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Neuroscience

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53709
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

Catódica transcraneal estimulación de corriente directa (tDCS) induce efectos supresores sobre las convulsiones resistentes a los medicamentos. Para llevar a cabo acciones efectivas, los parámetros de estimulación (por ejemplo, orientación, intensidad de campo, y la duración de estimulación) deben ser examinados en el tramo preparativos ratones cerebrales. Pruebas y la organización de la orientación del electrodo respecto a la posición de la rebanada de cerebro de ratones son factibles. El presente método conserva la vía thalamocingulate para evaluar el efecto de DCS sobre las actividades que parecen convulsiones corteza cingulada anterior. Los resultados de los registros de matriz multicanal indicaron que catódica DCS disminuyó significativamente la amplitud de las respuestas de estimulación evocado y duración de 4-aminopiridina y la actividad convulsiva-como bicuculina inducida. Este estudio también encontró que las aplicaciones DCS catódica en 15 min causó depresión a largo plazo en la vía thalamocingulate. El presente estudio investiga los efectos de DCS en thalamocingulate plasticidad sináptica y actividades agudos que parecen convulsiones. El procedimiento actual puede poner a prueba los parámetros de estimulación óptimos incluyendo la orientación, intensidad de campo, y la duración de estimulación in vitro en un modelo de ratón en. Además, el método puede evaluar los efectos de DCS en las actividades corticales que parecen convulsiones, tanto a nivel celular y de la red.

Protocol

Procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el Institucional utilización, Academia Sinica, Taipei, Taiwán.

1. Preparación de la solución experimental y Equipo para multielectrode grabación de matriz

  1. Preparar artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF; NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM de MgSO4, CaCl2 2 mM, NaHCO3 25 mM y glucosa 10 mM, burbujeado con 95% de O2 y 5% de CO 2).
  2. Utilizar dos tipos de sondas MEA: 6 x 10 MEA plana y 8 x 8 MEA. La primera sonda abarca la región que comprende la corteza, el cuerpo estriado y el tálamo. Esta última sonda cubre sólo la región cortical.
  3. Utilice un amplificador de 60 canales con un filtro de paso de banda establecido entre 0,1 Hz y 3 kHz a 1200 de amplificación. Adquirir datos a una velocidad de muestreo de 10 kHz.
  4. Coloque dos cables de plata recubiertos con AgCl dentro de la cámara de MEA para DCS. Utilice el AgClcables de plata recubiertas para producir campos eléctricos que son generados por un estimulador aislado.
  5. Colocar un electrodo de tungsteno (diámetro, 127 m; longitud, 7,62 cm; 8 ° CA punta cónica, resistencia, 5 mO) para la estimulación del tálamo, y colocar el electrodo de referencia en la cámara de MEA. Entregar las corrientes del electrodo de tungsteno utilizando un estimulador aislado que es controlado por un generador de impulsos.

