Abstract
For nylig har æglægning præference for Drosophila opstået som en genetisk medgørligt model til at studere det neurale grundlag af simple beslutningsprocesser. Når du vælger steder at deponere deres æg, kvindelige fluer er i stand til at rangordne de relative tiltrækningskraft deres muligheder og vælge de "største af to varer." Men de fleste æglæggende præference analyser er ikke praktisk, hvis man ønsker at tage en systematisk genetisk screening tilgang til at søge efter kredsløbet grundlag bag denne simple beslutningsproces, da de er populationsbaseret og møjsommelig at sætte op. For at øge gennemløbet af at studere af æglæggende præferencer enkelt hundyr, vi udviklede brugerdefinerede kamre, der hver især kan samtidig assay æglæggende præferencer på op til tredive individuelle flyver samt en protokol, der sikrer hver hun har en høj ægproduktion sats (så deres præference er let mærkbar og mere overbevisende). Vores tilgang er enkel at udføreog producerer meget ensartede resultater. Derudover kan disse kamre udstyres med forskellige redskaber til at tillade videooptagelse de æglæggende dyr og levere lys til optogenetics studier. Denne artikel indeholder planerne for opdigte disse kamre og proceduren for udarbejdelse fluer, der skal analyseres i disse kamre.
Protocol
1. Forberedelse Fluer, der skal analyseres
- Kultur fluer på standard melasse / cornmeal medier hos inkubator sat ved 25 ° C og 65% luftfugtighed. Pas på ikke overcrowd hætteglassene. For eksempel sætte 8 hunner og 6 hanner ind i en smal hætteglas fødevarer.
Bemærk: "smal food hætteglas" anvendes her har en indvendig diameter på 2,3 cm. Vi typisk dispenseres omkring 10 ml flyve mad ind hvert hætteglas. Fluen mad opskrift vi brugte beskrives her: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dage efter hunner eclosion, forberede hætteglas med frisk gær pasta som vist i figur 1E. Lave frisk gær pasta ved blanding af 6 g aktiv gær med 10 ml 0,5% propionsyre. Brug en spatel til at anvende gær pasta på sidevæggen af fødevarer hætteglas. Collect 30 - 35 eclosed hunner sammen med 20 - 25 hanner i hætteglassene.
- Generelt indsamle hannerne fra de samme hætteglas hvor hunnerne indsamles(For at spare tid og kræfter). Men hvis der er bekymring for frugtbarhed hanner, bruge WT hanner i stedet. Også, gær pasta er vigtig for at stimulere ægproduktionen derfor forberede det frisk hver dag.
- Oprethold de indsamlede hunner / hanner ved 25 ° C, 65% fugtighed, medmindre fluer er temperaturfølsomme.
- Efter ~ 4 - 5 dage, tjek hætteglassene at se, om hunner er klar til æglæggende eksperimenter. De er klar, når overfladen af fødevaren medium er våd fra larver aktivt gravende i fødevaren (se Figur 1E - F).
Bemærk: Kvinder typisk tilbageholde æglæggende æg når maden overfladen bliver våd og gennemsøgning med larver. Dette trin sikrer, at hunner ville være klar til at lægge mange æg, når de støder substrater med ønsket tekstur (f.eks., ~ 1% agarose).
2. Afdeling Byggeri, Montage, Assay Setup
- Har en maskinværksted bygge akryl æglæggende kamre (Figur 1A - D). Den engineering tegning af forskellige stykker blev vist i supplerende Figur 1 -. 3 Høj opløsning billeder kan også findes her (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Indsæt plastplader i belastning (øverst) stykke af kammeret som vist i figur 1C. Dette tjener som den nederste overflade under lastning flyver i individuelle æglæggende arenaer.
- Bedøver hunner på en CO2-pad og indlæse dem individuelt i hvert æg-æglæggende arena. Tillad ~ 30 min for fluer til at inddrive fra CO 2 og til at blive akklimatiseret til det nye miljø.
- Forbered agarose substrater.
- For nemheds skyld holde en premade flaske smeltet 1% agarose i et 55 ° C vandbad.
- Tilføj den ønskede mængde lager saccharoseopløsning (2 M) i en 50 ml konisk rør og blande det med passende mængde af agarose. For eksempel til fremstilling af 150 mM sucrose substrat, place 750 pi 2 M saccharoseopløsning ind i røret og derefter fylde røret med agarose til 10 ml mærket.
- Forbered sletten substrat på samme måde, men med destilleret vand i stedet for saccharoseopløsning.
Bemærk: Slutkoncentrationen af agarose i denne protokol er lidt mindre end 1%. Det er vores erfaring, er den nøjagtige koncentration af agarose ligegyldigt, så længe det styres til at være inden ~ 0,9 - 1,1%, og at de to substrater er af samme agarose koncentration.
- Tag substratet (nederst) stykke af kammeret og pipetten 1.000 pi agarose substrat til hvert trug, som det ses i figur 1D.
- Tillad agarose at størkne for ~ 30 min.
