Abstract
في الآونة الأخيرة، ظهرت أفضلية وضع البيض ذبابة الفاكهة نموذجا لين العريكة وراثيا لدراسة الأساس العصبي للعمليات صنع القرار بسيطة. عند اختيار مواقع لإيداع بيضها، الذباب الإناث قادرة على المرتبة الجاذبية النسبية للخيارات واختيار "أكبر من سلعتين." ومع ذلك، فإن معظم فحوصات تفضيل وضع البيض ليست عملية إذا كان أحد يريد أن يأخذ نهجا الفحص الجيني المنهجي للبحث عن أساس الدوائر الكامنة وراء هذه العملية صنع القرار بسيطة، كما هي وشاقة لانشاء القائمة على السكان. لزيادة الإنتاجية دراسة الأفضليات وضع البيض من الإناث واحدة، وضعنا غرف مخصصة كل علبة تفضيلات وضع البيض الفحص في وقت واحد لمدة تصل إلى ثلاثين فرد الذباب وكذلك البروتوكول الذي يضمن لكل امرأة لديها نسبة وضع البيض عالية (بحيث تفضيلها هو ملحوظ بسهولة وأكثر إقناعا). نهجنا هو بسيط لتنفيذوتعطي نتائج متسقة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تجهيز هذه الغرف مع المرفقات مختلفة للسماح تسجيل فيديو للحيوانات وضع البيض ولتسليم ضوء دراسات علم البصريات الوراثي. وتنص هذه المادة على مخططات لافتعال هذه الدوائر وإجراءات إعداد الذباب إلى أن يعاير في هذه الدوائر.
Protocol
1. إعداد الذباب إلى أن يعاير
- ثقافة الذباب على العسل الأسود القياسية / وسائل الإعلام دقيق الذرة في مجموعة حاضنة عند 25 درجة مئوية والرطوبة 65٪. الحرص على عدم ازدحام قارورة. على سبيل المثال، وضعت 8 إناث و 6 ذكور في قارورة الغذاء الضيقة.
ملاحظة: "قارورة الغذاء الضيقة" المستخدمة هنا ديها قطرها الداخلي 2.3 سم. ونحن عادة الاستغناء عن 10 مل من المواد الغذائية يطير في كل قارورة. ووصف وصفة الطعام ذبابة كنا هنا: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - بعد 3 أيام من الإناث eclosion، وإعداد قارورة مع عجينة الخميرة الطازجة كما هو مبين في الشكل 1E. جعل الطازجة عجينة الخميرة عن طريق خلط 6 غرام من الخميرة النشطة مع 10 مل من حمض proprionic 0.5٪. استخدام ملعقة لتطبيق عجينة الخميرة على جدار من قارورة الغذاء. جمع 30-35 الإناث eclosed جنبا إلى جنب مع 20 - 25 من الذكور في قارورة.
- بشكل عام، وجمع الذكور من نفس قارورة حيث يتم جمع الإناث(وذلك لتوفير الوقت والجهد). ومع ذلك، إذا كان هناك قلق حول خصوبة الذكور، استخدام الذكور WT بدلا من ذلك. أيضا، الخميرة لصق مهم لتحفيز إنتاج البيض ومن ثم إعدادها طازجة يوميا.
- الحفاظ على جمع الإناث / الذكور عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 65٪، إلا الذباب هي درجة الحرارة حساسة.
- بعد ~ 4-5 أيام، والتحقق من قوارير لمعرفة ما اذا الإناث جاهزة للتجارب وضع البيض. انهم مستعدون عند سطح المتوسطة الغذاء الرطب من اليرقات تختبئ بنشاط في الغذاء (انظر الشكل 1E - F).
ملاحظة: الإناث عادة الامتناع عن وضع البيض مرة واحدة يصبح سطح الغذاء الرطب والزحف مع اليرقات. تضمن هذه الخطوة أن الإناث ستكون جاهزة لوضع الكثير من البيض عندما كانت تواجه ركائز مع الملمس المطلوب (على سبيل المثال، ~ 1 الاغاروز٪).
2. غرفة البناء، الجمعية، إعداد الفحص
- لدينا متجر آلة بناء غرف وضع البيض الاكريليك (فايجوري 1A - D). وظهر الرسم الهندسي من قطع مختلفة في الشكل التكميلي 1 - 3 يمكن العثور عليها أيضا صور عالية الدقة هنا (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber٪20design.pdf).
- إدراج الأغطية البلاستيكية إلى تحميل (أعلى) قطعة من الغرفة كما هو مبين في الشكل 1C. وهذا بمثابة السطح السفلي بينما الذباب تحميل في الساحات وضع البيض على حدة.
