Introduction
近50年来的线虫确立了自己作为一个强大的模型来研究发展，神经生物学，进化，宿主-病原体相互作用等重要问题1这种模式在发展研究的优势在于：它的生命周期短的3天;与这些动物可以遗传改造的容易性;其透明度，使细胞的位移和形态的观察活体动物，其发展的主要是多余的子宫。线虫的发育阶段涉及胚胎和四个幼虫期（L1到L4），其次是成年。在胚胎发育期间，表皮形态吸引了相当多的关注其能更好地理解如何上皮细胞迁移作为一个群体，他们是如何重新组织他们的路口和修改其个人的形态和功能性上皮细胞内的相对定位能力。表皮形态被分为四个阶段：背侧嵌入由背表皮细胞的重组，称为皮下组织;腹侧外壳，包括在朝向腹侧中线从而包围在上皮细胞单层胚胎腹侧皮下细胞的迁移;早期和晚期延伸改造豆形的胚胎成蠕虫状幼虫。继形态，胚胎孵化和幼虫L1在开始他们的直接环境中使用有益菌喂养。
因此胚胎伸长率是胚胎发育的后期阶段。它由沿其纵向轴线的胚胎的延伸和减少其横向直径的。这涉及皮下细胞形状的急剧改变。伸长分为早期和晚期。早期阶段开始于逗号阶段结束时，体壁肌肉开始在以W 1.75倍承包期ILD型（wt）的胚胎-对应于1.75倍的长度相比，非细长的胚胎的胚胎。在该阶段发生的形态发生的过程，主要由设在皮下细胞的顶磁极丝状肌动蛋白束（FB）的驱动其伸长沿胚胎2的前-后轴线的收缩驱动。 FB的收缩是通过控制肌球蛋白轻链的磷酸三激酶LET-502 / ROCK，MRCK-1和PAK-1 5。伸长的后期，开始时身体壁肌肉变得功能，并开始承包。它涉及从体内壁肌肉的背部和腹部皮下细胞机械传导信令和结束时动物孵化3。
伸长缺陷通常的特征在于由动物死于胚胎的百分率（胚胎致死性; EMB）和那些阻止其为L1幼虫（幼虫被捕表型的发展;吕a）和比重量显著缩短。发育停滞阶段的鉴定需要死胚显微镜观察并逮捕幼虫3-6。
据最近表明，一些基因，如Cdc42的/ Rac的调节和效应PIX-1和PAK-1，早期和晚期伸长3,7-期间控制形态发生的过程。我们最近还表明，形态发生过程早期伸长3 7期间沿胚的前-后轴线不同。这些发现促使新指标专门针对早期或晚期阶段的延伸和其他指标，可早在伸长沿前 - 后轴上胚胎的形态表征的发展。
这些新颖的方法包括在测量胚的长度在开始和早期伸长的末端以及它们的宽度，他广告和尾巴。7两个协议还制定了衡量初孵幼虫的长度，在L1阶段7同步。
胚胎的蛋壳保护它们免受碱性次氯酸盐处理而幼虫，成虫和存在于培养基的细菌通过处理溶解。然后，该处理用于从含有多数精心喂养成人8的非同步人口纯化胚胎。食物相克是用来初孵幼虫同步。测量这些幼虫的长度，然后用于检测伸长缺陷。这种测量优于在培养皿被捕幼虫的测量，因为幼虫从孵化非充分拉长胚胎可以恢复喂奶时“正常的长度”，但在缺乏食物时被捕将保持它们的尺寸减小。
在这里，我们提出详细的协议，使的乐测量延长使用时间推移DIC显微镜和图像分析（方案1）的胚胎，以及他们的头部的宽度和尾部NGTH。我们还提供了详细的协议，来测量使用图像分析（协议2）和流式细胞仪（协议3）同步幼虫的长度。
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Protocol
1.在WT和突变体动物早期伸长缺陷的表征
- 安装胚胎Normarski DIC显微镜
- 准备下列培养基和材料：
- M9缓冲液，溶解12.8克/升的 Na 2 HPO 4•7H 2 O，3g / L的KH 2 PO 4，5g / L的氯化钠，0.25克/升MgSO 4上•7H 2在蒸馏水和高压釜消毒O操作。
- NGM板，溶解3g / L的氯化钠16克/升琼脂，2.5g / L的细菌用蛋白胨在DDH 2 O高压灭菌，并添加1mM的MgSO 4上，1mM的氯化钙 ，1 mM磷酸盐缓冲液和5微克/毫升胆固醇。倒为60 mm培养皿6毫升NGM的。允许介质固化，在室温下24小时。添加大肠杆菌的饱和培养几滴大肠杆菌 OP50细菌生长在Luria培养基（LB）。让细菌生长48小时，将板储存在4℃。
