Introduction
I nesten 50 år har nematode Caenorhabditis elegans etablert seg som en kraftig modell for å studere viktige spørsmål innen utvikling, nevrobiologi, evolusjon, host-patogen interaksjoner, etc. en Styrken av denne modellen i studiet av utvikling ligger i: sin korte levetid 3 dager; den enkle som disse dyrene kan være genetisk endret; sin åpenhet som gjør det mulig observasjon av cellen forskyvning og morfologi i levende dyr og sin utvikling som er mest livmoren. Utviklingsstadier av nematode involvere embryogenese og fire larvestadier (L1 til L4), etterfulgt av voksenlivet. Under embryonal utvikling, epidermal morphogenesis trakk mye oppmerksomhet for sin evne til å muliggjøre en bedre forståelse av hvordan epitelceller migrere som en gruppe, hvor de reorganisere sine veikryss og endre deres individuelle morfologi samt deres relative posisjonering innenfor en funksjonell epitel.Epidermal morfogenese er delt inn i fire faser: dorsal innskyting består i omorganisering av dorsal epidermale celler, referert til som hypodermis; ventral kabinett, som består i migrasjon av ventral hypodermal celler mot ventrale midtlinjen og dermed encasing embryo i en epitelial celle monolag; tidlig og sent forlengelse trans bønne-formet embryo i vermiform larver. Etter morphogenesis, embryo luke og L1 larver startfôring ved hjelp av tilgjengelige bakterier i nærmiljøet.
Embryonale forlengelse er derfor en sen fase av embryoutvikling. Den består av en forlengelse av embryoet langs sin lengdeakse og en reduksjon av dets tverr diameter. Dette innebærer en dramatisk endring av formen på hypodermal cellene. Forlengelse er delt i en tidlig og sen fase. Den tidlige fasen starter ved komma scenen og slutter når kroppen veggen muskler begynner kontrahering på 1,75 ganger stadium i wILS-(vekt) embryoer - tilsvarende embryoer som er 1,75 ganger i lengde sammenlignet med ikke-langstrakt embryoer. Morphogenic prosesser som skjer på det stadiet er hovedsakelig drevet av sammentrekning av trådformede aktin bunter (FBS) ligger på den apikale polen hypodermal celler som driver sin forlengelse langs Antero-posterior aksen av embryoet to. Sammentrekning av fremmedlegemer er kontroll ved fosforylering av myosin-lys kjeder av tre kinaser LET-502 / rock, MRCK-en og PAK-en fem. Den sen fase av forlengelse, starter når kroppen-vegg musklene blir funksjonell og starte entreprenørselskap. Det innebærer mechanotransduction signalering fra kroppen veggen muskler til dorsal og ventral hypodermal celler og slutter når dyrene klekkes tre.
Forlengelse defekter er generelt preget av prosentandelen av dyr som dør som embryoer (Embryonic dødelighet, Emb) og de arrestere deres utvikling som L1 larver (Larve arrest fenotype; Lva) og er vesentlig kortere enn vekt. Identifikasjon av scenen av utviklings arrest krever mikroskopisk observasjon av døde fostre og arresterte Larver 3-6.
Det ble nylig vist at flere gener, slik som Cdc42 / Rac regulator og effektor pix-1 og pak-1, kontrollerer morphogenic prosesser under både tidlig og sen forlengelse 3,7. Vi har også nylig viste at morphogenic prosesser forskjellig langs Antero-posterior aksen av embryoene under tidlig forlengelse 3 7. Disse funnene motivert utvikling av nye beregninger spesifikt rettet mot tidlig eller sent forlengelsesfasen og andre beregninger som muliggjør karakterisering av morfologi av befruktede egg langs deres Antero-posterior aksen under tidlig forlengelse.
Disse nye metoder består i å måle lengden av embryoer ved begynnelsen og ved slutten av tidlig forlengelse, så vel som bredden av deres hanannonser og haler. 7 To protokoller ble også utviklet for å måle lengden på nyklekte larver, synkronisert på L1 scenen 7.
De eggeskall av embryoene beskytte dem mot alkalisk hypokloritt-behandling, mens larver, voksne og bakterier som er tilstede i kulturmediet oppløses ved behandlingen. Denne behandlingen blir så brukt til å rense embryoer fra en ikke-synkronisert populasjon inneholdende et flertall av brønn-matet voksne 8. Mat begrensning brukes til å synkron nyklekkede larver. Måle lengden av disse larver blir så brukt for å detektere forlengelses defekter. Denne målingen er foretrukket fremfor måling av arrestert larver på kulturplater fordi larver som klekkes fra ikke-fullt langstrakte embryo kan komme til "normal lengde" når det mates inn, men vil opprettholde deres reduserte størrelse når arrestert i fravær av mat.
Her presenterer vi detaljerte protokoller som muliggjør måling av length til en forlengelse embryoer samt bredden på hodet og halen som bruker time-lapse DIC mikroskopi og bildeanalyse (protokoll 1). Vi gir også detaljerte protokoller for å måle lengden på synkronisert larver å bruke bildeanalyse (protokoll 2) og Flow-Cytometry (protokoll 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karakterisering av Tidlige Forlengelse Defekter i WT og muterte dyr
- Monterings embryoer for Normarski DIC mikroskopi
- Forbered følgende kultur media og materiale:
- M9 buffer, oppløse 12,8 g / l Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / l KH 2PO 4, 5 g / l NaCl, 0,25 g / l MgSO4 • 7 H 2 O i destillert vann og autoklav for å sterilisere.
- NGM plater, oppløse 3 g / l NaCl, 16 g / l agar, 2,5 g / l Bactopeptone i DDH 2 O. Autoklav og tilsett 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 1 mM fosfatbuffer og 5 ug / ml kolesterol. Hell 6 ml NGM per 60 mm retter. Tillate mediet å stivne i 24 timer ved romtemperatur. Tilsett noen dråper av en mettet kultur av E. coli OP50 bakterier dyrket i Luria kjøttkraft (LB). La bakteriene vokse i 48 timer og lagre platene ved 4 ° C.