- تخدير الإناث على وسادة CO 2 وتحميلها بشكل فردي في كل الساحة وضع البيض. سماح ~ 30 دقيقة للذباب للتعافي من CO 2 وتصبح تأقلم مع البيئة الجديدة.
- تحضير ركائز الاغاروز.
- للراحة، والحفاظ على زجاجة ولم يضف من ذاب 1٪ الاغاروز في 55 ° C حمام الماء.
- إضافة المبلغ المطلوب من محلول المخزون السكروز (2 م) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وخلطها مع كمية مناسبة من الاغاروز. على سبيل المثال، لإعداد 150 ملي السكروز الركيزة، جيش التحرير الشعبى الصينىم 750 ميكرولتر من 2 M حل السكروز في أنبوب ثم ملء الأنبوب مع الاغاروز إلى علامة 10 مل.
- إعداد الركيزة سهل بنفس الطريقة ولكن مع إضافة الماء المقطر بدلا من محلول السكروز.
ملاحظة: تركيز النهائي من الاغاروز في هذا البروتوكول هو قليلا أقل من 1٪. في تجربتنا، والتركيز الدقيق الاغاروز لا يهم طالما تسيطر عليه أن يكون في حدود ~ 0،9-1،1٪ وأن ركائز هما من تركيز الاغاروز نفسه.
- خذ قطعة الركيزة (القاع) من الغرفة وماصة 1000 ميكرولتر من الركيزة الأغاروس في كل الحوض كما رأينا في الشكل 1D.
- السماح للالاغاروز لترسيخ ب ~ 30 دقيقة.
- مرة واحدة ركائز الاغاروز والذباب جاهزة، تجميع كل الأجزاء الثلاثة من الغرفة وضع البيض ثم تأخذ بها الأغطية البلاستيكية.
- ضع الدوائر في حاضنات الطاير.
ملاحظة: طول التجارب وضع البيض يمكن أن تختلف تبعا بةاحتياجات rimental. ونحن عادة تشغيل التجربة O / N (14-16 ساعة). أيضا، لم يلاحظ أي تأثير كبير على توقيت الساعة البيولوجية على تفضيلات وضع البيض. - تخدير عن طريق حقن الإناث CO 2 في الغرفة. تفكيك الغرفة، تجاهل الذباب تخدير في مشرحة ذبابة (أي، يمكن للقهوة فارغة مليئة بعض زيت الذرة). التقاط صور من نتائج السجلات (انظر الشكل 2).
- حساب عدد البيض يدويا وحساب مؤشرات تفضيل للتحليل. حساب مؤشر التفضيل (N A - N ب) / (N + N لب) حيث ن أ و ن ب يمثلون عدد من البيض في الموقع موقع مقابل ب، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتتكون غرف وضع البيض من عدة قطع: ركيزة (القاع) قطعة، قطعة المفرق (وسط)، وتحميل (أعلى) قطعة، و 2 أبواب منزلقة (الشكل 1A - D). وتستخدم هذه القطع بشكل مستقل الذباب الإعداد وركائز قبل التجارب وضع البيض. ويبين الشكل 1F كيف قارورة ينبغي أن ننظر عند الذباب الإناث على استعداد لوضع البيض. عندما تعطى الذباب الاختيار بين ركيزة واضحة والركيزة التي تحتوي على السكروز، الإناث تفضل بقوة الركيزة سهل لوضع البيض كما هو موضح في الشكل (2).