- 要生成蠕虫PI放，安装在一个短巴斯德吸管一个“直径0.01铂丝。通过加热该末端与苯环燃烧器紧固铂线对玻璃吸管的末端。拼合线的末端，以产生一种铲。
- 长60毫米，OP50 NGM板蠕虫应变在20℃。
注意：热敏等位基因可能需要在高达摄氏25.5度正以非许可温度动物。板应包含为了追求协议很多的年轻人，仍然充足的食物。 - 将通过遮蔽胶带（ 图1A）的两层涉及两个间隔幻灯片之间载玻片。
- 由30秒期间的微波加热0.6克琼脂糖粉末溶解在20毫升的M9缓冲准备在M9缓冲液中的3％的琼脂糖溶液（重量/体积）。使该溶液冷却5分钟。
注：琼脂糖溶液可以用微波炉融化后用于几天。它也可以等分并储存在4℃几周。 - 放置在位于两个间隔物幻灯片之间的载玻片热3％的琼脂糖溶液一滴。避免形成气泡。
- 迅速覆盖另一个滑动琼脂糖如图1B和轻轻下压。顶部滑动将变平的琼脂糖滴与生成用胶带的两层的厚度的垫。
- 允许琼脂糖固化在室温下至少1分钟，或直至胚胎是准备要传送到垫。
- 使用蠕虫挑，转20〜30以及美联储从年轻人身上NGM板到含有400微升M9的缓冲区的微型离心管中。
- 允许蠕虫通过重力为约5分钟沉降并使用微量去除上清。这一步的目的是去除最高挑的线虫细菌。
- 加入200μl的M9缓冲液中向每个管中。
- 使用PIP巴斯德ETTE，管（缓冲和线虫）的内容传送到一个表玻璃。
- 使用一个或两个25G 5/8“针头切动物在中间主体部（精囊和外阴之间）。
注：一种手术刀刀片也可以使用以替代针（多个）。做到这一点的游泳线虫和可能需要一些练习。该想法是使用针作为剪刀或取决于许多针是如何使用一把刀。一旦动物被剖开，雌雄同体释放他们的胚胎到缓冲区。 - 在表玻璃的通过产生一个圆形涡流的液体内的中心集中胚胎。
- 从使用微量的表玻璃除去大部分的M9。留出大约30微升的M9与胚胎。
- 卸下滑动它关闭垫覆盖琼脂糖垫（ 图1B）的幻灯片。
- 切割垫，以便刀片能够用盖玻片完全覆盖它（图1C）。
- 使用巴斯德吸管，所有的胚胎（和蠕虫碎片）转移到琼脂糖垫。
- 组的胚胎在利用在用于200微升微量的尖端的末端胶合睫毛垫的中心。
- 慢慢地放在垫，避免泡沫形成盖玻片并密封。
注意：几个封闭剂可以使用。我们运用拉丝在艺术和工艺品商店发现胶（常用作掩蔽水彩画画胶）。此胶被使用，因为它是亲水性的并固化相当快并且没有毒性的蠕虫。简报也可以用指甲油或VALAP（由凡士林，羊毛脂和石蜡蜡的混合物）密封。 - 允许约15分钟的拉伸胶干燥。
- 准备下列培养基和材料：
- 录音采用四维Normarski DIC显微镜早期伸长率
注意：该步骤的目的是从逗号早伸长记录到晚伸长的开始- 当体壁肌肉开始收缩定义为时刻。我们还致力于记录当时不止一个胚胎。八个小时记录的通常需要记录早期伸长的一组非同步的胚胎。- 放置在显微镜阶段安装的滑动。确保显微镜配备了10X 60X和目标以及DIC透镜，棱镜，照相机和捕捉软件，使时间推移显微镜和代Z-栈（自动Z-平台）。
注意：确保温度在显微镜室20和23℃之间不变。加热 - 冷却室可以用热敏突变体尤其是当需要在显微镜舞台上。 - 识别一组胚胎在使用10倍的目标形态前阶段。
- 一旦找到，滑出10倍的目标，并添加浸油一滴在幻灯片上。
- 使用60X的目标，确定顶部和e的底部mbryos设置了Z-叠加成像参数。
注意：不要犹豫，设置Z堆栈比胚胎的厚度。设置两个相邻平面之间的距离为0.8微米。这将使覆盖胚胎的总深度在35至50的Z-计划。
注意：如果在显微镜包含一个自动化的xy平台，位于所述垫的不同位置的胚胎可以同时记录。这样做，记录的xy坐标上希望在实验的过程中，分析垫的每个位置的。确保设置记录参数时，选择XY，并按照协议的其余部分所示。记录期间的胚胎薄的Z-切片不一定需要对该协议详述的测量。然而，记录重量和突变的动物胚胎发育的最大分辨率是为了建立录音能够支持额外分析库一个很好的做法。 - 组了时间推移与两次收购持续8小时之间2分钟的间隔。
注：暴露时间将取决于在显微镜设置的光强度。早在延长细胞的运动速度很慢;曝光时间可以是每秒或更小大约一帧。如果胚胎早期阶段的形态（背夹层，腹外壳），早期伸长率会1小时之内被记录。确保光快门每次采集之间关闭。 - 运行采集和保存。