- For å generere ormen pick, montere en 0,01 "diameter platinatråd på en kort Pasteur pipette. Fest platinatråd til utkanten av glasset pipette ved å varme denne ekstremitet med et benzen-brenner. Flat enden av ledningen til å generere en slags spade.
- Grow ormen belastning på 60 mm NGM plater med OP50 ved 20 ° C.
MERK: termo alleler kan kreve å vokse dyrene på ikke-ettergivende temperaturer på opp til 25,5 ° C. Plater bør inneholde mange unge voksne og fortsatt rikelig med mat for å forfølge protokollene. - Plasser et objektglass mellom to avstands lysbilder dekket av to lag med maskeringstape (figur 1A).
- Fremstille en 3% agarose-løsning (vekt / volum) i M9 buffer ved å oppløse 0,6 g agarose-pulver i 20 ml M9 buffer ved oppvarming i mikrobølgeovn i løpet av 30 sek. La løsningen avkjøles i 5 min.
MERK: agarose løsningen kan brukes i noen dager etter smelting i en mikrobølgeovn. Denkan også alikvotert og lagret ved 4 ° C i flere uker. - Plassere en dråpe av varm 3% agarose løsning på glass-slide ligger mellom de to avstands-lysbilder. Unngå å danne bobler.
- Raskt dekke agarose med et annet lysbilde som vist i Figur 1B og press forsiktig. Den øverste sleiden flate agarose fallet og generere en pute med tykkelsen av to lag av maskeringstape.
- Tillat agarose for å stivne i minst 1 min ved romtemperatur eller til embryoene er klar til å bli overført til puten.
- Ved hjelp av en orm plukke, overføre 20 til 30 godt matet unge voksne fra NGM-plate inn i en mikro-sentrifugerør inneholder 400 mL M9 buffer.
- Tillat ormer for å sedimentere av tyngdekraften i ca. 5 minutter og fjerne supernatanten ved hjelp av en mikropipette. Dette trinnet har som mål å fjerne det maksimale av bakterier plukket med nematoder.
- Tilsett 200 ul av M9 buffer til hvert rør.
- Ved hjelp av en Pasteur pipEtte, overføre innholdet av røret (buffer og nematoder) til et urglass.
- Bruk en eller to 25G 5/8 "nåler til å skjære dyrene ved seksjon midten av kroppen (mellom spermatheca og vulva).
MERK: Et skalpellblad kan også brukes som et alternativ til nål (er). Gjør dette på svømming nematoder og kan kreve litt øvelse. Ideen er å bruke nåler som saks eller som en kniv avhengig av hvor mange nåler blir brukt. Når dyrene blir kuttet åpen, hermaphrodites slippe sine embryoer inn i bufferen. - Konsentrer embryoer ved midten av urglass ved generering av en sirkulær hvirvel i væsken.
- Fjern det meste av M9 fra klokken glasset ved hjelp av en mikropipette. La ca 30 mL av M9 med embryoer.
- Fjern lysbildet dekker agarose puten (figur 1B) ved å skyve den av puten.
- Skjær puten med et barberblad for å være i stand til å fullstendig dekke det med et dekkglass (Figur 1C).
- Ved hjelp av en Pasteur pipette overføre alle embryoene (og orm rusk) på agarose puten.
- Gruppe embryoene i sentrum av puten ved hjelp av en øyen limt på enden av en spiss som brukes for 200 mL mikropipetter.
- Sakte plassere en dekkglass på puten unngå bobledannelse og forsegle det.
MERK: Flere selfangere kan brukes. Vi bruker tegning tyggegummi funnet i kunst og håndverk butikker (vanligvis brukt som maskering tyggis for akvarellmaling). Denne gummi er brukt fordi den er hydrofil og stivner relativt rask, og er ikke giftig for ormer. Lysbilder kan også være forseglet med neglelakk eller VALAP (blanding laget av vaselin, Lanolin og Parafin voks). - La trekke tyggegummi tørke i ca 15 min.
- Forbered følgende kultur media og materiale:
- Opptak Tidlig Forlengelse ved hjelp av fire-dimensjonale Normarski DIC mikros
MERK: Målet med dette trinnet er å registrere tidlig forlengelse fra komma til begynnelsen av slutten forlengelse- Definert som øyeblikket da kroppen veggen muskler starte entreprenørselskap. Vi har også som mål å ta opp mer enn ett embryo på den tiden. Åtte timer med opptak er vanligvis nødvendig for å spille inn tidlig forlengelse for en gruppe av ikke-synkronisert embryoer.- Plasser montert sklie på scenen av et mikroskop. Pass på at mikroskopet er utstyrt med 10x og 60x mål samt DIC linser, prismer, kamera og fange programvare som gjør det mulig time-lapse mikroskopi og generasjon Z-stabler (automatisert Z-plattformen).
MERK: Kontroller at temperaturen er konstant mellom 20 og 23 ° C i mikros rommet. En varme- kjølekammer kan være nødvendig på mikroskopet trinnet, særlig ved bruk av varmesensitive mutanter. - Identifisere en gruppe av embryoer ved forhånds morphogenesis trinn med 10X objektiv.
- Når plassert, gli av 10X objektiv og legge en dråpe olje nedsenking på lysbildet.
- Ved hjelp av 60X objektiv, identifisere toppen og bunnen av embryos å sette opp de Z-stack bildeparametere.
MERK: Ikke nøl med å sette Z-stack større enn tykkelsen av embryoene. Still inn avstanden mellom to tilstøtende plan som 0,8 mikrometer. Dette vil gjøre det mulig å dekke det totale dybde av embryoene i 35 til 50 Z-planene.
MERK: Hvis mikroskop inneholder en automatisert xy-plattform, kan embryoer plassert på forskjellige steder av puten tas opp samtidig. For å gjøre dette, koordinater rekord xy av hvert sted på puten du ønsker å analysere i løpet av forsøket. Sørg for å velge xy når du setter opptaket parameter og følg resten av protokollen som angitt. Thin Z-seksjonering av embryo under opptak er ikke nødvendigvis nødvendig for målingene er beskrevet i denne protokollen. Opptak embryoutvikling av WT og mutante dyr med den maksimale oppløsningen er imidlertid en god praksis for å bygge opp et bibliotek av opptak i stand til å støtte flere analyser. - Settopp time-lapse med 2 minutters mellomrom mellom to oppkjøp som varer 8 timer.