2. Preparación de la rebanada del cerebro

  1. Utilice macho C57BL / 6J, de 4-8 semanas de edad. La casa de los animales en una habitación con aire acondicionado (21-23 ° C; humedad relativa del 50%; 12 h luz / 12 h / ciclo de oscuridad, luces encendidas a las 8:00 AM) con acceso libre a comida y agua.
  2. Tomar una alícuota de 250 ml de la ACSF que se preparó en el paso 1.1, y colocarlo en un vaso de precipitados que contiene hielo. Al mismo tiempo, el suministro de gas continuo que se compone de 95% de O 2 y 5% de CO 2.
  3. Cirugía
    1. Anestesiar al animal con 4% de isoflurano en un vasocaja durante aproximadamente 3 min. Una vez que el animal alcanza una profundidad de la anestesia quirúrgica (indicado por la falta de una respuesta a la pizca dedo del pie), colocarlo en una bandeja poco profunda que está lleno de hielo picado, y quitar la cabeza con unas tijeras.
    2. Exponer el cráneo, y recorte el músculo restante. A continuación, utilizando unas pinzas, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando unas pinzas. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75%.
    3. Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro, y quitar el cerebro. Después de la decapitación, transferir rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de ACSF oxigenada enfriada con hielo.
  4. Preparación de Medial Tálamo (MT) -ACC cerebro rebanada
    Nota: Preparar las rebanadas que contienen la vía de la MT en ACC 13.
    1. Mano-cortar el bloque cerebro con dos cortes sagitales 2,0 mm lateral a la línea media en cada hemisferiopara visualizar la anatomía subcortical. A continuación, hacer dos cortes en ángulo. Hacer que el primero de corte transversal paralelo al tracto de fibra visible en el cuerpo estriado.
    2. Hacer que el segundo de corte transversal de la conexión entre el cerebelo y la corteza visual en el punto medio entre la comisura anterior y tracto óptico que son ventral y en paralelo a la vía thalamocingulate.
    3. Coloque el bloque del cerebro a una placa angular (~ 120 °) con adhesivo de cianoacrilato, y haga un corte justo por encima del punto de inflexión de la vía. Despliegue la placa, aplanarlo, y la cola en el escenario de una cámara de vibratome.
    4. Mediales hacen cortes de cerebro tálamo-ACC (500 m de espesor) y luego les sumergen en helado oxigenados rebanadas aCSF.Transfer a la cámara de grabación, y mantienen a 32 ° C bajo perfusión continua (12 ml / min) con ACSF oxigenada durante 1 hora

3. Preparación de la cámara de perfusión para la grabación de matriz multielectrode

  1. Preparaciónde cámara de perfusión
    1. Colocar una sonda de MEA en un sistema multi-canal, y el uso de dos tubos de polietileno separadas para conectar la sonda a una bomba peristáltica. Use un tubo para guiar el LCRa en la cámara de MEA y el otro tubo para guiar el LCRa fuera de la cámara. Finalmente, perfundir continuamente la preparación con cálido LCRa (29-30 ° C) oxigenado (8 ml / min).
  2. Transferencia de cortes de cerebro de MEA. Mantenga pulsado el corte de cerebro en la MEA con un bastoncillo de algodón húmedo. mover con cuidado el corte de cerebro para asegurar la ACC se orienta por encima de los electrodos.
  3. Utilice las unidades de anclaje rebanada y pisadores para presionar el corte de cerebro. Este paso asegura una buena conexión eléctrica entre la división y electrodos.

4. Generación de campos eléctricos por DCS

Nota: La definición de la orientación del campo eléctrico se basa en la dirección del eje axodendritic en el ACC. Las orientaciones de los compartimentos de las dendritas y soma eranconfirmada mediante tinción de Golgi 12.

  1. Coloque el electrodo AgCl (definido como el ánodo) proximal a la ACC, y coloque el otro electrodo (definido como el cátodo) distal a la ACC. Registrar la intensidad de campo que se genera por las dos orientaciones de campo (paralelas y perpendiculares a las fibras axodendritic ACC) por parte de la MEA, y entregar las corrientes de los campos eléctricos a través del estimulador.
  2. Fijar la distancia de los electrodos AgCl (alrededor de 1,5 a 2 cm), y ajustar la fuerza actual del estimulador para hacer que el DCS entre 0,5 y 2 mA.

5. eléctricamente inducida respuestas corticales sinápticas

Nota: inducir respuestas sinápticas en el CAC por la estimulación eléctrica en el MT, en la que un generador de estímulo eléctrico programable produce pulsos de corriente bifásica rectangular.

  1. Repetir el apartado 3 anterior.
  2. Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar impulsos del estimulador a la Thalregión amic de las rodajas a través de electrodos de tungsteno bipolar.
  3. El uso de diversas intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta ACC. Aquí, utilizar una intensidad de ± 150 mu y la duración de 200 microsegundos, lo que provocó una respuesta máxima del 80% en la ACC en la mayoría de las rebanadas.
  4. Mover el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía thalamocingulate (de MT al cuerpo calloso) en el segmento de MT-ACC para obtener los perfiles de respuesta óptimos.
  5. Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y utilizar el software de forma automática a un promedio de la totalidad de la ACC evocado por la estimulación MT. El resultado ISS las respuestas sinápticas en el CAC inducidas por la estimulación por vía MT MT-ACC.