- 放置在显微镜阶段安装的滑动。确保显微镜配备了10X 60X和目标以及DIC透镜，棱镜，照相机和捕捉软件，使时间推移显微镜和代Z-栈（自动Z-平台）。
- 使用图像分析早期伸长缺陷的测量
- 打开斐济的ImageJ软件（ v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ）。
- 在菜单中选择分析/集测量，选择外围。对于每个胚，调整的Z比例尺专注于胚胎的咽， 如图2A所示 。这将确保你专注于胚胎的中心。 为了测量胚的长度，调整时间比例尺有感兴趣的胚胎在早期伸长的开始（逗号阶段; 图2A）。注意时间（“时间的开始”）。
- 选择的分割行工具。绘制从胚胎的嘴的前端的分割线至其尾巴尖的胚胎（ 图2A）的中线以下。使用菜单选项卡分析/测量，获取画线的长度（“长度的开始”）。
- 在早期的延伸的终端重复这种测量对相同的胚胎（时刻时肌肉开始收缩）。注意时间（“时间的终结”），测量胚胎以上（ 图2B）详见（“长度端”）的长度。
- 在这个阶段计算初延伸率和长度的增加（L）的持续时间（D）的，如下所示：
D =“时间尽头” - “时间开始。”
＆＃160; L =“长度高端” - “长 - 开始” - 为了测量头的宽度，调整时间比例尺具有在感兴趣（1.2倍阶段或早期伸长的端）的阶段的胚胎。选择直线工具。绘制的头部的横向（背腹轴）中线。这一部分是胚胎（ 图2C）的最厚的部分。使用菜单分析/测量，获得对应于所述头部宽度的线的长度。
- 在相同的时间点，通过绘制尾部的横向中线重复此步骤（肠阀和尾巴尖之间中部线; 图2C），并测量它来获取尾部的宽度。
注：使用该测量在不同的表型同台比较胚胎。以保证该测量的再现性，确保找到周围设动物的尾部的中间线，可以很容易地从一个动物识别到一个位置诺特尔。 - 要计算头尾宽度的比例，除以尾宽头的宽度。
2.晚伸长缺陷表征图像分析
- 使用碱性次氯酸钠处理L1幼虫同步
- 从含有许多妊娠成人非饥饿60毫米板，通过使用巴氏吸管1毫升M9缓冲液与洗涤线虫断板收集在微型离心管中的所有蠕虫。
- 沉积物线虫在3500 xg离心在室温3分钟，除去使用微量上清液而不扰乱蠕虫粒料。
- 1毫升次氯酸钠溶液添加到每个管（0.4M的次氯酸钠，0.5M氢氧化钠），并摇动3分钟。
注：碱性次氯酸盐溶液应新鲜配制和胚胎在这个解决方案应该轻轻搅动，但不断优化成年人溶解和氧合电磁制动的YOS。经过3分钟搅拌，大多数成年人应该释放他们的鸡蛋到溶液中。 - 转速为3500 XG 3分钟，在室温和快速清除使用微量上清而不干扰沉淀。
- 用1ml的M9缓冲液中，随后通过离心3500 xg离心3分钟洗四次。
- 第四洗涤后，除去在700微升的M9缓冲液中的上清，重悬鸡蛋不吹吸卵（如鸡蛋会粘到尖端的塑料）。
- 磁带上在适当的生长温度置于培养箱3毫米轨道摇床的管中，在600rpm下摇动过夜。
- 同步幼虫长度测量
- 离心机被捕L1幼虫在3500 xg离心在室温3分钟，去除上清。悬浮幼虫在100μl的M9缓冲液中，并将它们传送到使用巴斯德吸管琼脂糖垫（琼脂糖焊盘应准备-d作为在1.1.2节描述1.1.8）。广场上的垫盖玻片。
注：垫并不需要与胶密封该实验涉及短的采集。 - 使用10X物镜和相衬照明来测量幼虫的长度，如果使用一个高分辨率照相机。增加光的强度，以便能够在几毫秒内捕获图像，从而获得幼虫（ 图2D）的清晰图象。
注意：当通过琼脂糖垫减少幼虫的游泳象垃圾一样清除，他们仍然感动。因此，快速记录是必不可少的，以获得一个清晰的图像。 - 打开斐济的ImageJ并重复步骤1.3.1。为了测量幼虫的长度，选择分割行工具。绘制从头部向上的尖 端到尾尖幼虫（ 图2D，右图）的中线以下一个分段线。
- 使用菜单分析/测量，获得的长度对应于微米幼虫的长度划线。
- 离心机被捕L1幼虫在3500 xg离心在室温3分钟，去除上清。悬浮幼虫在100μl的M9缓冲液中，并将它们传送到使用巴斯德吸管琼脂糖垫（琼脂糖焊盘应准备-d作为在1.1.2节描述1.1.8）。广场上的垫盖玻片。