MERK: Eksponeringstiden vil være avhengig av den lysintensitet som er angitt for mikroskop. Celle bevegelse under tidlig forlengelse er svært treg; eksponeringstids kan være omtrent ett bilde per sekund eller mindre. Hvis embryoene er på tidlige morphogenesis stadier (dorsal interkaleringsforbindelser, ventral kabinett), ville tidlig forlengelse tas opp innen 1 time. Sørg for at lys lukkeren er lukket mellom hvert kjøp. - Kjør kjøp og lagre det.
- Plasser montert sklie på scenen av et mikroskop. Pass på at mikroskopet er utstyrt med 10x og 60x mål samt DIC linser, prismer, kamera og fange programvare som gjør det mulig time-lapse mikroskopi og generasjon Z-stabler (automatisert Z-plattformen).
- Måling av Tidlige Forlengelse Defekter ved hjelp av bildeanalyse
- Åpen Fiji-ImageJ programvare ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- I menyen velger Analyser / Set Målinger, velg Perimeter. For hvert embryo, justere Z-målestokken for å fokusere på svelget av embryoet, som vist i figur 2A. Dette vil sikre at du fokuserer på midten av embryo. For å måle lengden på fosteret, justere tidsskalaen bar å ha embryo av interesse ved starten av den tidlige forlengelse (komma scenen, figur 2A). Merk tiden ( "Time-begynnelse").
- Velg segmenterte linjen verktøyet. Tegn en segmentert linje fra spissen av munningen av embryoet opp til spissen av halen etter midtlinjen av embryoet (figur 2A). Bruke fanemenyen Analyser / Mål, få lengden av den tegnede linjen ( "Varighet begynnelsen").
- Gjenta denne målingen for samme embryo på slutten av tidlig forlengelse (øyeblikket når musklene begynner entreprenør). Legg merke til den tid ( "Time-end") og måle lengden av embryoet ( "Lengde-end") som beskrevet ovenfor (figur 2B).
- Beregn varighet (D) av tidlig forlengelse og lengden øker (L) i løpet av denne fasen som følger:
D = "Time-end" - "Time-begynnelse"
& #160; L = "Lengde-end" - "Length-begynnelse" - For å måle hodet bredde, må du justere tidsskalaen bar å ha et embryo på scenen av interesse (1,2 ganger stadium eller slutten av tidlig forlengelse). Velg den lineære verktøyet. Tegn tverrgående (dorso-ventrale aksen) midtlinje av hodet. Denne delen er den tykkeste delen av embryoet (Figur 2C). Bruke menyen Analyze / Mål, få lengden på linjen som tilsvarer hodet bredde.
- På det samme tidspunkt, gjenta dette trinnet ved å tegne den tverrgående midtlinjen av halen (Mid-linje mellom tarm ventilen og halespissen, figur 2C) og måle det for å oppnå halen bredde.
MERK: Bruk denne målingen å sammenligne embryoer på samme scene på tvers av ulike fenotyper. For å sikre reproduserbarhet av denne målingen, sørg for å finne et sted som ligger rundt midtlinjen av halen på dyret som lett kan gjenkjennes fra ett dyr til etnother. - For å beregne hode til hale bredde-forhold, dele hodet bredde med halen bredde.
2. Karakterisering av Late Forlengelse Defekter Bruke bildeanalyse
- Synkronisering av L1 larver med alkaliske Hypochlorite Treatment
- Fra en ikke-sultet 60 mm plate inneholdende mange gravid voksne, samle alle ormer i et mikro-sentrifugerør ved vasking av nematoder av platen med 1 ml av M9 buffer ved anvendelse av en Pasteur pipette.
- Sediment nematoder på 3500 xg i 3 min ved romtemperatur og fjerne supernatanten ved hjelp av en mikropipette uten å forstyrre ormen pellet.
- Tilsett 1 ml hypoklorittoppløsning til hvert rør (0,4 M hypokloritt, 0,5 M NaOH) og ryste i 3 minutter.
MERK: Alkaline hypokloritt oppløsning skal tilberedes og embryoer i denne løsningen bør ristes forsiktig men kontinuerlig med å optimalisere oppløsningen av de voksne og oksygenering av embryos. Etter 3 min uro, bør de fleste voksne slipper eggene sine i løsningen. - Rotere ved 3500 x g i 3 minutter ved rom-temperatur og raskt fjerne supernatanten ved hjelp av en mikropipette uten å forstyrre pelleten.
- Vask fire ganger med 1 ml av M9 buffer etterfulgt av sentrifugering ved 3500 x g i 3 min.
- Etter den fjerde vask, fjern supernatanten og resuspender egg i 700 mL M9 buffer uten pipettering opp eggene (som egg vil holde fast på plast av spissen).
- Tape røret på en 3 mm orbital shaker plassert i en inkubator ved passende veksttemperatur og ristes ved 600 rpm over natten.
- Lengde Måling av Synkronisert Larver
- Sentrifuger arrestert L1 larver ved 3500 x g i 3 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Resuspender larver i 100 pl M9 buffer og overføre dem til en agarose-pute ved hjelp av en Pasteur-pipette (agarose elektrodene bør forbereded som beskrevet i avsnitt 1.1.2 til 1.1.8). Plasser et dekkglass på puten.
MERK: Puten trenger ikke å være forseglet med tyggis for dette eksperimentet som innebærer kort oppkjøpet. - Bruke et 10X objektiv og fasekontrastbelysning for å måle lengden av larvene hvis et kamera med høy oppløsning anvendes. Øke intensiteten av lyset for å være i stand til å ta bilder innenfor noen få millisekunder og dermed få et klart bilde av larvene (figur 2D).
MERK: Mens svømme ødelegger av larver er redusert med agarose puten, er de fortsatt i bevegelse. Derfor er hurtig opptak viktig å få et klart bilde. - Åpne Fiji-ImageJ og gjentar trinn 1.3.1. For å måle lengden på larver, velger segmenterte linjen verktøyet. Tegn en segmentert linje fra spissen av hodet opp til spissen av halen etter midtlinjen av larvene (figur 2D, høyre panel).