6. inducida eléctricamente episodios de tipo convulsivo

Nota: La actividad convulsiva-como se indujo por la aplicación de 4-aminopiridina (4-AP; 250 mM) y bicuculina (5 M). Anteriores estudios de control de tiempo mostraron que las respuestas máximas y estables aparecieron2-3 horas después de la aplicación del fármaco 14.

  1. Repita el apartado 5 anterior.
  2. Añadir fármacos para la solución de perfusión. Utilice 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M). Mezclar los medicamentos de manera uniforme, y continuar la perfusión durante 2-3 horas.
  3. Para facilitar la actividad convulsiva, mantener la bomba de perfusión a un ritmo relativamente rápido de perfusión (8 ml / min), que también puede ayudar a prevenir la acumulación de un gradiente de pH.
  4. Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar la estimulación eléctrica (150 mu, 200 microsegundos de duración) para obtener perfiles de respuesta del CAC.
  5. Hacer barridos 10-20 y un promedio de las respuestas.
  6. Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas. Repita el paso 6.5.

7. Efecto Ensayos de DCS sobre las respuestas corticales evocados

  1. Repita las secciones 3 y 4. Asegurar que los campos eléctricos uniformes se generan haciendo pasar corrientes entre dos alambres de plata recubiertos con AgCl paralelas que se colocan dentro de la Mcámara de EA. Si no hay problemas, la DCS se mantiene entre 0,5 y 2 mA.
  2. Apagar el DCS, y colocar un electrodo de tungsteno para estimular el tálamo (± 150 mu, 200 microsegundos de duración). Para obtener las respuestas sinápticas máximas en el CAC, hacer barridos de 10-20 y un promedio de las respuestas.
  3. Al mismo tiempo activar la DCS (2 mV / mm Resistencia a la DCS) y la estimulación del tálamo (350 mu, 200 microsegundos de duración). Evaluar los cambios de amplitud de la respuesta evocada por estimulación ACC talámica durante DCS.
  4. Apagar el DCS, y añadir 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M) a la solución de perfusión. Luego, esperar 2-3 horas. Cuando los medicamentos afectan el corte de cerebro, el corte produce respuestas convulsivos corticales.
  5. Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y luego medir la amplitud y la duración de las respuestas evocadas corticales convulsiones eléctricas.
  6. Después del paso 7.5, gire simultáneamente en el DCS (2 mV / mm DCS fuerza) y la estimulación del tálamo (150 mu, 200 duratien microsegundos). Evaluar los cambios en la amplitud y la duración de las respuestas convulsivos corticales evocados durante la aplicación DCS.
  7. Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas, y repita los pasos 7.2 y 7.3.
  8. Recoger todos los datos de la grabación, y el grupo de los datos en las diferentes condiciones experimentales. Evaluar la amplitud y la duración de las respuestas de convulsiones corticales bajo diferentes condiciones experimentales.

Análisis de datos 8.

  1. Utilizar el software (por ejemplo, el software del estante MC) a medio automáticamente las respuestas registradas, y exportar los datos en bruto a una hoja de cálculo. Analizar la amplitud y la duración de los datos en bruto y generar figuras en color.
  2. Para detectar eventos convulsivos oscilatorios, utilizar software para medir el valor de referencia y las desviaciones estándar (DE). Set 3 SD del nivel de ruido como el umbral. Amplitudes de los picos durante un evento de oscilación que superan este umbral se detectan de manera automáticaed.
  3. Realizar el análisis estadístico utilizando la prueba t de Student.
  4. Mediciones rápidas y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) resultados en el texto como media ± SE, con n que indica el número de cortes estudiaron 12.