3.后伸长缺陷表征采用流式细胞仪
- 幼虫同步
- 净化用碱性次氯酸钠处理的胚胎作为从衣食无忧的年轻人整整100 MM平板2.1节所述并根据应变胚胎孵化和L1逮捕M9的缓冲区16至24小时，在20或25.5℃，让进行分析。
注：每应变以及馈成年人的一个满盘足以用于下面描述的分析。
- 净化用碱性次氯酸钠处理的胚胎作为从衣食无忧的年轻人整整100 MM平板2.1节所述并根据应变胚胎孵化和L1逮捕M9的缓冲区16至24小时，在20或25.5℃，让进行分析。
- 蠕虫分拣机标定
注：细胞仪这里所用的流是大颗粒流式细胞仪（以下简称为蜗杆分拣机）。该蠕虫分拣机包括一个670纳米的红色二极管激光器，它位于消光探测器前。蜗杆分拣机还包含用于荧光激发的多线的氩激光器。在STANDARD文书有三个光电倍增管来检测荧光发射在光谱的绿色，黄色和红色区域（光电倍增管）的荧光检测器。在这里所描述的协议中，飞行时间将被用于测量幼虫的大小，红色通道将被用于确定将与碘化丙锭（PI）染色死虫。 GP（通用）高的荧光控制颗粒，用于校准仪器，并在我们的实验中的内部控制，绿色，黄色和红色显示高荧光。它们将与在绿色通道检测高发射分析的样品中的唯一目的和基于该特征也将随之被识别。
注：活的动物是基于在绿色和红色信道，以及对与TOF没有荧光的标识。从幼虫的肠自体荧光发射不在L1阶段检测到。- 切换激光块，计算机，压缩机的上d是蠕虫分拣机的仪器。按下开蠕虫分拣机软件的START按钮，在仪器的使用说明书指示。
- 观察氩激光控制弹出窗口。选择运行模式，等待的激光功率达到10±1毫瓦。选择完成激光控制窗口。
- 设置护套和样品压力分别5.10±0.02和5.51±0.01。允许压力平衡至少15分钟，然后按一下压力确定复选框。
注：流速取决于护套和样品的压力。 - 确保消除存在于所述样品杯与所述分析室之间的流路管的所有气泡。要做到这一点，请点击ACQUIRE，直到无气泡被收购（如采集窗口看到的）轻轻一抖小管。
- 荧光和TOF测量和检测如下所有参数的设置：
- 设置TOF，分机，绿色，黄色和红色的鳞表1。设置PMT控制在700为绿色和黄色，并以900为红色描述256集增益。
注意：两个激发滤光片是可用的（488纳米和514纳米），可以被用于激励或绿色荧光蛋白（GFP）或黄色荧光蛋白（YFP），或在这些波长与多行氩激光激发的任何荧光染料。适当的过滤器需要在该设备的过滤室被插入。我们使用了488nm的过滤器用于以下实验。
- 设置TOF，分机，绿色，黄色和红色的鳞表1。设置PMT控制在700为绿色和黄色，并以900为红色描述256集增益。
- 要校准蠕虫分类器，选择工具菜单中的“运行控制粒子”。把20毫升1X GP（通用）高的荧光颗粒控制在杯（这些颗粒尺寸精确的荧光颗粒，由厂家仪出售给校准他们的文书）。
- 点击ACQUIRE按钮开始鞘和样品流。
注：期望与21±6和交流的控制颗粒分布的平均围绕平均值（CV）≤11变异oefficient。如果CV值> 11，平均为> 27尝试通过点击清洁按钮几次或通过轻弹的流路来清洁管。
- 动物TOF收购
注意：当一个对象在所述激光源和消光检测器之间的流动单元通过光散射。花费的光的时间，以通过用于测量物体的轴向长度的飞行物体（飞行时间，TOF）被散射。由对象（消光，EXT）掩蔽光的程度被用作其不透明度/光密度的量度。- 放置10微升同步的野生型（WT）中的L1表玻璃，并估计使用解剖显微镜死卵的百分比。
注：同步的L1 重量显示高EMB（高于20％）不应该被用于进一步的分析。 - 转让从离心同步L1（一pproximately 700微升含有L1的M9）到15毫升锥形管中。以10微克/毫升（稀释从1毫克/毫升储液1/100）的终浓度添加碘化丙啶（PI）和孵育在室温下30分钟。
注：死卵和幼虫会使用PI进行染色并检测为使用红色通道高荧光对象。 - 加入10 mL M9缓冲液稀释染色的人群。取5毫升稀释种群并通过加入15ml的M9稀释它们四次。把这个稀释样品杯中。