- Når agarose substrater og fluer er klar, samle alle tre stykker af æglægning kammer og derefter tage ud plast plader.
- Placer kamrene i flyve væksthuse.
Bemærk: Længden af æglæggende eksperimenter kan variere afhængigt af experimental behov. Vi typisk køre eksperimentet O / N (14 - 16 timer). Desuden blev der ikke observeret nogen signifikant effekt af døgnrytmen timing på æglæggende præferencer. - Bedøver hunner ved at indsprøjte CO2 ind i kammeret. Skil kammeret, kassere de bedøvede fluer i flue lighuset (dvs.., Kan en tom kaffe fyldt med nogle majsolie). Tag billeder af resultaterne for recordkeeping (se figur 2).
- Tæl antallet af æg manuelt og beregne præference indeks til analyse. Beregn præference indeks som (N a - N b) / (N a + N b) hvor N a og N b repræsenterer antallet af æg på stedet et vs. websted b hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De æggelæggende kamre er sammensat af flere stykker: et substrat (nederst) stykke, en deler (midten) stykke, en belastning (øverst) stykke, og 2 skydedøre (figur 1A - D). Disse stykker bruges til selvstændigt setup fluer og substrater før æglæggende eksperimenter. Figur 1F viser, hvordan hætteglas skal se ud, når kvindelige fluer er klar til æglægning. Når fluer får et valg mellem en almindelig substrat og et saccharose-substrat, hunner robust foretrukket sletten substrat for æglægning som vist i figur 2.
Figur 1. Æglæggende Chambers og æglægning protokol. (A) Færdigmonteret æg -laying kammer. (B) demonteres stykker. a: lastning stykke (top), B:divider stykke (midten), c: substratet (nederst) stykke. Konstruktionstegninger af disse stykker er vist i supplerende Figur 1 -. 3 (C) Belastningen stykke af kammeret. en ": skydedøre, en":.. skinner De plastplader indsættes i lastning brik til at fungere som et gulv til at holde de indlæste fluer på plads Vi typisk sætte farve bånd på kanten af plastplader (rød pil). (D) substratet (nederst) og opdeler (midten) stykker af kammeret. Agarose er deponeret i individuelle trug til at tjene som æglæggende substrater (pile). firkant skitserer æglægning arena for en enkelt flue. (E ) Dag 0 af indsamlede hunner / mænd i en yeasted hætteglas (F) Dag 4 -.. 5 af indsamlede hunner / mænd i en yeasted hætteglas Bemærk at larver og voksne hunner har spist det meste af gæren og overfladen af fødevaren er blevet besat af larver. Den våde overflade fødevarer gennemsøgning med larver forhindrer hunner fra æglæggende flere æg i hætteglasset. (G) Skematisk skildrer protokollen for opsætning af æglæggende adfærd eksperimenter. (Klik her for at se en større version af dette tal)
Figur 2. Repræsentant æglæggende Resultater for Fluer Valg mellem Saccharose og Plain Substrater. (A) Side visning af æglæggende resultater af vildtype fluer, da de fik et valg mellem saccharose (150 mM) og almindelig underlag. Hvid kasse skitserer en æglægning arena for en enkelt flue. (B) set fra oven æglæggende resultater. Hvid kasse skitserer en æglægning arena for en enkelt flue. (C) Preference indeks ( PI) af vildtype flyver, når bedt om at vælge mellem en saccharose-substrat og en almindelig substrat. PI for hver hun beregnes på følgende måde: (antal æg på saccharosesubstrat - antal æg på sletten substrater) / samlede antal æg. Fejl bar indikerer SEM. (Klik her for at se en større version af dette tal)
Supplerende Figur S1 Engineering Tegninger til den Divider og substratet Piece af mødesalen.. (A - A ") Forskellige visninger af substratet stykke af kammeret. (B - B ') Forskellige udsigt over midten divider stykke af kammeret.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (klik her for at downloade denne fil)
Supplerende Figur S2 Engineering Tegninger til lastning Piece af mødesalen.. (A - A ') Forskellige visninger af det øverste lag af lastning stykke af kammeret. . (B - B ') Forskellige visninger af det nederste lag af lastning stykke af kammeret (Klik her for at downloade denne fil)
Supplerende Figur S3.