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Representative Results

Preparación de la instalación de Thalamocingulate rebanada y sistema de grabación MEA

La rebanada MT-ACC de los ratones es una rebanada preparación especial que permite la exploración de las propiedades electrofisiológicas de la vía thalamocingulate. La Figura 1A muestra la manera en que se preparó la rebanada MT-ACC. El cerebro del ratón se retiró rápidamente y se mantiene en LCRa oxigenado fresco (Figura 1A, a, b). Para revelar la anatomía subcortical, el cerebro se cortó 2,0 mm lateral desde la línea media en cada hemisferio para adquirir bloques de cerebro sagital (Figura 1A, c, d). Dos cortes en ángulo ventral se hicieron en los bloques del cerebro para retener la vía thalamocingulate. El primero de corte transversal se realizó en la parte delantera del bloque de cerebro, paralelo al tracto de fibra visible en el cuerpo estriado. El segundo corte transversal se realizó en la parte trasera del bloque de cerebros de la apuesta de conexiónween el cerebelo y la corteza visual en el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico. Después se hicieron los cortes, el bloque cerebro estaba pegada sobre una placa de plástico en ángulo (120 ° de ángulo), y se hizo un corte en la cara dorsal directamente a través de la corteza (Figura 1A, por ejemplo). La placa de bloque cerebro estaba pegada a un vibratome y sumergido en ACSF oxigenada fresca. Por último, se tomaron unas rebanadas (500 m de espesor) del bloque del cerebro y se incubaron en ACSF oxigenada (Figura 1A, h, i).

La Figura 1B muestra la configuración del sistema de grabación de MEA. El diagrama esquemático muestra los sistemas de perfusión y MEA conectados a un ordenador de grabación. Una sonda de MEA vacío se coloca dentro del amplificador, y la perfusión comenzó a una velocidad de flujo de 8 ml / min. El corte de cerebro MT-ACC se colocó en la sonda MEA mientras que asegura que el área de grabación era tan cerca como sea posible del centro. Un estimulador fue el usod para estimular el corte de cerebro y generar el campo eléctrico. Después de que todos los pasos se completaron, el sistema registra las propiedades electrofisiológicas de la vía thalamocingulate.

Figura 1C muestra el diagrama de área de grabación y el modo en que se colocó el corte de cerebro MT-ACC en la sonda MEA. Figura 1C-a muestra el aspecto de la sonda MEA. La línea de color negro (flecha roja) en la sonda ayudó al usuario a determinar la dirección correcta de la sonda en el interior del amplificador. Figura 1C-b muestra el gran circuito de la sonda MEA. Figura 1C-c muestra la matriz eléctrica que se superpone sobre la tejido cortical.

Las respuestas de prueba Evocado

Para confirmar la preservación de la vía thalamocingulate en la preparación rebanada, este estudio estimuló latálamo y grabado en la ACC en los experimentos electrofisiológicos. Sólo rebanadas con potencial postsináptico en el ACC al tiempo que ofrece una pequeña cantidad de corriente en el MT se utilizaron en el experimento. La Figura 2A muestra las posiciones de los electrodos de estimulación y de registro y las respuestas típicas de estimulación evocado talámicos de la ACC. Para inducir la actividad convulsiva, 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M) se utilizaron para inducir la actividad epileptiforme. Típica de 4-AP con espontánea actividad convulsiva-como bicuculina inducida se compone de un inicio ictal, seguido de una fase tónica y larga duración. Se seleccionaron los rastros para la ampliación en la figura 2B. Este estudio también intentó entregar la estimulación en el MP después de la inducción de convulsiones inducidas por fármacos. Se indujo la 4-aminopiridina actividad epileptiforme / bicuculina evocada después de la estimulación eléctrica (Figura 2C).