- Bruke menyen Analyze / Mål, få lengden påtrukket linje svarende til lengden av larvene i mikrometer.
- Sentrifuger arrestert L1 larver ved 3500 x g i 3 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten. Resuspender larver i 100 pl M9 buffer og overføre dem til en agarose-pute ved hjelp av en Pasteur-pipette (agarose elektrodene bør forbereded som beskrevet i avsnitt 1.1.2 til 1.1.8). Plasser et dekkglass på puten.
3. Karakterisering av Late Forlengelse Defekter ved hjelp av flowcytometri
- synkron~~POS=TRUNC Larver
- Rens embryoer ved hjelp av alkalisk hypokloritt behandling som beskrevet i kapittel 2.1 fra full 100 mm plater av velfødde unge voksne, og la fosteret luke og L1 arrest i M9 buffer for 16 til 24 timer ved 20 eller 25,5 ° C, avhengig av belastningen analysert.
MERK: En plate av godt matet voksne per belastning er tilstrekkelig for den analyse som er beskrevet nedenfor.
- Rens embryoer ved hjelp av alkalisk hypokloritt behandling som beskrevet i kapittel 2.1 fra full 100 mm plater av velfødde unge voksne, og la fosteret luke og L1 arrest i M9 buffer for 16 til 24 timer ved 20 eller 25,5 ° C, avhengig av belastningen analysert.
- Kalibrering av Worm Sortering
MERK: flowcytometer som brukes her er en stor partikkel flowcytometer (heretter referert til som den ormen sorter). Ormen sorter inneholder et 670 nm rød diode laser, som er plassert foran en detektor utryddelse. Ormen sorter inneholder også flere linjer argon laser for fluorescerende eksitasjon. de standard instrumentene har tre fotomultiplikatorrør (PMT) fluorescens detektorer brukes til å oppdage fluorescens utslipp i grønne, gule og røde områder av spekteret. I den protokoll som er beskrevet her, vil TOF bli brukt til å måle størrelsen på larvene, vil den røde kanal brukes til å identifisere døde ormer som vil bli farget med propidium jodid (PI). GP (General Purpose) High Fluorescence Kontroll Partikler som brukes til å kalibrere instrumentet og som en intern kontroll i vårt eksperiment viser høy fluorescens i grønt, gult og rødt. De vil være de eneste objekter i prøven analysert med høy utslipps detektert i den grønne kanalen og vil deretter bli identifisert basert på denne egenskap.
MERK: Living dyrene er identifisert basert på fravær av fluorescens i grønn og rød kanal samt på TOF. Autofluorescent utslipp fra tarmen av larvene er ikke detekterbar ved L1 stadium.- Slå på laser blokk, datamaskinen kompressoren end ormen sorter instrument. Trykk på START-knappen på åpnet ormen sorter programvare som er angitt i bruksanvisningen for instrumentet.
- Observer argon laser kontroll pop-up vindu. Velg RUN-modus og venter laser krefter nå 10 ± 1 mW. Velg FERDIG på laser kontrollvinduet.
- Sett skjede og prøvetrykk til 5,10 ± 0,02 og 5,51 ± 0,01 kroner. La trykket likevekt i minst 15 minutter og klikk på TRYKK OK i boksen.
MERK: Strømningshastigheten avhenger av skjede og prøvetrykk. - Sørge for å eliminere alle bobler er tilstede i strømningskanalen mellom rørelementene prøvekoppen og analysekammeret. For å gjøre dette, klikker du erverve og knips forsiktig på tubuli inntil ingen boble er ervervet (som sett i oppkjøpet vindu).
- Oppsett av alle parametere for lysstoffrør og TOF måling og deteksjon som følger:
- Sett skalaer for TOF, Ext, grønn, gul og rød til256. Sett gevinst som beskrevet i Tabell 1. Set PMT Kontroll på 700 for grønn og gul og 900 for Red.
MERK: To eksitasjon filter er tilgjengelig (488 nm og 514 nm), og kan brukes til å eksitere enten grønt fluorescerende protein (GFP) eller gul fluorescerende protein (YFP) eller eventuelle fluorokromer som eksiteres ved disse bølgelengdene med flere linjer argonlaser. Passende filtre må settes inn i filterkammeret på utstyret. Vi brukte 488 nm filter for det følgende eksperiment.
- Sett skalaer for TOF, Ext, grønn, gul og rød til256. Sett gevinst som beskrevet i Tabell 1. Set PMT Kontroll på 700 for grønn og gul og 900 for Red.
- For å kalibrere ormen sorter, velg "Kjør kontroll partikler" i verktøymenyen. Sett 20 ml 1x GP (General Purpose) High Fluorescens Kontroll Partikler i cupen (disse partiklene er fluorescerende partikler av nøyaktig størrelse, solgt av cytometri produsenten for å kalibrere instrumentet).
- Klikk på ACQUIRE knappen for å begynne å kappe og prøvestrømmen.
MERK: Forvent et gjennomsnitt knyttet til kontroll partikkelfordeling på 21 ± 6 og acoefficient variasjon rundt som gjennomsnittlig (CV) ≤11. Dersom CV er> 11 og gjennomsnittet er> 27 forsøk å rengjøre tubuli ved å klikke flere ganger på det rene knappen eller ved å dra i strømningskanalen.
- Oppkjøp av Animal TOF
MERK: Lys sprer når et objekt passerer i strømningscellen mellom laserkilden og utryddelse detektoren. Den tid det tar for lyset å bli spredt ved den flygende objekt (flukttid, TOF) brukes til å måle den aksiale lengde av gjenstanden. Graden av lys maskert av objektet (utryddelse, EXT) anvendes som et mål på opasitet / optisk tetthet.- Plassere 10 pl synkronisert villtype (wt) L1 i et urglass og beregne prosentandelen av døde egg-ved hjelp av et disseksjonsmikroskop.