- 通过运行ACQUIRE点击样品流并观察流速。
注：为了有精确的测量，流速应保持对象15至25 /秒。 - 如果需要的话，调整动物的量在杯以达到所需的流速。
注：该流率将取决于在3.2.3和幼虫我的浓度表明是恒定的压力（鞘和样品）n个杯子。如果流速高于25对象/秒在杯中加一些缓冲。如果它低于15的对象/秒加浓L1（从步骤3.3.3）在杯中。 - 一旦达到目标的适当的浓度，评估在杯的体积，并添加该卷在高荧光的GP控制颗粒4倍溶液的1/4 次 。
- 调整门和排序参数。要做到这一点，点击“门控”菜单，选择“TOF与'和“绿色”。点击菜单中的“排序”，然后选择“TOF与”和“红色”。然后选通和排序的图形将出现如图3A中 。
注意：这将允许控制粒子（在绿色和红色的排放）的可视化，通过PI和泡沫染色死动物（发射红色，而不是绿色）和活体动物（既不环保，也不红色通道零排放）（ 图3A ）。 - 通过点击ACQ运行实验UIRE。
注：要确定幼虫之间的小尺寸上的差异，分析大约10,000个对象，所以约8000动物。停止试验，并通过点击STORE将数据导出为.txt格式。
- 放置10微升同步的野生型（WT）中的L1表玻璃，并估计使用解剖显微镜死卵的百分比。
- 生活的动物的种群同步的相对大小的测量
- 使用能够管理大型数据表软件中打开.txt文件。
- 从分析的对象提取物，在绿色通道的特点是发射超过100任意单位较高的控制颗粒相关的TOF值（此值取决于第3.2.5节设置的参数）。创建一个新的列，并把它称作'控制粒子的。创建一个包含名为除外“样本”控制颗粒的所有其他对象的列。注：新粒子一批需要荧光发射在启动收购前进行验证。这将设置门槛荧光使鉴定在L1S控制颗粒。
- 对于每个分析应变能辨认出流量已被改变（由于鸡蛋例如插头的存在下）的实验的一部分。要做到这一点：
- 积“控制颗粒”的飞行时间为每个样品作为时间的因素（ 图3B）。
- 通过绘制趋势线工具线性趋势线，并在图表上显示的公式。
注意：控制颗粒的飞行时间应随时间常数（水平线， 图3B）。考虑到对数据y = AX + B绘出的线性趋势线方程，确保了'A'值较低的10 -4。显示在控制粒子的取向断裂时间段内进行的所有测量应该从分析中除去。
- 去除死的胚胎和气泡（发射15高于在红色），以及小的碎片和大蛋塞（TOF低于10和高呃比70分别）从“样本”的测量。
- 积分析每一株“控制粒子的分布。 如图3C看到这些分布应该覆盖几乎完美。这保证了对不同菌株得到TOF测量可比拟。注：样品元件的正常化TOF过控制颗粒可以，如果控制颗粒的样品中的分布不与对照样品的重叠使用。作为后面标准化TOF计算：
- TOF正常化基因型G =（对于G样品TOF）/（平均“控制粒子”对于G TOF）×（平均“控制粒子”TOF的重量 ），其中重量是对照样品。
- 绘制每一株，包括对照样品幼虫TOF分布，在我们的例子重量的动物（ 图3D）。测量的平均值和平均值（SEM）的标准误差为每个群体（
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Representative Results
平视，Tail-和头部/尾部宽比是稳健的指标。
这里所描述的协议已被成功地用于表征调节和Rho GTP酶PIX-1的效应的功能，PAK-1和早期伸长7期间让-502。PIX-1和分别PAK-1的代码为鸟嘌呤交换因子（GEF）和具体的外消旋/ Cdc42的GTP酶和let-502代码为RHO-1 7效应的效应。在这项研究中，PIX-1和PAK-1被示出初期伸长7期间控制表皮形态。本研究采用的头部和尾部宽度测量作为指标表现出的第一次，位于前教统局的皮下细胞坂遵循比位于其后方7种不同形态的程序。建立这些指标的再现性和稳健性，头宽度在1.2倍阶段独立地测量12野生型（wt）胚胎五次。这表明一组测量值;测量五个不同群体之间的差异进行比较然后用棕福赛斯测试（使用R统计包）揭示了测量之间没有显著差异（ 图4A F-检验p值> 0.5）评估胚胎是可重复的。与这些测量有关的再现性和批次影响的评估是通过重量胚胎的头部宽度的测量在1.2倍阶段从在三个不同的日子（12胚胎）完成4D-DIC成像完成。在这些三个测量组中，方差是不显著不同，并且没有发现显著批次影响冲击头-WIDþ测量结果（F-检验p -值> 0.5; 图4B）。