PruebasOrientación del DCS y la rebanada

Estudios clínicos anteriores mostraron que la orientación del campo eléctrico de catódica DCS afecta a la actividad de estimulación evocado talámico. La Figura 3A muestra las diferentes orientaciones del campo eléctrico, que fue dispuesto paralelo o perpendicular a la orientación de los compartimentos de dendritas y soma en el CAC. Cuando el campo eléctrico fue dispuesta en paralelo a las células neuronales, la estimulación catódica suprime respuestas talámicas de estimulación evocado en la parte medial de la ACC (Figura 3B, panel superior). Cuando el campo eléctrico se dispuso perpendicular a las células neuronales, no se observaron efectos significativos sobre las respuestas de estimulación evocado talámicos (Figura 3B, panel inferior). Catódica paralelo DCS también suprimió 4-AP y la actividad convulsiva bicuculina inducida en la parte medial de la ACC (Figura 3C, panel superior).Se acortó la duración de la actividad convulsiva, y no se observó ningún efecto significativo del catódica perpendicular DCS (Figura 3C, panel inferior). Estos resultados confirmaron que la orientación del campo eléctrico era importante en la regulación de la transmisión sináptica en la ruta de thalamocingulate.

Efecto de DCS en la actividad convulsiva

La aplicación clínica de la estimulación magnética transcraneal, tDCS, y DCS proporciona un método no invasivo para el tratamiento de convulsiones resistentes a los medicamentos. Estudios anteriores demostraron que la estimulación de campo modula la plasticidad sináptica y la actividad epileptiforme influido en varias regiones del cerebro. Los presentes resultados mostraron que tDCS catódica deprimidos thalamocingulate la transmisión sináptica. La amplitud de las respuestas evocadas por estimulación y la duración de la actividad convulsiva estaban deprimidos (9 de 11 rebanadas, 81,82%; FigUre 4A, panel izquierdo). Figura 4A (panel derecho) muestra que 15 minutos de catódica DCS indujo eficazmente la depresión a largo plazo (LTD) en la vía de MT-ACC y deprimido respuestas evocadas (N = 11, p <0,05). La figura 4B (panel izquierdo) muestra que la estimulación del tálamo evocó robusta actividad convulsiva en la corteza cingulada. Treinta minutos después de la aplicación DCS 15 min catódica, se acortó la duración de la actividad convulsiva talámico-estimulación evocado. Los resultados también mostraron que la duración de las convulsiones se redujo significativamente después de DCS catódica 15 min en comparación con ninguna aplicación DCS (N = 9, p <0,05; Figura 4B, panel de la derecha).

Figura 1
Figura 1:. Preparación de la instalación de Thalamocingulate rebanada y sistema de grabación MEA (A) MT-ACC rebanada Proprocedimiento (a) Eliminar el cerebro y la transferencia (b) enfriar ACSF oxigenada. (C) Hacer dos cortes parasagittal de la línea media. Ver (d) de la parte medial del bloque cerebro. (E) Hacer dos cortes en ángulo ventral del bloque cerebro. (F) Pegue el bloque de cerebro en una placa de plástico en ángulo. (G) Realizar un corte dorsal y desplegar el bloque cerebro. (H) Pegue el bloque de cerebro en un vibratome. (I) Recoger las rebanadas de la manzana cerebro. Configuración del sistema (B) de grabación de MEA. (C) Área de grabación de MEA. (A) la sonda MEA. (B) Circuito de MEA. (C) El CAC de la sección de cerebro se orientó por encima de las sondas de electrodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