MERK: Synkronisert L1 viser høy Emb (høyere enn 20%) i vekt bør ikke brukes til videre analyse. - Transfer synkronisert L1 fra mikro (enpproximately 700 ul inneholdende M9 L1) til et 15 ml konisk rør. Legg propidiumjodid (PI) ved en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml (fortynning 1/100 th fra en 1 mg / ml stamløsning) og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: Døde egg og larver vil bli farget ved hjelp av PI og oppdaget som svært fluorescerende objekter ved hjelp av den røde kanalen. - Tilsett 10 ml M9 buffer for å fortynne farget populasjoner. Ta 5 ml av den fortynnede populasjoner og fortynne dem fire ganger ved å legge til 15 ml M9. Plasser denne fortynning i prøvekoppen.
- Kjør prøvestrømmen ved å klikke erverve og observere strømningshastigheten.
NB: For å få nøyaktig måling, skal strømningshastigheten være mellom 15 og 25 objekter / sek. - Om nødvendig, justere mengden av dyr i koppen for å nå ønsket strømningshastighet.
MERK: strømningshastighet vil avhenger av trykkene (mantel og prøve) som er konstante som angitt i 3.2.3 og av konsentrasjonen av larver in koppen. Hvis strømningshastigheten er høyere enn 25 gjenstander / sek legge til noen buffer i koppen. Hvis den er lavere enn 15 gjenstander / sek legge konsentrert L1 (fra trinn 3.3.3) i koppen. - Så snart den passende konsentrasjon av gjenstanden er nådd, evaluere volum i koppen og tilsett 1/4 th av dette volumet i høy Fluorescerende GP regulerende partikler 4x løsning.
- Juster gating og sortering parameter. For å gjøre dette, klikk "gating" på menyen og velg "TOF vs. ' og "grønne". Klikk på "Sortering" på menyen og velg "TOF vs. 'og' Red '. Gating og sortering grafikk vil da dukke opp som vist i figur 3A.
MERK: Dette vil tillate visualisering av kontroll partikler (emisjon i grønn og rød), døde dyr farget av PI og bobler (emisjon i Rød og ikke grønn) og levende dyr (ingen utslipp i verken grønne eller røde kanaler) (figur 3A ). - Kjør eksperimentet ved å klikke ACQUIRE.
MERK: For å identifisere små størrelsesforskjeller mellom larver, analysere rundt 10 000 gjenstander, så ca 8000 dyr. Stoppe eksperimentet og eksportere data som TXT-format ved å klikke på STORE.
- Plassere 10 pl synkronisert villtype (wt) L1 i et urglass og beregne prosentandelen av døde egg-ved hjelp av et disseksjonsmikroskop.
- Måling av den relative størrelsen på levende dyr i synkron populasjoner
- Åpne .txt-fil ved hjelp av en programvare i stand til å håndtere store datatabeller.
- Fra de analyserte objektene pakke ut TOF verdier knyttet til kontroll partikler som er preget av utslipp i den grønne kanalen høyere enn 100 vilkårlige enheter (denne verdien avhenger av parametrene som er satt i § 3.2.5). Opprett en ny kolonne og kaller det 'kontroll partikler'. Lag en kolonne som inneholder alle de andre objektene unntatt kontroll partikler som kalles "sample". MERK: fluorescens utslipp av nye partikkel batch må verifiseres før oppkjøpene. Dette vil sette fluoriserende terskel gjør det mulig å identifiserekontroll partikler enn L1S.
- For hver analyserte belastning identifisere den delen av eksperimentet hvor strømningsmengden er blitt endret (på grunn av tilstedeværelsen av en plugg av egg for eksempel). Å gjøre slik:
- Plott TOF av 'kontroll partiklenes for hver prøve som en faktor av gangen (figur 3B).
- Tegn lineær trendlinje ved hjelp av trendlinjen verktøy og vise ligningen på kartet.
MERK: TOF kontroll partikler skal være konstant over tid (horisontal linje, figur 3B). Vurderer ligningen av den lineære trendlinje tegnet på data y = ax + b, sørge for at 'a' verdi er lavere enn 10 -4. Alle målinger gjøres innen tidsseksjoner som viser et brudd i justeringen av styre partikkel bør fjernes fra analysen.
- Fjern døde embryoer og bobler (utslipp høyere enn 15 i rødt) samt små rusk og store egg plugger (TOF lavere enn 10 og høyer over 70 henholdsvis) fra "prøven" måling.
- Plott 'kontroll partiklenes fordeling for hver stamme analysert. Som vist i figur 3C disse fordelingene bør overlappe nesten perfekt. Dette sikrer at TOF målinger oppnådd for forskjellige stammer kan sammenlignes. MERK: normalisering av prøveelementene TOF spissen regulerende partikler kan brukes hvis fordelingen av regulerende partikler i en prøve ikke overlapper med det til kontrollprøver. Normalisert TOF er beregnet som følger:
- Normal TOF for genotype G = (prøve TOF for G) / (gjennomsnittlig 'kontroll partikkel' TOF for G) x (gjennomsnittlig 'kontroll partikkel' TOF for vekt) hvor wt er kontrollutvalget.
- Plot Larver TOF fordeling for hver stamme inkludert kontrollutvalget, i vårt tilfelle vekt dyr (figur 3D). Mål middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet (SEM) for hver populasjon (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hode-, Tail og leder / Tail-bredde-forhold er robuste Metrics.