الشكل 1. غرف وضع البيض والبيض وضع البروتوكول. (A) تجميعها بالكامل البيض -laying غرفة. (ب) قطع مفكك. و: قطعة تحميل (أعلى)، ب: فيقطعة المفرق (وسط)، ج: الركيزة (القاع) قطعة. وتظهر الرسومات الهندسية من هذه القطع في الشكل التكميلي 1 - 3 (C) قطعة تحميل الغرفة. و': الأبواب، و"انزلاق:. القضبان يتم إدراج ورقة من البلاستيك في قطعة تحميل لتكون بمثابة أرضية للحفاظ على الذباب يحمل في مكان ونحن عادة وضع شرائط اللون على حافة الأغطية البلاستيكية (السهم الأحمر). (D) الركيزة (القاع) والمفرق (وسط) قطعة من الغرفة. وتودع الاغاروز إلى أحواض الفردية لتكون بمثابة ركائز وضع البيض (السهام). يحدد الرباعي الساحة وضع البيض لذبابة واحدة. (E ) يوم 0 من الإناث جمع / الذكور في قارورة yeasted (يوم F) 4 - 5 من الإناث جمع / الذكور في قارورة yeasted لاحظ أن اليرقات والكبار الإناث قد أكل أكثر من الخميرة والسطح من المواد الغذائية أصبحت المحتلة من قبل يرقات. الغذاء سطح مبلل الزحف مع يرقات يمنع الإناث من وضع المزيد من البيض في القارورة. (G) تخطيطي تصور بروتوكول لإعداد التجارب سلوك وضع البيض. (الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم)
الذباب الشكل 2. الممثل البيض زرع نتائج الذباب اختيار بين السكروز وركائز عادي. (A) منظر جانبي لنتائج وضع البيض من النوع البري عندما قدمت لهم الاختيار بين السكروز (150 ملم) وركائز واضحة. يحدد خانة واحدة بيضاء الساحة وضع البيض لذبابة واحدة. (ب) أعلى نظرا للنتائج وضع البيض. يحدد خانة واحدة بيضاء الساحة وضع البيض لذبابة واحدة. (ج) مؤشر الأفضلية ( PI) من النوع البري يطير عندما طلب منهم أن يختاروا بين الركيزة التي تحتوي على السكروز وركيزة عادي. يتم احتساب PI لكل أنثى على النحو التالي: (عدد البيض على الركيزة السكروز - عدد البيض على ركائز واضحة) / العدد الكلي للبيض. يشير شريط خطأ SEM. (الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم)
التكميلية الشكل S1 رسومات الهندسية للمقسم وقطعة الركيزة الغرفة. (A - A ") وجهات نظر مختلفة من قطعة ركيزة من الغرفة. (B - B ') وجهات نظر مختلفة من قطعة المفرق الأوسط من الغرفة.د / 53716 / Supplemental1.jpg "على غرار =" FONT-SIZE: 14px؛ خط الطول: 28px؛ "الهدف =" _ فارغة "> (الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف)
التكميلي الشكل S2 رسومات الهندسية لقطعة تحميل من الغرفة. (A - A ') وجهات نظر مختلفة للطبقة العليا من قطعة تحميل الغرفة. (B - B ') وجهات نظر مختلفة من الطبقة السفلى من قطعة تحميل الغرفة (الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف)
التكميلي الشكل S3.
التكميلي الشكل S4. الملحقات والتخصيص من البيض زرع الدوائر. (A) غرف وضع البيض مجهزة بكاميرات لتسجيل الفيديو الذباب خلال التجارب وضع البيض 13. يستخدم Ctrax 14 مع التمديد 12 لتتبع الذباب، ويستخدم عادة MATLAB رمز لرسم مسارات. (ب) إعداد لإلقاء الضوء ركائز وضع البيض مع من ligh أحمر ت. ترتبط المصابيح (1) إلى سائق الصمام (2). يتم التحكم شدة بقيادة متحكم (3). لمزيد من المعلومات حول الكاميرا، نظام توصيل الضوء وتتبع الحيوانات في ظروف الإضاءة غير طبيعية، انظر تشو وآخرون. وشتيرن وآخرون. (C) المصابيح الحمراء (ضوء قبالة) الملحق العلوي من غرف وضع البيض. (D) المصابيح الحمراء (الضوء على) تعلق على أعلى غرف وضع البيض. وعادة ما يتم تعيين كثافة الصمام المصابيح الحمراء لتكون حول 7-10 مللي واط / مم عند استخدام CsChrimson 15 لتنشيط الخلايا العصبية. (E) غرف مجهزة بكاميرات والمصابيح الذباب تسجيل الفيديو أثناء التجارب مع الضوء الأحمر (ضوء قبالة) وضع البيض. (F) غرف وضع البيض مجهزة بكاميرات والمصابيح الذباب تسجيل الفيديو أثناء التجارب مع الضوء الأحمر (الضوء على). (ر: 28px؛ "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الدوائر والبروتوكولات المذكورة هنا لديهم العديد من التحسينات على المقايسات وضع البيض السابقة. أولا، أنها تزيد من الإنتاجية من يعاير تفضيلات من الحيوانات وحيدة بشكل ملحوظ. كل غرفة يمكن فحص 30 من الإناث واحدة ويستغرق أقل من ساعة لاقامة. ثانيا، أنها تزيد من الاتساق في تفضيلات وضع البيض على الطرق السابقة. توحيد أبعاد الساحة، وحجم ركائز وضع البيض، والمسافة بين ركائز يجعل من الاسهل لمقارنة النتائج بين أيام التجريبية المختلفة ومن المجموعات البحثية المختلفة. ثالثا، غرف يمكن تركيبها مع المرفقات لاستيعاب تحليل إضافي واحد يريد مواصلة (الشكل التكميلي 4). على سبيل المثال، عن التحليل السلوكي، وكاميرات الفيديو يمكن تركيبها على الجزء العلوي من غرفة لتسجيل الذباب 7،11-13. الأهم من ذلك، فإن هذا النهج هو تحجيم. هذه الدوائر هي INEX نسبيامتأمل لإنتاج بمساعدة من متجر للآلات. أيضا، فإنه يأخذ عادة العمال المهرة أقل من 2 ساعة لانشاء 5 غرف (150 إناث واحدة) بقيمة المقايسات وضع البيض.