e = "1"> Figura 2
Figura 2: Diferentes respuestas evocadas a talámico Estimulación y estimulación inducida por medicamentos (A) Talámicas respuestas evocadas por estimulación en el CAC.. (B) 4-Aminopyridine- y la actividad convulsiva bicuculina inducida. (C) por estimulación talámica y la actividad convulsiva inducida por drogas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Efecto de diferentes orientaciones de DCS (A) diferentes orientaciones del campo eléctrico. (B) las respuestas evocadas por estimulación Talámicas con DCS. (C) Efecto de la DCS catódica sobre la actividad convulsiva.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53709/53709fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Efecto de la tDCS catódica sobre la incautación de actividad (A) Quince minutos catódica LTD inducido DCS y deprimido la actividad evocada.. (B) La ocurrencia de episodios de tipo convulsivo disminuido durante la estimulación catódica. La supresión de la actividad convulsiva por DCS catódica 15 min soportó incluso cuando se dio por terminada la aplicación de DCS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En el presente estudio, se evaluaron los efectos de la duración y la orientación de DCS en la actividad convulsiva ACC. Para obtener datos estables en cortes de cerebro de ratón, cómo mantener la integridad de la vía MT-ACC y para evitar daños es fundamental, sobre todo los pasos en los que se realizan dos cortes en ángulo ventral y dorsal de un corte de la corteza. Por otra parte, el tiempo para preparar el corte de cerebro también puede afectar a la actividad de la sección de cerebro, que debe ser el menor tiempo posible para mantener el cerebro fresco y fuerte. Un estudio previo mostró que los daños electroquímica a tejido diana se puede producir en una preparación in vivo 15. Una preparación de cortes de cerebro in vitro se puede utilizar para evitar este problema. En una preparación in vitro, el tejido no entra en contacto directamente con el electrodo, minimizando así los efectos electroquímicos 16. Los efectos de la DCS se compararon con electrodos que fueron orientadas en diferentes direcciones. Cuando el electrodes estaban orientados a 90 ° y 270 °, DCS no afectó a la actividad evocada (Figura 3). Por lo tanto, este experimento controlado excluye la posibilidad de los efectos secundarios de las reacciones electroquímicas a DCS que dañaron el tejido en nuestro estudio. El método de recuperación de protección de los cortes de cerebro es otra clave; la fórmula LCRa en este estudio proporciona una alternativa al método de corte de protección y es muy eficaz para la conservación de las neuronas en secciones de cerebro de 4 a 8 semanas los animales de edad. El método no está diseñado para su uso con animales de todas las edades; el uso de Tris LCRa parece ser eficaz en ratones jóvenes como es el uso del método de recuperación de protección NMDG en ratones de 6 semanas de edad y mayores. Por lo tanto, los usuarios deben tener en cuenta las equivalencias de edad relativa de una especie a elegir el mejor método para el experimento.

El uso de un MEA para grabar rodajas de cerebro es una técnica común, pero la combinación de un campo eléctrico con una grabación MEA sysTEM no se hace generalmente. Que afecta a un campo de corriente continua en solución conductora del sistema de grabación MEA es un enfoque interesante, sobre todo durante períodos de muchos segundos a minutos. Un estudio previo demostró que la aplicación DCS no cambió el pH en la solución LCRa, lo que indica que el pH de la solución conductora era estable en esta configuración experimental 12. Una tasa de perfusión relativamente rápido (8 ml / min) se mantuvo para facilitar la actividad convulsiva, y cualquier producto de la transformación química en la sonda de MEA se lavaron a cabo por la perfusión, evitando así la acumulación de un gradiente de pH. tecnología de grabación matriz multielectrodo es a menudo limitada por el tipo de cortes de cerebro y el rango del electrodo de registro. El tipo de cortes de cerebro determina qué vía de circuito se registra, y el rango del electrodo de registro determina si los núcleos cerebrales individuales o múltiples se registran. Estas condiciones deben ser confirmadas antes del experimento.

Pre Los estudios ante- mostraron que los efectos a largo plazo de DCS se producen a través de la modulación de la transmisión sináptica 17. En el presente estudio, DCS catódica causó LTD en la vía MT-ACC. Se propuso el LTD o depotentiation de la potenciación relacionada con las convulsiones de formar parte de los mecanismos subyacentes de la supresión de las convulsiones, lo que sugiere que la mejora de los resultados del tratamiento tDCS puede ser posible. Sin embargo, ningún estudio publicado ha centrado en la intensidad de campo en la corteza cingulada. La ubicación profunda de la corteza cingulada en la parte medial de la corteza es difícil de probar. Por ejemplo, es inevitable que el flujo de corriente puede afectar a los tejidos y vasos que están más cerca de la superficie. La dificultad de la orientación del tejido profundo por tDCS puede limitar la aplicación de tDCS para el estudio in vivo. Por lo tanto, para entender cómo afecta DCS actividades neuronales, una preparación de cortes de cerebro se debe utilizar, como los efectos vasculares no específicos deben ser excluidos.