（数据未显示）相似的结果为尾宽度测量和早期伸长的不同阶段进行测量得到的。这些数据建立的头宽，尾宽，头/尾宽比为稳健的指标来表征初伸长的缺陷。
测量头部和尾部宽度以及胚胎长度允许对基因控制沿胚胎前-后轴伸长初期的表征。
胚的长度，以及他们的头部和尾部的宽度的测定是在携带野生型和突变的胚胎进行空或热敏强损失的功能等位基因的基因控制早期伸长：PIX-1（gk416）;PAK-1（ok448）和let-502（sb118ts）7。我们测得的头部/尾部（H / T）在开始重量和突变胚胎的宽度比（1.2倍的阶段），并在在非允许温度初期伸长的端部（ 图4C左和右分别面板）。而在早期的伸长的开头没有变化-或减小H /在PIX-1处观测到T比值，PAK-1和相比重量动物（1.2倍的阶段， 图2C中 ，左侧面板时让-502突变体），早期延伸的终端所有三个突变表现出更高的显著H / T比大于胚重量 （t检验p -值<0.006; 图4C;右图）。这表明，PIX-1，PAK-1和let-502突变胚胎早期延伸的终端显示异常前-后的形态。进一步分析比较，头宽，尾宽betweeÑ1.2倍阶段和早期伸长的使用相同的测量参数结束时，发现该头宽度在PIX-1下降较少，PAK-1和let-502的突变体而尾部宽度减少松懈502突变体显著少只有7。这表明， 让-502控制形态发生过程类似地沿胚胎的前-后轴线，而主要发生在胚胎7的前部PIX-1和PAK-1控制形态发生的过程。在结束对早期伸长（ 图4D）的开始胚胎之间的长度差也被测量。我们发现，早期伸长PIX-1显著降低，PAK-1和let-502突变体相比，当以重量暗示前形态的PIX-1和PAK-1突变体的改变单独足以显著减少elongatio胚胎的n个。
方案2和3被用来评估在重量和突变背景被捕幼虫的长度。 （;未发表的数据协议3）这些幼虫的长度同时使用图像分析（协议2）7和流式细胞术评估。使用在微米动物长度的绝对测量的图像分析结果在一个强大的和高度可再现的方式（ 图5A）幼虫长度的测量。该分析显示，相对于重量 （ 图5A）时同步突变幼虫显示显著减小的长度7。使用流式细胞基于协议（协议3）这些幼虫的测定，得到类似的结果（ 图5B）。然而，应该指出的是，使用后一种方法测得的大量幼虫显著增加的基因型比较（ 叔统计鲁棒性-检验p -值<10 -24）。基于这些发现，在流式细胞做法可能在图像分析一个更好的选择，以表征突变的动物显示非常微妙的伸长率的缺陷。
图1.琼脂糖垫的研制。放置的胶带; B两层覆盖两个隔离滑梯之间，显微镜载玻片，琼脂糖垫覆盖着由两个间隔滑梯支持的另一张幻灯片，C，用切割后的最终形状和琼脂糖垫的大小刀片以适应盖玻片。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2.早期和晚期伸长缺陷测量 A - B，以逗号阶段（A）胚胎的长度和早期伸长率（B）结束测试。红线，用于测量胚胎用在胚测量ImageJ的C，头部和尾部宽度的分割行工具在1.2倍阶段（左）和在早期的伸长率（右）的末端绘制。箭头代表被测区域的本地化（马丁等人修改。，2014）。比例尺：20微米D，幼虫长为同步L1幼虫测量。右侧面板是所捕获的图像（左）的放大图。红线被使用ImageJ的分割行工具绘制。它被用来测量幼虫的长度。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3.同步幼虫的长度的测定使用流式细胞A，门控和展示绿色和控制颗粒的排放红色COPAS Biosort排序窗口，气泡，死者和活着的动物相对于他们的时间飞行（TOF ）; B，在为一个代表性实验不同的时间点的控制颗粒的飞行时间。 TOF对时间的线性函数的斜率是约10 -5，说明控制颗粒的飞行时间是恒定的时间在整个实验C，的表示为分布的极大值的百分比控制粒子的Tofs分布。