Introduction
В течение почти 50 лет нематод Caenorhabditis Элеганс зарекомендовал себя как мощная модель для изучения важных вопросов в области развития, нейробиологии, эволюции, хозяин-патоген взаимодействий и т.д. 1 Сила этой модели в изучении развития заключается в: его короткого жизненного цикла от 3-х дней; легкость, с которой эти животные могут быть генетически изменены; его прозрачность, что позволяет наблюдать клетки перемещения и морфологии в живых животных и его развития, что в основном внематочная. Стадии развития нематоды включают эмбриогенеза и четыре личиночной стадии (L1 до L4), а затем во взрослую жизнь. Во время эмбрионального развития, эпидермальный морфогенез привлек значительное внимание на его способность дать возможность лучше понять, как эпителиальные клетки мигрируют в качестве группы, как они реорганизовать их соединений и изменять свою индивидуальную морфологию, а также их взаимное расположение в пределах функционального эпителия.Эпидермальный морфогенез делится на четыре этапа: спинной интеркаляции, состоящий в реорганизации спинные эпидермальных клеток, называют гиподермой; вентральной корпус, заключающийся в миграции брюшных гиподермальных клеток по направлению к вентральной срединной линии, таким образом, герметизирующей эмбриона в эпителиального клеточного монослоя; раннего и позднего Удлинение трансформации фасолевидных эмбриона в червеобразный личинок. Вслед за морфогенез, эмбрион люк и личинки начинают питаться L1 с использованием имеющихся бактерий в их непосредственном окружении.
Поэтому эмбриональных удлинение является поздней стадии эмбрионального развития. Она состоит из расширения зародыша вдоль его продольной оси, и уменьшение его поперечного диаметра. Это предполагает значительное изменение формы гиподермальных клеток. Удлинение делится на ранний и поздний фазы. Ранняя фаза начинается на стадии разделителями и заканчивается , когда стенки тела мышцы начинают договаривающиеся в 1,75 раза стадии шИСД типа (вес) эмбрионов - эмбрионов , соответствующие которые являются 1,75 раза в длине по сравнению с не-удлиненная эмбрионов. Морфогенетические процессы , происходящие на этой стадии, в основном за счет сокращения нитевидных актина пучков (FBS) , расположенных на апикальном полюсе гиподермальных клеток , которые управляют их удлинение вдоль передне-задней оси эмбриона 2. Сужение FBs является контроль с помощью фосфорилирования миозина свет цепи тремя киназ LET-502 / ROCK, MRCK-1 и ПАК-1 5. Поздняя стадия удлинения, начинается, когда стенки тела мышцы становятся функциональными и начинают сокращаться. Она включает в себя сигнализацию механотрансдукция от стенки тела мышц к спинному и брюшные гиподермальных клеток и заканчивается , когда животные люк 3.
Удлинение дефекты, как правило, характеризуются процент животных, умирающих эмбрионов (эмбриональной летальности; Emb) и те, арестовывая их развития как личинок L1 (фенотип личинок арест; Lvа) и быть значительно короче , чем вес. Определение стадии развития требует ареста микроскопического наблюдения мертвых эмбрионов и арестовал личинками 3-6.
Недавно было показано , что некоторые гены, такие как регулятор Cdc42 / Rac и эффекторной PIX-1 и пак-1, контролировать процессы морфогенные как во время раннего и позднего удлинения 3,7. Недавно мы также показали , что морфогенетические процессы отличаются вдоль передне-задней оси эмбрионов на ранних стадиях удлинения 3 7. Эти результаты побудили разработку новых показателей, конкретно ориентированных на ранних или поздних стадий удлинения и другие показатели, позволяющие характеристику морфологии эмбрионов вдоль их передне-задней оси во время раннего удлинения.
Эти новые методы состоят в измерении длины эмбрионов в начале и в конце раннего удлинения, а также ширины их онобъявления и хвосты. 7 Два протоколы были разработаны для измерения длины только что вылупившихся личинок, синхронизированный на L1 стадии 7.
В скорлупа из эмбрионов защищают их от щелочной обработки гипохлоритом в то время как личинки, взрослые и бактерии, присутствующие в культуральной среде растворены обработкой. Эта процедура затем используется для очистки эмбрионов из несинхронизированной населения , содержащей большинство сытых взрослых 8. Ограничение еды используется для синхронизации только что вылупившихся личинок. Измерение длины этих личинок затем используется для обнаружения дефектов удлинения. Это измерение предпочтительнее измерения задержанных в развитии личинок на культуральных планшетах, так как личинки, которые вылупляются из не полностью удлиненные эмбрионы могут восстановить до "нормальной длины" при кормлении, но будет поддерживать их уменьшенные размеры при задержании при отсутствии пищи.
Здесь мы приводим подробные протоколы, позволяющие измерение леngth из удлиняя эмбрионов, а также ширину их головы и хвоста, используя замедленную DIC микроскопии и анализа изображений (Протокол 1). Мы также предоставляем подробные протоколы для измерения длины синхронизированной личинок с использованием анализа изображений (Протокол 2) и проточной цитометрии (протокол 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Характеристика раннего Дефекты Растяжимость в WT и мутантных животных
- Монтаж Эмбрионы для Normarski DIC микроскопии
- Подготовьте следующие питательные среды и материалы:
- М9 Буфер, растворить 12,8 г / л Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 г / л KH 2 PO 4, 5 г / л NaCl, 0,25 г / л MgSO 4 • 7H 2 O в дистиллированной воде и автоклав для стерилизации.
- NGM пластины, растворить 3 г / л NaCl, 16 г / л агара, 2,5 г / л bactopeptone в DDH 2 O. Автоклав и добавляют 1 мМ MgSO 4, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ фосфатного буфера и 5 мкг / мл холестерина. Налейте 6 мл NGM за 60 мм блюд. Дайте среда затвердеть в течение 24 ч при комнатной температуре. Добавьте несколько капель насыщенного культуры Е. палочки OP50 бактерии выращивали в бульоне Лурия (LB). Пусть бактерии растут в течение 48 ч и хранить пластины при температуре 4 ° С.