jove_content "> Para el propósito de establecer un modelo experimental, la toma descrito se induce en un cerebro sano. Las actividades que parecen convulsiones se indujeron además por un impulso eléctrico. El momento de la aparición de convulsiones podría ser controlada con precisión cuando se aplicó el DCS . los resultados pueden proporcionar más información para el tratamiento tDCS. Otro hallazgo notable fue la de larga duración cambios en la excitabilidad cortical regional que fueron inducidos por tDCS. en el futuro, si el mecanismo subyacente de tDCS puede ser dilucidado, a continuación, la combinación de DCS y terapia farmacológica para mejorar la LTD en el tratamiento de la epilepsia puede ser un desarrollo muy interesante.

En conclusión, se proporcionó una metodología para investigar los efectos de DCS en thalamocingulate y la plasticidad sináptica transcallosal y convulsiones agudas. Los efectos a largo plazo de DCS sobre la actividad convulsiva en nuestra preparación de cortes de cerebro se produjo a través de un mecanismo similar a LTD.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
Name Company Catalog Number Comments
aCSF (total:1 L):
D(+)-Glucose MERCK 1.08337.1000 10 mM
Sodium hydrogen carbonate MERCK 1.06329.0500 25 mM
Sodium chloride MERCK 1.06404.1000 124 mM
(+)-Sodium L-ascorbate, >=98% SIGMA A4034-100G 0.15 g/2 c.c
Magnesium sulfate, anhydrous, ReagentPlus SIGMA M7506-500G 2 mM
Calcium chloride dihydrate MERCK 1.02382.1000 2 mM
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate MERCK 1.06346.1000 1 mM
Potassium chloride May & Baker LTD Dagenham England MS 7616 4.4 mM
Name Company Catalog Number Comments
Drugs:
(+)-Bicuculline TOCRIS 0130 5 µM in aCSF
4-Aminopyridine TOCRIS 0940 250 µM in aCSF
Name Company Catalog Number Comments
Brain slice Preparation:
Vibratome Vibratome Series 1000 Block slicing into 500 µm thick slices
Name Company Catalog Number Comments
MEA system:
Multielectrode array (MEA) probes: 6 x 10 planar MEA Multi Channel Systems 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10 electrode diameter, 30 µm; electrode spacing, 500 µm; impedance, 50 kΩ at 200 Hz
Multielectrode array (MEA) probes: 8 x 8 MEA  Ayanda Biosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8 pyramidal-shaped electrode; diameter, 40 µm; tip height, 50 µm; electrode spacing, 200 µm; impedance, 1,000 kΩ at 200 Hz
A 60-channel amplifier was used with a band-pass filter set between 0.1 Hz and 3 KHz at 1,200X amplification Multi-Channel Systems MEA-1060-BC
MC Rack software at a 10 KHz sampling rate Multi-Channel Systems Software for data collect and recordings
control of a pulse generator Multi-Channel Systems STG 1002
slice anchor kits and hold-downs Warner Instruments SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltic Pump-minipuls3 Gilsom MINIPULS3 perfusion rate : 8 ml/min
Name Company Catalog Number Comments
Stimulation system:
Isolated stimulator A-M Systems Model 2100 intensity of ±350 μA , duration of 200 μsec
Tungsten electrode A-M Systems 575300 placed in thalamus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociencia No. 112 anterior córtex cingulado embargo la plasticidad sináptica la estimulación de corriente directa sistema tálamo-cortical
La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación
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Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W.… More

Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W. P., Shyu, B. C. Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation. J. Vis. Exp. (112), e53709, doi:10.3791/53709 (2016).

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