非标准化和规范化控制粒子分布代表了PAK-1（ok448）。其他发行不归，D，居住TOFS分布动物表示为分布的极大值的百分比。 TOFS不归的控制颗粒，除了PAK-1（ok448）所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. PIX-1，百-1 和 Let-502 突变体早期存在缺陷伸长率。 A - B，头部的重现性和稳健性评估宽度测量A，在1.2倍阶段（N = 12胚胎）头部宽度重量胚胎的五个独立的测量。平均值和标准偏差（误差棒）表示。测量之间无显著（NS）的差异，采用Brown-科西测试计算（我们ING R统计包）（F检验P值 > 0.5）。B，头宽测量重量的胚胎在三个不同天（N = 12胚胎）。均值和标准差分别表示为好;有遍布测量差异无显著差异（NS;棕福赛斯F检验p值> 0.5）℃，1.2倍阶段（左图），在年初结束的头部/尾部宽度的比例分布。在重量伸长率（右面板），PIX-1（gk416），PAK-1（ok448）中并在23 让-502（sb118ts）突变体- 24℃。之间注意，用于该研究让-502ts胚胎母亲在25.5℃。D，在重量的伸长率，PIX-1（gk416），PAK-1（ok448）的分布中生长和let-502（sb118ts）突变体逗号阶段和晚期伸长的开始。盒曲线表示最小值，最大值，25 日 ，50 日 （中位数）和75人口的百分次。 * t检验p -值<0.05，** t检验p -值<0.006（马丁等人修改。，2014）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. PIX-1（gk416），百-1（ok448） 和L ET-502（sb118ts） 幼虫现有长度的缺陷。 A，在重量测量幼虫长，PIX-1（gk416），PAK-1（ok448）和let-502（sb118ts）动物使用图像分析（协议2）B，使用流式细胞仪测量的相对幼虫长（实测协议3）。括号中的数字对应于用于第动物的数量Ë测量。长度和平均值的标准误差的平均值（SEM;误差棒）被表示。学生t检验p值来表示（P）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本协议描述的新的指标来表征早期胚胎和伸长率的后期阶段。
在部分1中，关键的步骤是细菌在垫中可能存在。将胚气密封闭垫和图像采集期间盖玻片之间。密封滑动时需要避免采集，持续两个多小时期间动物的干燥。据我们所知，没有用于安装滑动和盖玻片之间琼脂糖垫密封剂是透气的。因此，当大量的细菌（或胚胎）的存在于垫，它们可以在几个小时导致其过早死亡后缺氧。具有三重胚胎 - 对应于3倍的长度相比，非细长的胚胎的胚胎 - 与感兴趣的胚胎一起记录将是潜在的缺氧条件下的良好指标，因为这些胚胎将停止移动在兵卫ř蛋壳在不存在氧气。任何形态的测量应该在缺氧条件或死胚进行。
使用时间推移成像时的另一个关键步骤是在其中胚的发育发生温度。热敏突变体目前正在使用C.线虫 。温度转变的生物作用可以是直接或取决于该蛋白的半衰期和其携带突变的性质延迟。因此，在该胚胎暴露温度应随时间恒定的，应当由显微镜室或一个加热 - 冷却室显微镜舞台上的适当通风来控制。
第2部分是依赖于使用碱性次氯酸钠处理幼虫同步。在某些情况下，这种处理可能会导致胚胎致死性（EMB）。 EMB在重量人口的20％以上表明氯酸盐治疗期间升高的毒性换货可能形态产生负面影响。在重量背景上显示高EMB同步L1不应该被用于进一步的分析。此限制也适用于协议3。
我们不建议使用麻醉药品来固定幼虫。左旋咪唑，特别是固定不变通过肌肉抽搐诱导趋于萎缩幼虫引入实验偏见线虫。如果曝光时间是不作为显微镜的限制的结果不够快，我们建议通过增加在垫琼脂糖的浓度和减少的垫和盖玻片之间的液体量减少幼虫的蠕动。护理应采取然而，不要变干幼虫，因为脱水会降低它们的大小。