- Для создания червя писк, крепление платиновой проволоки "диаметром 0,01 на короткий пипетки Пастера. Закрепите платиновый провод к оконечности стеклянной пипеткой путем нагревания этого конечность с бензольным горелкой. Свести оконечность проволоки, чтобы создать своего рода лопату.
- Grow штамм червя на 60 мм NGM пластин с OP50 при 20 ° C.
Примечание: Термочувствительные аллели могут потребовать выращивания животных на непермиссивной температурах до 25.5 ° C. Плиты должны содержать много молодых людей, и еще много пищи для того, чтобы проводить протоколы. - Поместите стекло микроскопа между двумя распорными горок , покрытых двумя слоями липкой лентой (Рис . 1А)
- Приготовьте 3% раствор агарозы (вес / объем) в буфере M9 путем растворения 0,6 г агарозы порошка в 20 мл M9 буфера путем нагревания в микроволновой печи в течение 30 сек. Дайте раствору остыть в течение 5 мин.
Примечание: раствор агарозы может быть использован в течение нескольких дней после плавления в микроволновой печи. Этотакже могут быть аликвоты и хранили при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. - Поместите каплю горячей 3% раствора агарозы на предметном стекле, расположенный между двумя проставкой слайдами. Избегайте образования пузырьков.
- Быстро покрывают агарозы с другой слайд , как показано на рисунке 1В и нажмите вниз осторожно. Верхний слайд будет выравниваться агарозы капли и создать площадку с толщиной двух слоев липкой лентой.
- Разрешить агарозы, чтобы затвердеть в течение не менее 1 мин при комнатной температуре, или пока эмбрионы готовы к переходу на площадку.
- Использование червя выбор, передачи от 20 до 30 хорошо кормили молодых людей из NGM пластины в микро-центрифужную пробирку, содержащую 400 мкл буфера M9.
- Разрешить червей для осаждения под действием силы тяжести в течение приблизительно 5 мин и удалить супернатант с помощью микропипетки. Этот шаг призван устранить максимум бактерий отборных с нематодами.
- Добавьте 200 мкл буфера M9 в каждую пробирку.
- Использование пип ПастераEtte, передавать содержимое тубы (буфер и нематоды) на часовом стекле.
- Используйте один или два 25G 5/8 "иглы, чтобы отрезать животных на участке середины тела (между сперматекой и вульвы).
Примечание: скальпелем также может быть использован в качестве альтернативы иглы (ов). Делайте это по плаванию нематод и может потребовать некоторой практики. Идея заключается в том, чтобы использовать иглы, как ножницами или ножом в зависимости, как используются много игл. После того, как животные разрезают, гермафродиты освободить их эмбрионов в буфер. - Концентрат эмбрионов в центре часового стекла посредством создания кругового вихря в жидкости.
- Удалить большинство М9 с часового стекла с помощью микропипетки. Оставьте примерно 30 мкл M9 с эмбрионами.
- Удалить слайд , охватывающий агарозном площадку (рис 1B), сдвинув его с клавиатуры.
- Разрежьте площадку с лезвием бритвы для того, чтобы быть в состоянии полностью покрыть ее покровным (Рисунок 1C).
- С помощью пипетки Пастера перенести все эмбрионы (и червяк мусор) на агарозном площадку.
- Группа эмбрионы в центре площадки, используя ресничку приклеенный на конце наконечника, используемого для 200 мкл микропипетки.
- Медленно поместите покровное на площадку, избегая образования пузырьков и запечатать его.
Примечание: Несколько шпатлевки можно использовать. Мы используем рисунок резинки найти в художественных и ремесленных магазинов (как правило, используется в качестве маскировки резинки для акварелью картины). Эта резинка используется, так как она является гидрофильным и застывает достаточно быстро и не токсичен для червей. Слайды также могут быть запечатаны с лаком для ногтей или VALAP (смесь из вазелина, ланолин и Парафиновые воска). - Разрешить рисунок сухой резинки в течение примерно 15 мин.
- Подготовьте следующие питательные среды и материалы:
- Запись Раннее Удлинение с использованием четырехмерных Normarski DIC микроскопии
Примечание: Цель этого шага заключается в записи раннего удлинения от запятой до начала позднего удлинения- Определяется как момент, когда стенки тела мышцы начинают сокращаться. Мы также стремимся записать более одного эмбриона в то время. Восемь часов записи, как правило, требуется для записи раннего удлинения для группы несинхронизированных эмбрионов.- Поместите смонтированный-слайд на сцене микроскопа. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен 10X и 60X целей, а также DIC линзы, призмы, камеры и программное обеспечение захвата, позволяющих замедленную микроскопию и поколение Z-стеки (автоматизированная Z-платформы).
Примечание: убедитесь, что температура постоянна от 20 до 23 ° С в помещении микроскопии. Камера нагрева охлаждения может потребоваться на столике микроскопа, особенно при использовании термочувствительных мутантов. - Определить группу эмбрионов на стадии предварительного морфогенеза с использованием цели 10X.
- После обнаружения, соскальзывать цели 10X и добавить каплю масла погружения на слайде.
- Использование цели 60X, определить верхнюю и нижнюю часть еmbryos для настройки параметров обработки изображений Z-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не стесняйтесь, чтобы установить Z-стек больше, чем толщина эмбрионов. Установите расстояние между двумя соседними плоскостями, как 0,8 мкм. Это позволит охватить полную глубину эмбрионов в 35 до 50 Z-планов.