Protokollene er beskrevet her har blitt brukt for å karakterisere funksjon av regulatorer og effektorer av Rho GTPases pix-en, pak-en og la 502 i løpet av tidlig forlengelse 7. Pix-en og pak-en kode for henholdsvis en guanin-utveksling faktor (GEF) og en effektor spesifikk for Rac / Cdc42 GTPases og la 502 koder for en effektor for RHO-en syv. I denne studien ble pix-en og pak-en vist seg å kontrollere epidermal morphogenesis under tidlig forlengelse 7. Denne studien brukte hodet og halen breddemål som beregninger viser for første gang, at hypodermal celler lokalisert i fremre embRyo følger ulike morphogenic programmer enn de som ligger i sin bakre 7. Å etablere reproduserbarhet og robusthet av disse beregningene, ble hodet bredde målt uavhengig fem ganger på 12 villtype (wt) embryoer på 1,2 ganger scenen. Avvik mellom de fem ulike grupper av målingen ble sammenlignet deretter vurdert ved hjelp av Brown-Forsythe test (ved hjelp av R statistikkpakke) avslører ingen signifikante forskjeller blant målinger (F- test p- verdi> 0,5, figur 4A) som tyder på at målene for en gruppe embryoer er reproduserbare. Vurdering av reproduserbarhet og batch effekter knyttet til disse målingene ble gjort gjennom måling av hodet bredden av wt embryoer på 1,2 ganger scene fra 4D-DIC bildebehandling gjøres på tre forskjellige dager (n = 12 embryo). Over disse tre måle gruppene, variansen var ikke signifikant forskjellige, og ingen signifikante satsvise virkninger ble funnet å påvirke hode wResultatene idth måle (F-test p-verdi> 0,5; figur 4b).
Lignende resultater ble oppnådd for hale breddemålinger og for målinger utført ved forskjellige stadier av tidlig forlengelse (data ikke vist). Disse dataene etablert head-bredde, halebredde og hode / hale bredde-forhold som robuste beregninger for å karakterisere tidlig forlengelse defekter.
Måling Head and Tail Bredde samt lengde av embryoene Tillater for Karakterisering av genene som kontrollerer Tidlig Forlengelse langs Antero-posterior aksen av Embryo.
Måling av lengden av embryoene, så vel som bredden av hodet og halen ble gjort på vekt- og mutante embryoer som bærer null eller termo sterk tap-av-funksjon alleler for genene som kontrollerer tidlig bruddforlengelse: pix-1 (gk416);pak-en (ok448) og la-502 (sb118ts) 7. Vi målte hode / hale (H / T) bredde-forhold på vekt- og mutante embryoer ved begynnelsen (1,2-ganger trinn) og ved enden av den tidlige forlengelse ved ikke-permissive temperaturen (figur 4C venstre og henholdsvis høyre panel). Mens ved begynnelsen av tidlig forlengelse var der ingen overgang eller et redusert H / T-forholdet ble observert i pix-1, pak-1 og la-502 mutanter sammenlignet med WT dyr (1,2-ganger trinnet, figur 2C, venstre panel ), på slutten av tidlig forlengelse alle tre mutanter viste en signifikant høyere H / T-forhold enn wt embryoer (t-test p-verdier <0,006, figur 4C, høyre panel). Dette viste at pix-1, pak-1 og la-502 mutant-embryoer viser unormal antero-posterior morfologi ved slutten av tidlig forlengelse. Videre analyser sammenligne hode bredde og hale bredde between 1,2 ganger trinnet og enden av tidlig forlengelse, anvendelse av de samme måleparametre avslørte at hodebredden er mindre redusert i pix-1, pak-1 og la-502 mutanter mens halen bredde reduseres betydelig mindre i ekspansjons 502 mutanter bare 7. Denne viste at la-502 kontroller morphogenic prosesser på samme måte langs Antero-posterior aksen av embryoet, mens pix-en og pak-en kontroll morphogenic prosesser som forekommer hovedsakelig på fremre del av embryo 7. Den lengdeforskjellen mellom embryoene ved enden i forhold til begynnelsen av tidlig forlengelse (figur 4D) ble også målt. Vi har funnet at tidlig forlengelsen var signifikant redusert i pix-1, pak-1 og la-502 mutanter sammenliknet med wt antyder at endring av den fremre morfogenese i pix-1 og pak-1-mutanter alene er tilstrekkelig til å redusere elongation av embryoet.
Protokoll 2 og 3 ble anvendt for å vurdere lengden av arrestert larver i wt og mutante bakgrunn. Lengden av disse larver ble vurdert ved anvendelse av både bildeanalyse (protokoll 2) 7 og flow-cytometri (protokoll 3, upubliserte data). Målinger av larver lengde ved hjelp av bildeanalyseresultater i absolutte målinger av dyrenes lengde i mikrometer i en robust og svært reproduserbar måte (figur 5A). Denne analysen viste at larvene synkronisert mutant skjerm vesentlig redusert lengde i forhold til vekt (figur 5A) 7. Måling av disse larver ved hjelp av flow-cytometri basert protokoll (Protokoll 3) ga sammenlignbare resultater (figur 5B). Imidlertid bør det bemerkes at et stort antall larver målt ved anvendelse av sistnevnte fremgangsmåte i betydelig grad øker den statistiske robusthet for genotype sammenligning (t - test p-verdier <10 -24). Basert på disse funnene, kan det hende at flow-cytometri tilnærming være et bedre valg enn bildeanalyse for å karakter muterte dyr som viser svært subtile forlengelse defekter.