在第3，幼虫的长度的测量中使用的分析的样品之间的流速的比较。这样做，控制颗粒的分布需要COMPA红。如果完全覆盖的分布，所述的TOF（时间飞行），用于相应的样品获得值进行比较，如果没有，需要进行归一化这些值。过控制颗粒-TOF样品-TOF的正常化（如在3.4.5.1详述）已被成功地用作所示PAK-1（ok448）（ 图3C和图5B）。 VS 重量 PAK-1（ok448）的相对长度被认为是在具有或不具有正常化的至少3个独立的实验相似的（数据未显示）。但是，我们建议，在确认与没有它获得的正常化所取得的成果，具有体积小的差异比较幼虫时尤其如此。应当指出，使用流式细胞仪幼虫长度的测量提供相对于对照样品的长度，在这种情况下， 重量幼虫而非微米的绝对长度作为用于图像分析。这意味着，从独立的实验的测量不能，除非在重量计算大小比例组合。
在样品杯用于稀释的缓冲液将具有对流量速率的影响。我们观察到，通过在制造商推荐的鞘缓冲液含有洗涤剂，增加采集过程中产生的气泡的量。使用的M9缓冲液，不含有洗涤剂，显著减少气泡的形成，但是在避免分拣机，这会影响样品的流速的小管蛋的堵塞效率较低。蛋堵塞是采集通过控制颗粒的可观察的TOF的几秒钟，随后通过升高的TOF-也几秒钟的显着降低中容易地检测到。蛋堵塞也可能导致信道的阻塞和粒子流（每秒小于5的对象）的完整骤停。如果发生这种情况，直到恢复流量点击CLEAN按钮。这些事件中发生的任何测量也应该被排除在数据分析。护套缓冲可能会建议涉及的菌株特征的死卵率很高的实验。
样品和鞘压力（设定在步骤3.2.3），可能会随着时间的推移（略）改变，应以确保非常恒定流速手动调整整个实验。分析结果随着时间的推移（ 图3C）密谋控制颗粒的TOFS时减少或低速率的增加将观察到的。流速的降低将导致在一段时间内粒子的平均的Tofs的增加，而流率的增加，将导致在相反的。流量的变化会负面检测幼虫群体之间的小尺寸的差异的方法的灵敏度产生影响。
方法，目的是查明基因控制的伸长和需要时间推移显微镜记录一般都很高LY费时和乏味表型分型几个基因型时。基于流式细胞仪的方法，同时要求并不适用于所有的实验室设备，是耗时少，并当几株需要被表征因此更有效。这种方法也比较统计健壮相比，使用图像分析测量（比较突变体和野生型TOF分布通过学生的t-检验进行评估; 图5A和B）。然后，该方法可以是高度适于表达与低表达力/外显伸长缺陷菌株。
使用流式细胞仪的几种方法已被开发，在过去测量线虫9-12的健身。这些方法使用在96孔板和蜗杆分拣机'的反射模块分配动物。的反射模块使内96-孔板分配线虫种群直接分析。因此，这些方法都能够characte泽数百每天条件和构成，其中，测量一个非同步人口的健身一个健壮的方式。它们然而，不能很好地适合于识别同步的L1之间的小尺寸的差异。的L1幼虫之间的微小差异测量需要在大量的动物，这是与使用的96孔板和反射模块可有效地以每孔最表征100个对象的不相容的测量。这里所描述的方法被设计用于此目的的吞吐量，这是显著降低为代价的。它使得一旦仪器校准的每小时3至4个条件的表征，这是通过在方案2利用图像分析的显着改进。
的头部和尾部宽度比的测量是被开发来表征沿胚胎7的前-后轴上出现不均匀的进程形态的第一个方法。什么时候施加到显示控制初期伸长的基因，这些方法将澄清的信号通路控制在该阶段的形态的空间分布。使用任一图像分析或流式细胞术结合胚的长度的测定在初期伸长的端部流动被捕幼虫的长度的测量将使基因控制早期或晚期伸长或两者以高灵敏度和高精度的识别。这些程序可接着显著到信号通路控制在C胚胎伸长的空间和时间调节的未来理解有助于线虫 。此外，这些方法也可以适用于研究信号通路控制体长度如胰岛素和TGF-β途径13，14及慢性暴露于环境污染物15,16。这些测量可以在不同的幼虫期或成人全光照进行在L1协议2和3，测量尺寸差异的g小调变化与蠕虫分拣机大于对象，如L3，L4幼虫或成虫更具挑战性。协议3然后可以容易地适用于做这些测量。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
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