Примечание: Если микроскоп содержит автоматизированную платформу ху, эмбрионы, расположенных в разных местах площадки могут быть записаны одновременно. Для этого, запись ху координаты каждого места на площадке, который вы хотите проанализировать в ходе эксперимента. Убедитесь в том, чтобы выбрать ху при установке параметра записи и следить за остальными протокола, как указано. Тонкий Z-секционирование эмбриона во время записи не обязательно требуется для измерений, описанных в данном протоколе. Запись эмбриональное развитие и вес мутантных животных с максимальным разрешением, однако , хорошая практика, чтобы построить библиотеку записей , способных поддерживать дополнительные анализы. - Задаватьвверх по прошествии времени с интервалом 2 мин между двумя приобретениями продолжительностью 8 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции будет зависеть от интенсивности света, установленного для микроскопа. Движение клеток во время раннего удлинения происходит очень медленно; воздействие времени может быть примерно один кадр в секунду или меньше. Если эмбрионы на ранних стадиях морфогенеза (спинные интеркаляционных, вентральный корпус), раннее удлинение будет регистрироваться в течение 1 часа. Убедитесь, что оптический затвор закрыт между каждым приобретением. - Запустите приобретение и сохраните его.
- Поместите смонтированный-слайд на сцене микроскопа. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен 10X и 60X целей, а также DIC линзы, призмы, камеры и программное обеспечение захвата, позволяющих замедленную микроскопию и поколение Z-стеки (автоматизированная Z-платформы).
- Измерение ранних дефектов Растяжимость с использованием анализа изображений
- Открытое программное обеспечение Фиджи-ImageJ ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
- В меню выберите Анализ / Set Измерения, выберите Периметр. Для каждого эмбриона, отрегулировать Z-шкалу масштаба , чтобы сосредоточиться на глотке эмбриона , как показано на рисунке 2А. Это будет гарантировать, что вы сосредоточены на центре эмбриона. Для измерения длины эмбриона, отрегулируйте шкалу масштаба времени , чтобы зародыш интерес в начале раннего удлинения (стадия запятой; Рисунок 2А). Обратите внимание на время ( "Time-начало").
- Выберите инструмент сегментированный линии. Draw сегментированный линию от кончика рта зародыша до кончика хвоста после средней линии эмбриона (фиг.2А). С помощью вкладки меню Analyze / Measure, получить длину нарисованной линии ( "длина начало").
- Повторите это измерение для того же самого эмбриона в конце раннего удлинения (момент, когда мышцы начинают сокращаться). Обратите внимание на время ( "Time-конец") и измерить длину эмбриона ( "Длина-конец") , как описано выше (рис 2В).
- Рассчитать продолжительность (D) раннего удлинения и увеличения длины (L) на этой стадии выглядит следующим образом:
D = "Время-конец" - "Время-начало"
& #160; L = "Длина-конец" - "Длина-начало" - Для измерения ширины головы, отрегулируйте масштаб времени бар, чтобы эмбрион на стадии интереса (1,2-кратном стадии или в конце раннего удлинения). Выберите инструмент прямолинейный. Нарисуйте поперечная (спинно-вентральной оси) средней линии головы. Этот раздел является массивная часть зародыша (рис 2С). С помощью меню Analyze / Measure, получить длину линии, соответствующей ширине головки.
- В то же время точки, повторите этот шаг, рисуя поперечной средней линии хвоста (средней линии между кишечном клапаном и кончик хвоста; Рисунок 2C) и измерить его , чтобы получить ширину хвоста.
Примечание: Используйте это измерение для сравнения эмбрионов на той же стадии через различные фенотипы. Для обеспечения воспроизводимости этого измерения, убедитесь, чтобы найти место, расположенный вокруг средней линии хвоста животного, которое может быть легко признан от одного животного кругой. - Для расчета головы отношение ширины хвост, разделите ширину головки по ширине хвоста.
2. Характеристика позднего Растяжимость дефектов с использованием анализа изображений
- Синхронизация L1 Личинки с использованием щелочной гипохлорита Лечение
- Из не-голодали мм пластины 60, содержащей много Gravid взрослых, собирать все черви в микро-центрифужные пробирки путем промывки нематод от пластины с 1 мл буфера M9 с помощью пипетки Пастера.
- Засыпные нематоды при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант с помощью микропипетки, не мешая червячное гранулу.
- Добавьте 1 мл раствора гипохлорита в каждую пробирку (0,4 М гипохлорита, 0,5 М NaOH) и встряхивают в течение 3 мин.
Примечание: щелочной раствор гипохлорита должны быть свежеприготовленной и эмбрионы в этом растворе следует осторожно перемешивают, но непрерывно оптимизировать растворение взрослых и оксигенации EMBRYos. Через 3 мин перемешивания, большинство взрослых должны освободить свои яйца в раствор. - Спин при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и быстро удалить супернатант с помощью микропипетки, не нарушая гранул.
- Промыть четыре раза по 1 мл буфера M9 с последующим центрифугированием при 3500 х г в течение 3 мин.
- После четвертой промывки удалите супернатант и ресуспендируют яйца в 700 мкл буфера M9 без пипетированием яйца (как яйца будут прилипать к пластику наконечника).
- Лента трубку на орбитальном шейкере 3 мм помещают в термостат при соответствующей температуре роста и встряхивают при 600 оборотах в минуту в течение ночи.
- Измерение длины синхронизированных Личинка
- Центрифуга задержанных в развитии личинок L1 при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспендируют личинок в 100 мкл буфера M9 и передавать их на агарозный площадку с помощью пипетки Пастера (агарозном колодки следует подготовитьd, как описано в разделе 1.1.2 к 1.1.8). Поместите покровное на площадку.
Примечание: Прокладка не должна быть уплотнены резинку для этого эксперимента, который включает в себя короткий приобретение. - Используйте 10X объективную и фазового контраста освещения для измерения длины личинок, если используется камера с высоким разрешением. Увеличение интенсивности света , чтобы иметь возможность захвата изображений в течение нескольких миллисекунд и , следовательно , получить четкую картину личинок (рис 2D).