Figur 1. Utarbeidelse av en Agarose Pad. A, objektglass som er lagt inn mellom to avstands-objektglass dekket av to lag av maskeringstape. B, er den agarose puten dekket med et annet lysbilde som støttes av de to avstands-slides. C, Den endelige formen og størrelsen av agarose puten etter kutting med et barberblad for å passe dekkglass. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
g2.jpg "/>
. Figur 2. Måling av tidlige og sene Forlengelse Defekter A - B, måling av lengden av et embryo i komma trinn (A) og ved slutten av tidlig forlengelse (B). Den røde linje, som brukes til å måle embryoene ble trukket ved hjelp av den segmenterte linjen verktøyet fra ImageJ. C, hode og hale bredde måles i embryoer ved 1,2 gangers trinn (venstre) og ved slutten av tidlig forlengelse (til høyre). Pilene representerer lokaliseringen av målte områder (modifisert fra Martin et al., 2014). Skala:. 20 mikrometer D, er Lengde Larver målt for synkronisert L1-larver. Høyre panel viser et forstørret utsnitt av det registrerte bildet (til venstre). Den røde linjen ble tegnet med segmenterte linjen verktøyet av ImageJ. Den brukes til å måle lengden av larven. Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Måling av lengde Synkronisert Larver Ved hjelp av Flow-cytometri. A, gating og sortering vinduet COPAS Biosort viser grønn og rød utslipp av kontroll partikler, bobler, døde og levende dyr med hensyn til deres Time-of-flight (TOF ). B, TOF av kontroll partikler på ulike tidspunkter for et representativt eksperiment. Helningen av lineær funksjon av TOF som funksjon av tiden er rundt 10 -5, noe som indikerer at TOF kontroll partikler er konstant over tid gjennom hele eksperimentet. C, Fordeling av partikkelkontroll TOFS uttrykt som en prosentandel av maksimal verdi av fordelinger. Non-normaliserte og normkontroll partikkelfordelinger er representert for pak-en (ok448). Andre distribusjoner er ikke normalisert. D, distribusjon av TOFS for å levedyr uttrykkes som en prosentandel av den maksimale verdi av fordelingene. TOFS ikke er normalisert på kontrollpartikler med unntak av pak-en (ok448) som angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Pix-1, Pak-1 og la 502 Mutants Present Tidlig Forlengelse Defekter. A - B, reproduserbarhet og robusthet vurdering av hodet bredde målinger A, fem uavhengige målinger av hodebredde for wt embryoer i 1,2-gangers trinn (n = 12 embryoer).. Midler og standardavvik (feilfelt) er angitt. Ikke-signifikant (NS) forskjeller mellom målingene ble beregnet ved hjelp av Brown-Forsythe test (ossing R statistikkpakke) (F-test p-verdi> 0,5). B, leder bredde for wt embryoer på tre forskjellige dager (n = 12 embryoer). Gjennomsnitt og standardavvik er angitt i tillegg; Det var ingen signifikant forskjell i strid tvers av målinger (ns; Brown-Forsythe F-test p- verdi> 0,5) C, Utdeling av hode / hale bredde-forhold på 1,2 ganger stadium (venstre panel), på slutten av tidlig. forlengelse (høyre panel) i vekt, pix-en (gk416), pak-en (ok448) og la 502 (sb118ts) mutanter ved 23-24 ° C. Legg merke til at mødre lar-502ts embryoer som brukes til denne studien ble dyrket ved 25,5 ° C. D, Fordeling av forlengelsen i vekt, pix-en (gk416), pak-en (ok448) og la-502 (sb118ts) mutanter mellom komma trinn og starten av sen forlengelse. Boksen-plott representerer min, max, 25 th, 50 th (median) og 75th persentiler av befolkningen. * T-test p-verdi <0,05, ** t-test p-verdi <0,006 (modifisert fra Martin et al., 2014). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Pix-en (gk416), Pak-en (ok448) og L et-502 (sb118ts) larver Present Lengde Defekter. A, Lengde på larver målt i vekt, pix-1 (gk416), pak-en (ok448) og la-502 (sb118ts) dyr målt ved hjelp av bildeanalyse (protokoll 2). B, relativ larver lengde målt ved hjelp av flow-cytometer ( protokoll 3). Tall i parentes svarer til antallet dyr som brukes for the målinger. Midler for lengder og standardfeil for gjennomsnittet (SEM, feilfelt) er representert. Student t-test p- verdier er indikert (p). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver romanen beregninger for å karakterisere tidlig og sent faser av embryonale forlengelse.
I del 1, er det avgjørende skritt mulig tilstedeværelse av bakterier på puten. Embryoene er hermetisk lukket mellom puten og dekkglass under bildet oppkjøpet. Tetting lysbildet er nødvendig for å unngå uttørking av dyrene under oppkjøpet som varer mer enn to timer. Så vidt vi vet, ingen av selfangere som brukes til å montere agarose pads mellom sklie og dekk er luftgjennomtrengelige. Følgelig, når en stor mengde bakterier (eller embryoer) er til stede på puten, kan de være ute av oksygen etter noen timer fører til deres tidlig død. Å ha tre-fold embryoer - tilsvarende embryoer som er tre ganger i lengde sammenlignet med ikke-langstrakte embryoer - innspilt sammen med embryoene av interesse vil være en god indikator på potensielle hypoksiske forhold, siden disse embryoer slutter å bevege seg i their eggeskall i fravær av oksygen. Ingen morfologiske målinger bør gjøres på hypoksiske forhold eller på døde embryoer.
Et annet kritisk punkt ved bruk av time-lapse imaging er temperaturen hvor utvikling av fosteret skjer. Termo mutanter er for tiden brukes i C. elegans. Den biologiske effekten av temperatur forskyvning kan skje umiddelbart eller forsinket, avhengig av halveringstiden for proteinet og naturen av mutasjonen dens bærer. Derfor bør den temperatur ved hvilken embryoet er utsatt være konstant over tid og bør være kontrollert av passende ventilasjon av mikroskopi rom eller en varme- kjølekammer på mikroskopet scenen.
Seksjon 2 er avhengig av larvene synkronisering med alkalisk hypokloritt-behandling. Under visse omstendigheter kan denne behandlingen føre til embryonale dødelighet (Emb). EMB over 20% i vekt befolkningen antyder en forhøyet toksisitet i løpet av hypokloritt godbitment som kan negativt påvirke morphogenesis. Synkronisert L1 viser høy Emb i vekt bakgrunn bør ikke brukes til videre analyse. Denne begrensningen gjelder også protokoll 3.
Vi anbefaler ikke bruk av anestesimidler for å immobilisere larver. Levamisol særlig immobilizes nematode gjennom induksjon av muskel tetani som har en tendens til å krympe larvene innføre eksperimentelle bias. Dersom eksponeringstiden ikke er rask nok som følge av begrensninger i mikroskop, anbefaler vi reduserer motiliteten av larver ved å øke konsentrasjonen av agarose i puten og redusere mengden av væske mellom puten og dekkglass. Forsiktighet bør utvises imidlertid ikke å tørke ut larvene, ettersom uttørking vil redusere deres størrelse.
