للمحلول موصل كانت مستقرة في هذا الإعداد التجريبية 12. واستمر معدل نضح سريع نسبيا (8 مل / دقيقة) لتسهيل النشاط مثل الاستيلاء، وكانت تغسل أي منتجات من تغير كيميائي في التحقيق الشرق الأوسط وأفريقيا من قبل التروية، وبالتالي تجنب تراكم التدرج درجة الحموضة. وغالبا ما Multielectrode التكنولوجيا تسجيل مجموعة محدودة من نوع شريحة الدماغ ومجموعة من القطب تسجيل. نوع من شريحة الدماغ يحدد أي مسار الدائرة يتم تسجيلها، ومجموعة من القطب تسجيل يحدد ما إذا كان يتم تسجيل نوى الدماغ واحدة أو متعددة. لا بد من تأكيد هذه الشروط قبل التجربة.
قبل وأظهرت دراسات vious أن الآثار الطويلة الأجل لDCS تحدث من خلال تعديل انتقال متشابك 17. في هذه الدراسة، تسبب المهبطي DCS LTD في مسار MT-ACC. اقترح LTD أو depotentiation من التقوية المتعلقة مصادرة لتكون جزءا من آلية الكامنة وراء قمع الاستيلاء، مما يوحي بأن تعزيز نتائج العلاج tDCS قد يكون ممكنا. ومع ذلك، فقد ركز أي دراسة نشرت على شدة المجال عند القشرة الحزامية. موقع العميق من القشرة الحزامية في الجزء الأنسي من قشرة من الصعب اختبار. على سبيل المثال، فإنه لا مفر منه تدفق الحالية قد تؤثر على الأنسجة والأوعية التي هي أقرب إلى السطح. صعوبة استهداف الأنسجة العميقة التي tDCS قد تحد من تطبيق tDCS في الجسم الحي الدراسة. لذلك، لنفهم كيف يؤثر DCS الأنشطة العصبية، وإعداد شريحة الدماغ ينبغي أن تستخدم، كما آثار الأوعية الدموية غير محددة يجب استبعاد.
jove_content "> لغرض إنشاء النموذج التجريبي، هو فعل الاستيلاء وصفها في الدماغ السليم. وكان الأنشطة مثل الاستيلاء الناجم عن مزيد من نبضة كهربية. توقيت حدوث النوبة يمكن أن تسيطر على وجه التحديد عندما تم تطبيق DCS قد توفر نتائج مزيد من المعلومات عن علاج tDCS. كان نتيجة بارزة أخرى التغييرات في استثارة القشرية الإقليمية التي يسببها tDCS طويلة الأمد. في المستقبل، وإذا كان من الممكن توضيح الآلية الكامنة وراء tDCS، ثم الجمع بين DCS و العلاج الدوائي لتعزيز LTD في علاج الصرع قد يكون تطورا مثيرا للاهتمام للغاية.وفي الختام، قدم منهجية للتحقيق في آثار DCS على thalamocingulate واللدونة متشابك transcallosal والمضبوطات الحادة. وقعت الآثار الطويلة الأجل لDCS على النشاط مثل مصادرة في إعدادنا شريحة الدماغ من خلال آلية LTD الشبيهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Isoflurane | Halocarbon Products Corporation | NDC 12164-002-25 | 4% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aCSF (total:1 L): | |||
| D(+)-Glucose | MERCK | 1.08337.1000 | 10 mM |
| Sodium hydrogen carbonate | MERCK | 1.06329.0500 | 25 mM |
| Sodium chloride | MERCK | 1.06404.1000 | 124 mM |
| (+)-Sodium L-ascorbate, >=98% | SIGMA | A4034-100G | 0.15 g/2 c.c |
| Magnesium sulfate, anhydrous, ReagentPlus | SIGMA | M7506-500G | 2 mM |
| Calcium chloride dihydrate | MERCK | 1.02382.1000 | 2 mM |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | MERCK | 1.06346.1000 | 1 mM |
| Potassium chloride | May & Baker LTD Dagenham England | MS 7616 | 4.4 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs: | |||
| (+)-Bicuculline | TOCRIS | 0130 | 5 µM in aCSF |
| 4-Aminopyridine | TOCRIS | 0940 | 250 µM in aCSF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain slice Preparation: | |||
| Vibratome | Vibratome | Series 1000 | Block slicing into 500 µm thick slices |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEA system: | |||
| Multielectrode array (MEA) probes: 6 x 10 planar MEA | Multi Channel Systems | 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10 | electrode diameter, 30 µm; electrode spacing, 500 µm; impedance, 50 kΩ at 200 Hz |
| Multielectrode array (MEA) probes: 8 x 8 MEA | Ayanda Biosystems | 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8 | pyramidal-shaped electrode; diameter, 40 µm; tip height, 50 µm; electrode spacing, 200 µm; impedance, 1,000 kΩ at 200 Hz |