Примечание: В то время как плавательные Trashes личинок уменьшаются на агарозном площадку, они все еще движется. Таким образом, быстрая запись имеет важное значение для получения четкого изображения. - Откройте Фиджи-ImageJ и повторите шаг 1.3.1. Для измерения длины личинок, выберите инструмент сегментированный линии. Draw сегментированный линию от кончика головы до кончика хвоста ниже средней линии личинок (рис 2D, правая панель).
- Использование меню Analyze / Measure, получить длину изнарисованная линия, соответствующая длине личинок в микрометр.
- Центрифуга задержанных в развитии личинок L1 при 3500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспендируют личинок в 100 мкл буфера M9 и передавать их на агарозный площадку с помощью пипетки Пастера (агарозном колодки следует подготовитьd, как описано в разделе 1.1.2 к 1.1.8). Поместите покровное на площадку.
3. Характеристика позднего Растяжимость Дефекты Использование проточной цитометрии
- Синхронизировать личинок
- Очищают эмбрионов с использованием щелочной обработки гипохлорита, как описано в разделе 2.1 из полных 100 мм пластин сытых молодых людей, и пусть эмбрион люк и арест L1 в буфере M9 в течение 16 до 24 часов при 20 или 25,5 ° C в зависимости от штамма проанализированы.
Примечание: Одна полная тарелка сытых взрослых на штамм является достаточным для анализа, описанного ниже.
- Очищают эмбрионов с использованием щелочной обработки гипохлорита, как описано в разделе 2.1 из полных 100 мм пластин сытых молодых людей, и пусть эмбрион люк и арест L1 в буфере M9 в течение 16 до 24 часов при 20 или 25,5 ° C в зависимости от штамма проанализированы.
- Калибровка Worm сортировщик
Примечание: проточный цитометр, используемый здесь большой поток частиц цитометре (далее, шнекового сортировщик). Червь сортировщик включает в себя 670 нм красный лазерный диод, который находится в передней части детектора исчезновения. Червь сортировщик также содержит аргонового лазера многострочный для флуоресцентного возбуждения. В standard инструменты имеют три фотоумножители (ФЭУ) флуоресцентных детекторов, используемых для обнаружения выбросов флуоресценции в зеленых, желтых и красных областях спектра. В протоколе, описанном здесь, TOF, будет использоваться для измерения размеров личинок, красный канал будет использоваться для идентификации мертвых червей, которые будут окрашиваться пропидия йодида (PI). GP (общего назначения) Высокая флуоресценция управления Частицы используются для калибровки прибора и в качестве внутреннего контроля в нашем эксперименте проявлять высокую флуоресценцию в зеленый, желтый и красный. Они будут единственными объектами в анализируемом образце с высокой эмиссии, обнаруженного в зеленом канале и впоследствии будут определены на основе этой характеристики.
Примечание: живые животные идентифицированы на основании отсутствия флуоресценции в канале зеленого и красного цвета, а также на ТОФ. Autofluorescent излучение из кишечника личинок не обнаруживается на стадии L1.- Включите лазерный блок, компьютер, компрессор сd Червь сортировщика инструмент. Нажмите кнопку START на открытом сортировщик программного обеспечения червя, как указано в инструкции по эксплуатации прибора.
- Обратите внимание на всплывающее окно управления аргонового лазера. Выберите режим RUN и ждать, как лазерные силы достигают 10 ± 1 мВт. Выберите ГОТОВО в окне управления лазером.
- Установите оболочку и образец давления до 5.10 ± 0,02 и 5,51 ± 0,01 соответственно. Дайте давление уравновешиваться в течение не менее 15 мин и нажмите OK ДАВЛЕНИЕ флажок.
Примечание: Скорость потока зависит от оболочки, и образец давления. - Убедитесь в том, чтобы устранить все пузырьки, присутствующие в канальцах канале потока между чашкой образца и анализируемой камеры. Для этого нажмите Приобретать и аккуратно вылить трубочку, пока ни один пузырь не усваиваются (как видно в окне приобретения).
- Настройка всех параметров для люминесцентных ламп и TOF измерения и обнаружения следующим образом:
- Установите весы для TOF, Ext, зеленый, желтый и красный к256. усиления Установить , как описано в таблице 1. Набор PMT управления на 700 для зеленых и желтых тонов и до 900 для красного цвета.
Примечание: Два фильтра возбуждения доступны (488 нм и 514 нм) и могут быть использованы для возбуждения либо зеленый флуоресцентный белок (GFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP) или любой флуорохромии, возбуждаемые на этих длинах волн с многострочной аргонового лазера. Соответствующие фильтры должны быть вставлены в камеру фильтра оборудования. Мы использовали 488 нм фильтр для следующего эксперимента.
- Установите весы для TOF, Ext, зеленый, желтый и красный к256. усиления Установить , как описано в таблице 1. Набор PMT управления на 700 для зеленых и желтых тонов и до 900 для красного цвета.
- Для калибровки червя сортировщик, выберите "Выполнить частицы управления" в меню инструментов. Поместите 20 мл 1x GP (общего назначения) высокой флюоресцентностью контроля частиц в чашке (эти частицы являются флуоресцентные частицы точного размера, проданные производителем цитометрии для калибровки их инструмент).
- Нажмите на кнопку, чтобы начать ACQUIRE оболочку и поток пробы.
Примечание: Ожидать среднее связанное с распределением контроля частиц 21 ± 6 и переменном токеoefficient вариации вокруг этого среднего значения (CV) ≤11. Если CV является> 11 и среднее значение> 27 попытаться очистить канальцы, нажав несколько раз на кнопку чистой или щелкая канал потока.
- Приобретение TOF животных
Примечание: Свет рассеивает, когда объект переходит в проточную кювету между лазерным источником и детектором экстинкции. Время, необходимое для света, чтобы быть рассеянной летающего объекта (время полета, TOF) используется для измерения осевой длины объекта. Степень света замаскированного объекта (угасание, EXT) используется в качестве меры его непрозрачностью / оптической плотности.- Поместите 10 мкл синхронному дикого типа (вес) L1 в часовом стекле и оценить процент мертвых-яиц с использованием рассекает микроскопом.