I avsnitt 3, måling av lengden av larver anvendt sammenligning av strømningshastigheter mellom analyserte prøver. For å gjøre dette, fordeling av styre partikler må være comparød. Hvis distribusjoner fullt overlegg, kan TOF (time-of-flight) verdiene oppnådd for tilsvarende prøver sammenlignes, hvis ikke, disse verdiene må normaliseres. Normalisering av prøve-TOF spissen regulerende partikler-TOF (som beskrevet i 3.4.5.1) har vært brukt med hell som vist for pak-1 (ok448) (figur 3C og figur 5B). Relative lengden av pak-1 (ok448) vs vekt ble funnet å være lik i minst 3 uavhengige eksperimenter med eller uten normalisering (data ikke vist). Vi anbefaler imidlertid, bekrefter resultatene oppnådd med normalisering med de som ble oppnådd uten den, spesielt når man sammenligner larver med små størrelsesforskjeller. Det skal bemerkes at målingen av larvene lengde ved hjelp av flow-cytometri gir en lengde i forhold til en kontrollprøve, i dette tilfellet, vekt- larver i stedet for en absolutt lengde i mikrometer som for bildeanalyse. Dette innebærer at målinger fra uavhengige eksperimenter kan ikkekombineres med mindre beregne størrelsen grad over vekt.
Bufferen brukes til fortynning i prøvekoppen vil ha en innvirkning på strømningshastigheten. Vi har observert at hylsteret bufferen anbefalt av produsenten inneholder vaskemiddel som øker mengden av bobler som genereres under overtakelsen. Ved hjelp av M9 buffer, som ikke inneholder vaskemiddel, betydelig redusert dannelse av bobler, men var mindre effektiv i å unngå tilstopping av egg i tubuli i sortereren, noe som påvirker strømningshastigheten av prøver. Egg plugging lett oppdages under oppkjøpet av en markant nedgang av den observer TOF av kontroll partikler i noen sekunder, etterfulgt av en forhøyet TOF- også i noen få sekunder. Egg plugging kan også føre til tilstopping av kanal og den komplette arrest av partikkelstrømmen (mindre enn 5 objekter per sekund). Hvis dette skulle skje, klikk på CLEAN-knappen til strømningshastigheten er gjenopprettet. Eventuelle målinger som oppstår under disse events bør utelukkes fra dataanalysen. Kappe buffer kan anbefales for forsøk med stammer som kjennetegnes ved høy forekomst av døde egg.
Prøven og kappen trykk (angitt ved trinn 3.2.3), kan endre seg (litt) over tid og må justeres manuelt under hele forsøket for å sikre en meget konstant strømningshastighet. Reduksjon eller økning av den lave renten vil være observerbar når analysere resultatene og plotte TOFS kontrollpartikler over tid (Figur 3C). Reduksjon av strømningshastighet vil føre til økning av den gjennomsnittlige TOFS partikler over tid, mens en økning av strømningshastighet vil føre til det motsatte. Endring av strømningshastigheten vil negativt påvirke sensitiviteten av metoden i å oppdage små størrelsesforskjeller mellom populasjoner av larver.
Metoder som mål å identifisere gener som styrer forlengelse og krever time-lapse mikros opptak er generelt høyly tidkrevende og kjedelig når fenotyping flere genotyper. Den flow-cytometer-tilnærming, mens det krever utstyr ikke er tilgjengelig for alle laboratorier, er mindre tidkrevende og følgelig mer effektiv når flere stammer trenger å bli karakterisert. Denne metoden er også mer robust statistisk sammenlignet med målinger ved hjelp av bildeanalyse (vurdert av studentens t- test for sammenligning mutant og vekt TOF distribusjoner, figur 5A og B). Denne metoden kan da være godt egnet for stammer som uttrykker forlengelses defekter med lav ekspressivitet / pene.
Flere metoder ved hjelp av flow-cytometri har blitt utviklet i det siste for å måle trenings av nematoder 9-12. Disse metodene bruke dyr dispensert i et 96-brønners plater og Reflex modulen av ormen sorter '. Reflex modulen gjør det mulig direkte analyse av nematode befolkning anbrakt i 96-brønners plater. Følgelig er disse fremgangsmåter er i stand til å karakteriRIZE hundrevis av tilstander per dag og utgjør en robust måte å måle trenings av en ikke-synkronisert befolkning. De er imidlertid ikke godt egnet til å identifisere små størrelsesforskjeller mellom synkronisert L1. Måling av små forskjeller mellom L1 larver krever måling over et stort antall dyr, noe som er uforenlig med bruk av 96-brønners plater og av den Reflex modul som kan effektivt prege 100 objekter på det meste per brønn. Metoden som beskrives her er utviklet for dette formål på bekostning av gjennomstrømning, som er betydelig redusert. Det muliggjør karakterisering av 3 til 4 betingelser pr time når instrumentet er kalibrert, noe som er en markert forbedring i forhold til ved bruk av bildeanalyse-protokoll i to.
Måling av hode og hale bredde-forholdet er den første metode som ble utviklet for å karakterisere morphogenic prosesser som skjer ujevnt langs antero-posterior aksen av embryoet 7. Nåranvendt på gener som vist for å styre begynnelsen av forlengelse, vil disse fremgangsmåter klargjøre den romlige fordelingen av signalveier som kontrollerer morfogenesen i denne fasen. Måling av lengden av arrestert larver enten ved hjelp av bildeanalyse eller strømningscytometri i kombinasjon med måling av lengden av embryoene på slutten av tidlig forlengelse vil muliggjøre identifikasjon av gener som kontrollerer enten tidlig eller sent forlengelse eller begge deler med høy følsomhet og presisjon. Disse prosedyrene kan da bidra betydelig til fremtidig forståelse av romlig og tidsmessig regulering av signalveier som styrer embryonale forlengelse i C. elegans. Videre kan disse fremgangsmåtene også være tilpasset for å studere signalveier som kontrollerer kroppslengden som for eksempel insulin og TGF-beta trasé 13, 14 og kronisk eksponering for miljømessige forurensninger 15, 16. Disse målingene kan gjøres på forskjellige larvestadier eller voksne using mindre variasjoner av protokoller 2 og 3. Måling størrelsesforskjeller i L1 er mer utfordrende med ormen sorter enn større gjenstander som L3, L4 larver eller voksne. Protokoll 3 kan da lett tilpasses for å gjøre disse målingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