| A 60-channel amplifier was used with a band-pass filter set between 0.1 Hz and 3 KHz at 1,200X amplification | Multi-Channel Systems | MEA-1060-BC | |
| MC Rack software at a 10 KHz sampling rate | Multi-Channel Systems | Software for data collect and recordings | |
| control of a pulse generator | Multi-Channel Systems | STG 1002 | |
| slice anchor kits and hold-downs | Warner Instruments | SHD-26H/10; WI64-0250 | |
| Peristaltic Pump-minipuls3 | Gilsom | MINIPULS3 | perfusion rate : 8 ml/min |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulation system: | |||
| Isolated stimulator | A-M Systems | Model 2100 | intensity of ±350 μA , duration of 200 μsec |
| Tungsten electrode | A-M Systems | 575300 | placed in thalamus |
References
- Schiller, Y., Najjar, Y. Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history. Neurology. 70 (1), 54-65 (2008).
- Fregni, F., et al. A controlled clinical trial of cathodal DC polarization in patients with refractory epilepsy. Epilepsia. 47 (2), 335-342 (2006).
- Auvichayapat, N., et al. Transcranial direct current stimulation for treatment of refractory childhood focal epilepsy. Brain Stimul. 6 (4), 696-700 (2013).
- Chung, M. G., Lo, W. D. Noninvasive brain stimulation: the potential for use in the rehabilitation of pediatric acquired brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 96 (4 Suppl), S129-S137 (2015).
- Del Felice, A., Magalini, A., Masiero, S. Slow-oscillatory Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Memory in Temporal Lobe Epilepsy by Altering Sleep Spindle Generators: A Possible Rehabilitation Tool. Brain Stimul. 8 (3), 567-573 (2015).
- Garnett, E. O., Malyutina, S., Datta, A., den Ouden, D. B. On the Use of the Terms Anodal and Cathodal in High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation: A Technical Note. Neuromodulation. , (2015).
- Biraben, A., et al. Fear as the main feature of epileptic seizures. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 70 (2), 186-191 (2001).
- Zaatreh, M. M., et al. Frontal lobe tumoral epilepsy: clinical, neurophysiologic features and predictors of surgical outcome. Epilepsia. 43 (7), 727-733 (2002).
- Karim, A. A., et al. The truth about lying: inhibition of the anterior prefrontal cortex improves deceptive behavior. Cereb. Cortex. 20 (1), 205-213 (2010).
- Keeser, D., et al. Prefrontal transcranial direct current stimulation changes connectivity of resting-state networks during fMRI. J. Neurosci. 31 (43), 15284-15293 (2011).
- Nelson, J. T., McKinley, R. A., Golob, E. J., Warm, J. S., Parasuraman, R. Enhancing vigilance in operators with prefrontal cortex transcranial direct current stimulation (tDCS). Neuroimage. 85 (Pt 3), 909-917 (2014).
- Chang, W. P., Lu, H. C., Shyu, B. C. Treatment with direct-current stimulation against cingulate seizure-like activity induced by 4-aminopyridine and bicuculline in an in vitro mouse model. Exp. Neurol. 265, 180-192 (2015).
- Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs. Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).
- Chang, W. P., Shyu, B. C. Involvement of the thalamocingulate pathway in the regulation of cortical seizure activity. Recent Research Developments in Neuroscience. Pandalai, S. G. 4, Research Signpost. Kerala. 1-27 (2013).
- Brummer, S. B., Turner, M. J. Electrochemical considerations for safe electrical stimulation of the nervous system with platinum electrodes. IEEE Trans. Biomed. Eng. 24 (1), 59-63 (1977).
- Durand, D. M., Bikson, M. Suppression and control of epileptiform activity by electrical stimulation: a review. Proc. IEEE. 89 (7), 1065-1082 (2001).
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).