Примечание: Синхронное L1 отображения изображения с высоким Emb (выше 20%) в вес не следует использовать для дальнейшего анализа. - Передача синхронизированы L1 от микроцентрифуге (аpproximately 700 мкл М9, содержащей L1) в 15 мл коническую пробирку. Добавить пропидий йодида (PI) в конечной концентрации 10 мкг / мл (разведение 1/100 от 1 мг / мл маточного раствора) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
Примечание: Мертвые яйца и личинки будут окрашивали PI и детектируется как высоко флуоресцирующих объектов с использованием красного канала. - Добавьте 10 мл буфера для разбавления М9 запятнанные популяции. Возьмите 5 мл разведенной населения и развести их в четыре раза, добавляя 15 мл M9. Поместите это разбавление в чашку для образца.
- Запуск потока пробы, нажав ACQUIRE и наблюдать скорость потока.
Примечание: Для того, чтобы иметь точные измерения, скорость потока должна оставаться между 15 и 25 объектов / сек. - При необходимости, регулировать количество животных в чашке для достижения желаемой скорости потока.
Примечание: Воля скорость потока зависит от давления (оболочка и образец), которые являются постоянными, как указано в пункте 3.2.3 и концентрации личинок Iп чашка. Если скорость потока превышает 25 объектов / сек добавить буфер в чашку. Если она ниже, чем 15 объектов / сек Добавить концентрированную L1 (от этапа 3.3.3) в чашке. - После того, как соответствующая концентрация объекта достигается, оценить объем в чашку и добавить 1/4 тыс этого объема в растворе с высокой флуоресценцией GP управления Частицы 4x.
- Регулировка стробирования и параметров сортировки. Для этого нажмите кнопку "Создана память" в меню и выберите "TOF" vs. и "зеленых". Нажмите на ссылку "Сортировка" в меню и выберите "TOF против" и "красный". Gating и сортировочных графика будет выглядеть , как показано на рисунке 3А.
Примечание: Это позволит визуализировать частиц управления (излучение в зеленый и красный), мертвые животные окрашивали PI и пузырьков (излучения в красном и не зеленый) и живых животных (без выбросов в ни зеленых , ни красных каналов) (рис 3A ). - Запустите эксперимент, нажав AcqUIRE.
Примечание: Для того, чтобы определить небольшие различия в размерах между личинками, анализировать около 10000 объектов, поэтому около 8000 животных. Остановить эксперимент и экспортировать данные в формате .txt, нажав на магазинных.
- Поместите 10 мкл синхронному дикого типа (вес) L1 в часовом стекле и оценить процент мертвых-яиц с использованием рассекает микроскопом.
- Измерение относительного размера живых животных в синхронном группах населения
- Откройте файл .txt с помощью программного обеспечения, способного управлять большими таблицами данных.
- Из анализируемых объектов извлечения значения TOF, связанные с частицами управления, которые характеризуются излучением в зеленом канале выше, чем 100 условных единиц (это значение зависит от параметров, установленных в разделе 3.2.5). Создайте новый столбец и назовите его "частицы управления". Создайте столбец, содержащий все остальные объекты, за исключением частиц контрольных называемых "образец". Примечание: флуоресцентное излучение новых потребностей пакетных частиц необходимо проверить перед началом приобретения. Это позволит установить люминесцентную порог, позволяющий идентификациючастицы контроля над L1s.
- Для каждого анализируемого штамма идентифицировать часть эксперимента, в котором скорость потока был изменен (в связи с наличием вилки яиц, например). Для этого:
- Постройте TOF из "частиц управления" для каждого образца в качестве фактора времени (рис 3B).
- Нарисуйте линейную линию тренда с помощью инструмента трендовой линии и отобразить уравнение на графике.
ПРИМЕЧАНИЕ: TOF частиц управления должно быть постоянным в течение долгого времени (горизонтальная линия, фигура 3В). Рассматривая уравнение линейного тренда , построенную на данных у = ах + Ь, убедитесь , что 'а' значение ниже, чем 10 -4. Все измерения, сделанные в пределах временных участков, отображающих разрыв в створе контрольной частицы должны быть удалены из анализа.
- Удалить мертвых эмбрионов и пузыри (эмиссия выше 15 в красный цвет), а также небольшие обломки и большие яичные пробки (TOF ниже 10 и высокаяэр чем 70 соответственно) от измерения 'образца'.
- Участок распределения частиц 'управления' для каждого штамма анализируемого. Как видно на рисунке 3С эти распределения должны перекрывать почти идеально. Это гарантирует, что измерения TOF, полученные для различных штаммов можно сравнить. Примечание: нормализация выборочных элементов TOF над частицами управления могут быть использованы, если распределения частиц контрольных в образце не накладывать с этим контрольных образцов. Нормализованная TOF вычисляются как следует:
- Нормализация TOF для генотипа G = (образец TOF для G) / (среднее 'управления' частиц TOF для G) х ( в среднем 'частиц управления' TOF для масс) , где вес является контрольным образцом.
- Участок распределение Личинки TOF для каждого штамма в том числе контрольного образца, в нашем случае вес животных (рис 3D). Измерение среднего значения и стандартная ошибка среднего (SEM) для каждой популяции (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Глава-, задка и Head / Хвост ширине прочны Метрики.