واحدة من أهم العوامل الحاسمة عند دراسة تفضيل وضع البيض من الإناث واحدة هي لضمان أن كل أنثى وتستعد لوضع الكثير من البيض. (A تفضيل "50 مقابل 0 البيض" هو أكثر إقناعا من تفضيل "1 مقابل 0 البيض"). هذا البروتوكول، وعندما تنفذ على الوجه الصحيح، وينبغي أن تسمح الذباب من نوع البرية العادية (كانتون S وw1118) إلى وضع لا يقل عن 50 بيضة / لكل أنثى O / N. وتساهم عدة عوامل في إنتاج الإناث مع ارتفاع معدل وضع البيض. أولا، ينبغي للمرء أن يكون حريصا على عدم overpopulate قارورة / زجاجات عندما زراعة الإناث إلى أن يعاير. الازدحام في كثير من الأحيان تنتج اليرقات الصغيرة، التي من شأنها أن تنمو لتصبح الإناث الصغيرة التي وضع عدد أقل من البيض. ثانيا، ينبغي للمرء التأكد من أن الإناث إلى أن يعاير من الحصول على الكثير من معجون الخميرة عندما تمزج معا خفة دمالذكور ساعة في قارورة الغذاء. فمن المستحسن أن حمض proprionic 0.5٪ بدلا من الماء استخدامها لتحضير عجينة الخميرة لأن حامض proprionic يزيد ليس فقط وضع البيض ولكن يقلل من العدوى الفطرية في قارورة أيضا. ثالثا، ينبغي للمرء أن لا مقايسة الإناث حتى سطح يرقة / الغذاء من الطعام قارورة تبدو مثل الصورة هو مبين في الشكل 1F. إن لم يكن بما فيه الكفاية وضع البيض المحرومة، من شأنه أن الإناث لا تضع العديد من البيض عندما يعاير في الدوائر. أيضا، لاحظ أن قارورة الغذائية المستخدمة هنا هي "قارورة ضيقة". إذا كان أحد يستخدم قارورة بقطر أكبر، يحتاج المرء إلى زيادة عدد الإناث / الذكور إلى وضعها في قارورة بحيث الإناث سيكون جاهزا لأن يعاير في 4-5 أيام.
بينما بروتوكول صفها هنا على وجه التحديد يركز على دراسة الإناث تفضيلات بين السكروز وركائز واضحة، ويمكن تكييفه لدراسة الإناث تفضيل في ظروف أخرى. على سبيل المثال، هذه الدوائر يمكن استخدامها لأساتفضيل الذباب ص "عند اختيار بين الاغاروز أصعب وأكثر ليونة (على سبيل المثال، 1٪ مقابل 1.5٪ الاغاروز)، وكذلك ركائز التي تختلف في العظة حسي كيميائي أخرى (على سبيل المثال، 3٪ حامض الخليك). إذا مزودة الغطاء الذي يحتوي LED لإنارة واحد أو كلا ركائز، وغرفة ويمكن أيضا أن توفر منصة فعالة لإجراء دراسات علم البصريات الوراثي (الشكل التكميلي 4).
وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من هذا الإعداد يسمح أعلى إنتاجية لتحليل التفضيلات وضع البيض ذبابة الفاكهة، لديها بعض أوجه القصور الهامة. أولا، البعد الثابتة للغرف يحد من مرونة الفحص السلوكي. على سبيل المثال، سوف يحتاج المرء لجعل غرف جديدة من أجل اختبار مدى الآخر المعلمات (على سبيل المثال، المسافة بين ركائز) قد تؤثر على تفضيلات وضع البيض من الذباب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام لا يعبر البيئة المعقدة ذبابة الفاكهة لقاء في البرية. ومن النادر جدا أن الذباب سيضطر الى اتخاذ قرار بين الركيزة السكروز النقي مقابل ركيزة واضحة نقية لوضع البيض في الطبيعة. وهكذا في حين لدينا فحص فعال في دراسة الأساس العصبي للمهمة قرار بسيط، يحتاج المرء أن يكون على علم بأن "قرارات" الإناث محددة تجعل في قاعاتنا قد لا تكون ذات صلة ethologically.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