Supplerende Figur S4. Tilbehør og Tilpasning af æglægning Chambers. (A) Æglæggende kamre udstyret med kameraer til videooptagelse flyver under æglæggende eksperimenter 13. Ctrax 14 med forlængelse 12 bruges til at spore de fluer og brugerdefinerede MATLAB kode bruges til at plotte baner. (B) Setup til at belyse æglæggende substrater med rød ligh t. LEDs (1) er forbundet med en LED-driver (2). LED intensitet styres af mikrocontroller (3). For mere information om kameraet, lys delivery system og sporing af dyr i unormale lysforhold, se Zhu et al. og Stern et al. (C) Røde lysdioder (lys fra) fastgjort til toppen af æglæggende kamre. (D) Røde lysdioder (lys på) er fastgjort til toppen af æglæggende kamre. LED intensitet af røde lysdioder er typisk indstillet til at være omkring 7 - 10 pW / mm, når CsChrimson 15 anvendes til at aktivere neuronerne. (E) æglæggende kamre udstyret med kameraer og lysdioder til video rekord fluer under eksperimenter med rødt lys (lys slukket). (F) Æglæggende kamre udstyret med kameraer og lysdioder til video rekord fluer under eksperimenter med rødt lys (lys). (t: 28px; "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kamrene og protokoller, der er beskrevet her, har flere forbedringer i forhold til tidligere æglæggende analyser. Første, de øger gennemløbet til analyse præferencer af enkelte dyr betydeligt. Hvert kammer kan analysere 30 enlige kvinder, og det tager mindre end en time at sætte op. For det andet, de øger sammenhængen i de æglæggende præferencer i forhold til tidligere metoder. Standardiseringen af dimensionerne af arenaen, størrelsen af de æglæggende substrater, og afstanden mellem underlag gør det lettere at sammenligne resultaterne mellem forskellige eksperimentelle dage og fra forskellige forskergrupper. For det tredje kan kamrene udstyres med vedhæftede filer til at rumme yderligere analyse man ønsker at forfølge (Supplerende figur 4). For eksempel til adfærdsanalyse, videokameraer kan fastgøres til toppen af kammeret for at optage fluerne 7,11-13. Vigtigst er det, denne tilgang er skalerbar. Disse kamre er relativt inexeftertænksom at producere ved hjælp af et maskinværksted. Også, det typisk tager en faglært arbejder mindre end 2 timer til at oprette 5 kamre (150 enlige kvinder) værd af æglæggende analyser.
En af de mest kritiske faktorer, når studerer æglægning præference for enkelt hundyr er at sikre, at hver hun primes til at lægge mange æg. (En præference for "50 vs. 0 æg" er langt mere overbevisende end en præference for "1 vs. 0 æg"). Denne protokol, når korrekt udført, bør tillade regelmæssige vildtype fluer (Canton S og w1118) at lægge mindst 50 æg / pr kvindelige O / N. Flere faktorer bidrager til at producere kvinder med høj æglægning sats. Først bør man sørge for at ikke overpopulate hætteglas / flasker når dyrkning hunnerne, der skal analyseres. Overbelægning ofte producerer mindre larver, som ville vokse i mindre hunner, der lægger færre æg. For det andet bør man sørge for, at kvinder, der skal analyseres, har adgang til masser af gær pasta når de sammenblandes with hanner inden for fødevare- hætteglas. Det anbefales, at 0,5% propionsyre i stedet for vand anvendes til fremstilling af gær pasta fordi propionsyre ikke kun øger æglægning men også reducerer svampeinfektion i hætteglas. For det tredje bør man ikke analysere hunnerne indtil larverne / fødevarer fødevarens overflade hætteglas ligne billedet vist i figur 1F; hvis ikke er tilstrækkeligt æglægning berøvet, ville kvinder ikke lægge så mange æg, når analyseret i kamrene. Bemærk også, at de fødevarer hætteglas der anvendes her er de "smalle hætteglas". Hvis man bruger hætteglas med større diameter, er man nødt til at øge antallet af kvinder / mænd, der skal placeres i hætteglasset, så hunnerne ville være klar til at blive analyseret i 4 - 5 dage.
Mens den her beskrevne specifikt protokol fokuserer på behandlingen hunnernes præferencer mellem saccharose og almindelig substrater, kan det være indrettet til at studere hunner præference under andre forhold. For eksempel kan disse kamre anvendes til ASSAy fluer præference ved valget mellem hårdere og blødere agarose (f.eks., 1% vs. 1,5% agarose), såvel som substrater, der afviger i andre chemosensory stikord (f.eks., 3% eddikesyre). Hvis udstyret med låg, der indeholder LED til at belyse en eller begge substrater, kan kammeret også give en effektiv platform til at gennemføre optogenetic undersøgelser (Supplerende figur 4).
Endelig er det værd at bemærke, at selv om denne opsætning tillader højere gennemløb til analyse æglæggende præferencer Drosophila, det har nogle vigtige begrænsninger. Først, den faste dimension af kamrene begrænser fleksibiliteten af adfærdsmæssige assay. For eksempel vil man nødt til at foretage nye kamre for at teste, hvordan andre parametre (f.eks., Afstand mellem substrater) kan påvirke æglæggende præferencer fluer. Hertil kommer, at dette system ikke fange komplekse miljø Drosophila støder i naturen. Det er meget sjældent, at fluer bliver nødt til at vælge mellem en ren saccharose substrat vs. en ren almindelig substrat for æglægning i naturen. Således mens vores analyse er effektiv i at studere det neurale grundlag af en simpel beslutning opgave, man skal være opmærksom på, at de specifikke "beslutninger" hunner gør i vores kamre kan ikke være ethologically relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