Описанные здесь протоколы были успешно использованы для характеристики функции регуляторов и эффекторов Rho GTPases PIX-1, пак-1 , и пусть-502 во время раннего удлинения 7. Пикс-1 и пак-1 код соответственно для фактора гуанин-обмена (ГЭФ) и эффектор специфичные для Rac / Cdc42 ГТФаз и LET-502 кодирует эффектора для Rho-1 7. В этом исследовании, пикс-1 и пак-1 было показано , что контроль эпидермальный морфогенез во время раннего удлинением 7. В данном исследовании используется голова и ширина хвоста измерения как показатели демонстрируют впервые, что гиподермальные клетки, расположенные в передней НабРё следуют различные морфогенные программы , чем те , которые расположены в его задней 7. Для того, чтобы установить воспроизводимости и надежности этих показателей, ширина головы измерялась независимо друг от друга пять раз на эмбрионах 12 дикого типа (вес) в 1,2-кратном стадии. Сравнивали Расхождения между пятью различными группами измерений затем оценивали с помощью теста Брауна-Форсайт ( с использованием статистического пакета R) не раскрывая никаких существенных различий среди измерений (F- тестовое значение p-> 0,5; рис 4A) предполагая , что измерения для группы эмбрионов являются воспроизводимыми. Оценка воспроизводимости и пакетных эффектов , связанных с этими измерениями было сделано посредством измерения ширины головной вес эмбрионов в 1,2-кратном стадии от 4D-DIC изображений сделано на трех разных дней (п = 12 эмбрионов). В рамках этих трех измерений групп, дисперсия существенно не отличалась и не было обнаружено каких-либо существенных эффектов периодического действия, чтобы воздействовать на головной шIDþ результаты измерений (F-тест р -Value> 0,5; рис. 4б)
Аналогичные результаты были получены при измерении ширины хвоста и для измерений, сделанных на разных этапах раннего удлинения (данные не показаны). Эти данные установлены головные ширину, хвост ширины и головы / соотношение ширины хвост в качестве надежных показателей для характеристики ранних дефектов удлинения.
Измерение головы и хвоста Ширина, а также длину эмбрионы Позволяет характеристике генов , контролирующих преждевременное удлинение вдоль передне-задней оси эмбриона.
Измерение длины эмбрионов, а также ширины их головы и хвоста было сделано на вес и мутантных эмбрионов , несущих нулевой или термочувствительные сильной потери функциональных аллелей генов , контролирующих раннее удлинение: PIX-1 (gk416);Pak-1 (ok448) и пусть-502 (sb118ts) 7. Мы измерили голова / хвост (H / T) ширина отношение масс и мутантных эмбрионов в начале ( в 1,2 раза ступень) и в конце раннего удлинения при запрещающей температуре (рис 4C левой и правой панели соответственно). В то время как в начале раннего удлинения не было переключе- или уменьшенное Н / отношение Т наблюдалось в PIX-1, пак-1 , и пусть-502 мутантов по сравнению с вес животных (1,2-кратному стадии, на фиг.2С, левая панель ), в конце раннего удлинения всех трех мутантов показали значительно более высокий H / T соотношение , чем вес эмбрионов (т -test р -значения <0,006; рис 4C; правая панель). Это свидетельствует о том, что PIX-1, пак-1 , и-502 мутантных эмбрионов отображения ненормального переднезадней морфологию в конце раннего удлинения. Дальнейший анализ сравнивая ширину головы и хвоста ширина betweeп 1,2-кратный этап и конец раннего удлинения, используя те же параметры измерения показали , что ширина головки меньше снижается в PIX-1, Pak-1 , и пусть-502 мутантов , а ширина хвоста уменьшается значительно меньше в LET-502 мутантов только 7. Это показало , что пусть-502 средства управления морфогенные процессы аналогично вдоль передне-задней оси эмбриона, в то время как пикс-1 и пак-1 управления морфогенетические процессы , происходящие в основном в передней части зародыша 7. Измеряют также Разница в длине между эмбрионами в конце по сравнению с началом раннего удлинения (рис 4D). Мы обнаружили , что раннее удлинение было значительно снижено в PIX-1, пак-1 , и пусть-502 мутантов по сравнению с масс позволяет предположить , что изменение переднего морфогенеза в PIX-1 и PAK-1 мутантов одного достаточно , чтобы значительно уменьшить elongatioп эмбриона.
Протокол 2 и 3 были использованы для оценки длины задержанных в развитии личинок в вес и мутантных фонов. Длина этих личинок оценивали с использованием как анализа изображений (Протокол 2) 7 и проточной цитометрии (протокол 3, неопубликованные данные). Измерения длины личинок с использованием результатов анализа изображения в абсолютных измерениях длины животных в микрометров в прочном и высоко воспроизводимым образом (рис. 5А) Этот анализ показал , что синхронизируется мутант личинки имеют значительно сократить длину по сравнению с масс (рис 5А) 7. Измерение этих личинок с использованием на основе потока цитометрии протокол (протокол 3) дали сопоставимые результаты (рис 5б). Тем не менее, следует отметить , что большое количество личинок измеряется с использованием последнего подхода значительно увеличило статистической значимости сравнения генотип (т - Испытание р -значения <10 -24). Основываясь на этих выводах, поток-цитометрии подход может быть лучшим выбором по анализу изображений для того, чтобы охарактеризовать мутанта животных, отображающие очень тонкие дефекты удлинения.
Рисунок 1. Подготовка агарозном Pad. А, предметное стекло микроскопа помещают между двумя проставкой горок , покрытых двумя слоями клейкой ленты. B, агарозы накладка покрыта другим горкой , поддерживаемой двумя проставкой слайдами. С, окончательную форму и размер агарозном площадку после резки с лезвие бритвы , чтобы соответствовать покровное. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
g2.jpg "/>
. Рисунок 2. Измерение раннего и позднего Растяжимость Дефекты A - B, Измерение длины эмбриона на стадии запятой (A) и в конце раннего удлинения (B). Красная линия, используется для измерения эмбрионов был нарисован с использованием сегментированного инструмент строки ImageJ. C, голова и хвост ширина измеряются в эмбрионах в 1,2-кратном стадии (слева) и в конце раннего удлинения (справа). Стрелки обозначают локализацию измеренных областей (модифицированных от Martin и др., 2014). Шкала бар:. 20 мкм D, длина Личинки измеряется для синхронизированной L1-личинок. Правая панель представляет собой увеличенный вид захваченного изображения (слева). Красная линия была разработана с использованием сегментированного инструмент строки ImageJ. Он используется для измерения длины личинки. Шкала бар:. 100 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Измерение длины синхронизированных Личинка с помощью проточной цитометрии. А, шумоподавление а окно сортировки Copas Biosort показывая зеленым и красным излучением частиц контроля, пузырьки, мертвых и живых животных по отношению к их времени пролета (TOF ). Б, TOF - частиц контрольных в различные моменты времени для репрезентативного эксперимента. Наклон линейной функции TOF в зависимости от времени составляет около 10 -5, что указывает на TOF - частиц управления является постоянным с течением времени в течение всего эксперимента. С, распределение частиц тофы контроля , выраженных в процентах от максимального значения распределений. Распределения ненормализованная и нормированные контроль частиц представлены для пак-1 (ok448). Другие дистрибутивы не нормированы. D, распределение тофы для жизниживотных, выраженное в процентах от максимального значения распределений. Тофы не нормированы на частицах управления для Pak-1 (ok448) за исключением того, как указано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Pix-1, Пак-1 , и 502-Мутанты Дефекты Присутствуют Раннее удлинением. A - B, воспроизводимости и надежность оценки головки ширина измерения А, пять независимых измерений ширины головки для масс эмбрионов в 1,2-кратном стадии (п = 12 эмбрионов).. Средства и стандартные отклонения (столбики ошибок) указаны. Что не существенно (нс) различия между измерениями были вычислены с помощью теста Брауна-Форсайт (насING R статистический пакет) (F-тест р-значение> 0,5). B, измерительная головка ширина вес эмбрионов на трех разных дней (п = 12 эмбрионов). Средства и стандартные отклонения указаны также; не было никаких существенных различий в дисперсии для измерений (нс; Brown-Форсайт F-тест значение p-> 0,5) С, Распределения отношение ширины головы / хвоста в 1,2 раза стадии (левая панель), в конце рано. относительное удлинение (правая панель) в вес, пикс-1 (gk416), пак-1 (ok448) и LET-502 (sb118ts) мутантов при температуре 23 - 24 ° C. Обратите внимание , что матери LET-502ts эмбрионов , используемых для данного исследования выращивали при 25.5 ° C. D, распределение удлинения в вес, пикс-1 (gk416), пак-1 (ok448) и пусть-502 (sb118ts) мутантов между этап запятая и начало позднего удлинения. Кассовые участки представляют собой минимум, максимум, 25 - й, 50 - й ( в среднем) и 75й процентили населения. * Т -test р -value <0,05, ** т р -test -value <0,006 (редактировался Martin и др., 2014). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Pix-1 (gk416), Пак-1 (ok448) и L-502 и др (sb118ts) Личинки Present Длина Дефекты. А, длина личинок измеряется в вес, пикс-1 (gk416), пак-1 (ok448) и пусть-502 (sb118ts) животных измеряли с помощью анализа изображений (Протокол 2). B, относительная длина личинок измеряется с помощью проточные цитометр ( Протокол 3). Цифры в скобках соответствуют количеству животных, используемых для гое измерения. представлены; (столбики ошибок SEM) Средства длины и стандартная ошибка среднего значения. Т Студенческий -test p- значения указаны (р). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает новые метрики, чтобы охарактеризовать ранние и поздние фазы эмбрионального удлинения.
В разделе 1, важным шагом является потенциальное присутствие бактерий на площадке. Эмбрионы герметично заключены между колодкой и покровного во время захвата изображения. Уплотнительная слайд требуется, чтобы избежать высыхание животных во время приобретения, которая длится более двух часов. Насколько нам известно, ни один из пломбировочных материалов, используемых для крепления агарозном колодки между предметным и покровным не пропускающий воздух. Следовательно, когда большое количество бактерий (или эмбрионов) присутствует на площадке, они могут быть лишены кислорода после того, как несколько часов приводит к их преждевременной смерти. Имея в три раза эмбрионов - эмбрионов, соответствующие, которые в 3 раза по длине по сравнению с не-вытянутых эмбрионов - записанные вместе с зародышами интерес будет хорошим индикатором потенциальных условиях гипоксии, так как эти эмбрионы перестанут двигаться в Theiг скорлупа в отсутствие кислорода. Нет морфологических измерений не должно быть сделано на условиях гипоксии или на мертвых эмбрионов.
Другим важным шагом при использовании покадровой обработки изображений является температура, при которой происходит развитие эмбриона. Термочувствительные мутанты в настоящее время используются в C. Элеганс. Биологический эффект температурного сдвига может быть немедленной или с задержкой в зависимости от периода полураспада белка и природы мутации ее носит. Следовательно, температура, при которой эмбрион подвергается должно быть постоянным в течение долгого времени и должны контролироваться соответствующей вентиляции микроскопией помещении или камере нагрева-охлаждения на столик микроскопа.
Раздел 2 зависит от синхронизации личинок с использованием гипохлорита щелочной обработки. При определенных обстоятельствах, это лечение может привести к эмбриональной летальности (ЕСМ). Emb выше 20% в вес населения предполагает повышенную токсичность во время лечения гипохлоритомние, что может негативно сказаться на морфогенез. Синхронное L1 отображения высокой Emb в вес фона не следует использовать для дальнейшего анализа. Это ограничение также относится к протоколу 3.
Мы не рекомендуем использовать обезболивающих препаратов для иммобилизации личинок. Левамизол, в частности, удерживающую нематодой через индукции мышечной тетании, которая имеет тенденцию к сокращению личинок, представляя экспериментальную уклон. Если время экспозиции не достаточно быстро, в результате ограничений микроскопа, рекомендуется уменьшить моторику личинок за счет увеличения концентрации агарозы в прокладке и уменьшения количества жидкости между колодкой и покровное. Следует проявлять осторожность, однако, не пересушивает личинок, так как высыхание будет уменьшить их размер.
В разделе 3, измерение длины личинок использовали сравнение скоростей потока между анализируемых образцов. Для этого, распределение частиц управления должна быть комкрасный. Если распределений полностью перекрывающих TOF (время пролета) значения, полученные для соответствующих образцов можно сравнивать, если нет, то эти значения должны быть нормализованы. Нормализация образца-TOF над контрольными частицами-TOF (как указано в 3.4.5.1) успешно используется , как показано на пакистано-1 (ok448) (рис 3C и фигуре 5В). Было найдено относительная длина Pak-1 (ok448) против вес , чтобы быть одинаковыми по меньшей мере , 3 -х независимых экспериментов с использованием или без нормализации (данные не показаны). Тем не менее, мы рекомендуем, что подтверждает результаты, полученные с помощью нормализации с результатами, полученными без него, особенно при сравнении личинок с небольшими различиями размера. Следует отметить , что измерение длины личинок с использованием проточной цитометрии обеспечивает длину относительно контрольного образца , в данном случае, вес личинок , а не абсолютной длины в микрометром как для анализа изображений. Это означает, что измерения из независимых экспериментов не можетне быть объединены , если вычисления соотношения размера над мас.
Буфер, используемый для разведения в чашки для образца будет иметь влияние на скорость потока. Мы наблюдали, что буфер оболочка рекомендованных производителем содержит моющее средство, которое увеличивает количество пузырьков, образующихся в процессе получения. Использование M9 буфер, который не содержит моющее средство, значительно уменьшается образование пузырьков, но было менее эффективным в предотвращении осадку яиц в канальцах сортировщик, который влияет на скорость потока проб. Яйцо закупорка легко обнаруживается во время приобретения заметным уменьшением наблюдаемой TOF частиц управления в течение нескольких секунд, после чего повышенной TOF- также в течение нескольких секунд. Яичный закупорка может также привести к закупорке канала и полного задержания потока частиц (менее 5 объектов в секунду). Если это произойдет, нажмите на кнопку ЧИСТОЙ, пока скорость потока не будет восстановлен. Любые измерения, возникающие во время этих событияs должны быть исключены из анализа данных. Оболочка буфера может быть рекомендован для экспериментов с участием штаммов, характеризующихся высоким уровнем мертвых яиц.
Образец и оболочка под давлением (устанавливается на этапе 3.2.3), может изменяться (слегка) в течение долгого времени и должны быть скорректированы вручную в течение всего эксперимента, с тем, чтобы обеспечить очень постоянную скорость потока. Уменьшение или увеличение низкой скорости передачи можно будет наблюдать при анализе результатов и построении тофы частиц управления с течением времени (рис 3C). Снижение скорости потока приведет к увеличению среднего тофы частиц с течением времени, в то время как увеличение скорости потока приведет к противоположному. Изменение скорости потока отрицательно скажется на чувствительность метода в выявлении незначительных различий между размерами популяций личинок.
Методы, направленные на выявление генов, контролирующих относительное удлинение и требующие покадровой записи микроскопии обычно высокиLY отнимает много времени и утомительным, когда фенотипирование несколько генотипов. Проточный цитометр подход на основе, в то время как требует оборудования, не доступной для всех лабораторий, меньше затрат времени и, следовательно, более эффективно, когда несколько штаммов должны быть охарактеризованы. Этот метод также статистически более надежными по сравнению с измерениями с использованием анализа изображения (оцениваемые с помощью t- критерия Стьюдента , сравнивая мутантных и вес TOF распределения; рис 5А и В). Этот метод может быть затем очень хорошо подходит для штаммов, экспрессирующих удлинению дефекты с низкой выразительность / пенетрантностью.
Существует несколько методов с использованием проточной цитометрии были разработаны в прошлом для измерения пригодности нематод 9-12. Эти методы используют животных распределяли в 96-луночные планшеты и модуль микроэллиптического червячного сортировщика '. Reflex модуль позволяет прямой анализ нематод населения распределяемой в 96-луночные планшеты. Следовательно, эти методы могут характеРизе сотни условий в день и представляют собой надежный способ, в котором для измерения пригодности к несинхронизированного населения. Они, однако, не очень хорошо подходит для выявления небольших различий в размерах между синхронному L1. Измерение небольших различий между личинками L1 требует измерения через большое количество животных, что несовместимо с использованием 96-луночных планшетов и модуля Reflex, который может эффективно характеризовать 100 объектов в лучшем случае на лунку. Метод, описанный здесь, предназначен для этой цели за счет пропускной способности, которая значительно снижается. Это позволяет характеристику 3-х до 4 условий в час после того, как прибор калибруется, который является заметным улучшением по сравнению с использованием анализа изображений в протоколе 2.
Измерение соотношения ширины головы и хвоста является первым методом , который был разработан , чтобы охарактеризовать морфогенные процессы , происходящие неравномерно вдоль передне-задней оси эмбриона 7. когдаприменительно к генам, показанными контролировать преждевременное удлинение, эти методы уточнит пространственное распределение сигнальных путей, контролирующих морфогенез на этом этапе. Измерение длины задержанных в развитии личинок с использованием либо анализа изображения или проточной цитометрии в сочетании с измерением длины эмбрионов в конце раннего удлинения позволит идентифицировать гены, контролирующие либо ранний или поздний удлинение или как с высокой чувствительностью и точностью. Эти процедуры могут затем внести существенный вклад в будущем понимание пространственной и временной регуляции сигнальных путей , контролирующих эмбриональное удлинение в С. Элеганс. Кроме того, эти подходы также могут быть адаптированы для изучения сигнальных путей , контролирующих длину тела , такие как инсулин и TGF-бета дорожками 13, 14 и хроническое воздействие загрязнителей окружающей среды 15, 16. Эти измерения могут осуществляться на различных личиночной стадии или у взрослых Усинг незначительные вариации протоколов 2 и различия в размерах 3. Измерение в L1 является более сложной с сортировщика червя, чем более крупные объекты, такие как L3, L4 личинок или взрослых. Протокол 3 затем может быть легко адаптирована для выполнения этих измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (Calcium Chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| Cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| High fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45 ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. Genetics. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J. Methods. Wood, W. B. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
