Abstract
Onlangs, eierleggende voorkeur van Drosophila heeft ontpopt als een genetisch handelbaar model om de neurale basis van eenvoudige besluitvormingsprocessen te bestuderen. Bij het selecteren van sites om hun eieren afzetten, vrouwelijke vliegen in staat zijn om de rangschikking van de relatieve aantrekkelijkheid van hun opties en het kiezen van de "grootste van twee goederen." Echter, de meeste eierleggende voorkeur assays zijn niet praktisch als men wil een systematische genetische screening aanpak om te zoeken naar het circuit basis ten grondslag liggen aan deze eenvoudige besluitvorming, want ze zijn basis van de bevolking en moeizaam op te zetten. Om de doorvoer te verhogen bestuderen van eierleggende voorkeuren van enkele vrouwtjes ontwikkelden wij aangepaste kamers die elk kunnen tegelijkertijd assay-eierleggende voorkeur tot dertig individuele vliegen en een protocol dat ervoor zorgt elk vrouwtje een hoge eierleggende rate (zodat hun voorkeur gemakkelijk waarneembaar en overtuigender). Onze benadering is eenvoudig uit te voerenen geeft zeer consistente resultaten. Bovendien kunnen deze kamers zijn voorzien van verschillende hulpstukken om de video opname leg dieren en licht leveren voor optogenetics studies. Dit artikel bevat de blauwdrukken voor het vervaardigen van deze kamers en de procedure voor het bereiden van de vliegen te worden getest in deze kamers.
Protocol
1. Voorbereiding Flies te worden getest
- Cultuur vliegt op standaard melasse / maïsmeel media op incubator ingesteld op 25 ° C en 65% luchtvochtigheid. Zorg ervoor dat de flesjes niet overladen. Bijvoorbeeld, zet 8 vrouwen en 6 mannen in een smalle voedsel flacon.
Opmerking: De "narrow eten flesje" hier wordt gebruikt heeft een inwendige diameter van 2,3 cm. Wij doorgaans verdeeld over 10 ml vlieg voedsel in elk flesje. De vlieg voedsel recept we gebruikten is hier beschreven: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2-3 dagen na verpopping vrouwen, bereid flesjes met verse gistpasta zie figuur 1E. Voeg verse gist pasta door het mengen van 6 g actieve gist met 10 ml 0,5% propionzuur. Gebruik een spatel om de gistpasta toepassing op de zijwand van het eten flesjes. Verzamel 30-35 Bijlage In vrouwtjes samen met 20 - 25 mannen in de flesjes.
- In het algemeen is het verzamelen van de mannetjes van de zelfde flesjes waar de vrouwtjes worden verzameld(Om tijd en moeite te besparen). Indien er bezorgdheid over de vruchtbaarheid van mannelijke Gebruik WT mannetjes plaats. Ook gistpasta is belangrijk om het eierproductie daarom dagelijks vers bereid.
- Handhaaf de verzamelde vrouwtjes / mannetjes bij 25 ° C, 65% vochtigheid, tenzij de vliegen temperatuurgevoelig zijn.
- Na ~ 4-5 dagen, controleer dan de flesjes om te zien of vrouwtjes zijn klaar voor eierleggende experimenten. Ze zijn klaar wanneer het oppervlak van het voedsel medium is nat van larven actief gravende in het eten (zie figuur 1E - F).
Opmerking: De vrouwtjes meestal weigeren eieren leggen zodra het eten oppervlak nat en kruipen met larven wordt. Deze stap zorgt ervoor dat vrouwen klaar om te veel eieren te leggen wanneer ze substraten met een gewenste textuur zouden komen (bv., ~ 1% agarose).
2. Chamber Bouw, Vergadering, Assay Setup
- Heeft u een machine winkel te bouwen acryl-eierleggende kamers (Figuur 1A - D). De technische tekening van de verschillende stukken werden getoond in Aanvullende Figuur 1 -. 3 Hoge resolutie foto's kunnen ook hier te vinden (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Invoegen kunststof vellen in lading (bovenste) deel van de kamer zoals getoond in figuur 1C. Dit dient als de onderkant tijdens het laden vliegt in individuele eierleggende arena's.
- Verdoven vrouwtjes op een CO 2 pad en laad ze afzonderlijk in elk eierleggende arena. Laat ~ 30 min voor vliegen om te herstellen van de CO 2 en raken gewend aan de nieuwe omgeving.
- Bereid de agarose substraten.
- Voor het gemak, houdt een premade fles gesmolten 1% agarose in een 55 ° C waterbad.
- Voeg de gewenste hoeveelheid voorraad sucrose oplossing (2 M) in een 50 ml conische buis en mengen met geschikte hoeveelheid agarose. Bijvoorbeeld, de 150 mM sucrose substraat bereiden place 750 ul van 2 M sucrose-oplossing in de buis en vervolgens de buis te vullen met agarose aan de 10 ml markering.
- Bereid de vlakte substraat op dezelfde manier, maar voeg gedistilleerd water in plaats van sucrose-oplossing.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van agarose in dit protocol iets minder dan 1%. In onze ervaring, is de precieze concentratie van agarose niet zo lang uit als het wordt geregeld om binnen ~ 0,9-1,1% en dat de twee substraten van dezelfde concentratie agarose.
- Neem het substraat (onder) deel van de kamer en pipetteer 1000 pi agarose substraat in elke trog zoals in figuur 1D.
- Sta agarose stollen gedurende ~ 30 minuten.
- Nadat de agarose substraten en vliegen zijn klaar, assembleren alle drie stukken van de eierleggende kamer en neem dan de plastic vellen.
- Plaats de kamers in vlieg incubators.
Opmerking: De lengte van eierleggende experimenten kunnen variëren, afhankelijk van ervaproefgroepen behoeften. Wij doorgaans het experiment O / N (14-16 uur). Ook, geen significante impact van de circadiane timing on-eierleggende voorkeuren werd waargenomen. - Verdoven vrouwtjes door het injecteren van CO 2 in de kamer. Demonteer de kamer, gooi de verdoofde vliegen in fly lijkenhuis (bijv., Kan een lege koffie gevuld met een aantal maïsolie). Neem foto's van de resultaten voor het bijhouden van gegevens (zie figuur 2).
- Handmatig tellen het aantal eieren en bereken voorkeur indices voor analyse. Bereken voorkeur index als (N a - N b) / (N a + N b) waarbij N a en N b vertegenwoordigen aantal eieren op de site van een vs. plaats b, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eierleggende kamers zijn samengesteld uit verschillende stukken: een substraat (bodem) stuk, een verdeler (midden) stuk, een belasting (top) stuk, en 2 schuifdeuren (Figuur 1A - D). Deze stukken worden gebruikt om zelfstandig setup vliegen en substraten voor eierleggende experimenten. Figuur 1F toont hoe flacons moeten uitzien als vrouwtjes klaar zijn voor eieren leggen. Wanneer vliegen kiezen tussen een effen ondergrond en sucrose bevattend substraat worden gegeven vrouwtjes krachtig voorkeur het vlakke substraat voor leg zoals getoond in figuur 2.
Figuur 1. eierleggende Chambers en leg Protocol. (A) Compleet gemonteerd ei -laying kamer. (B) Disassembled stukken. a: het laden stuk (top), b: dedivider piece (midden), c: het substraat (bodem) stuk. Technische tekeningen van deze stukken worden getoond in Aanvullende Figuur 1 -. 3 (C) Het laden stuk van de kamer. a ': schuifdeuren, een ":.. rails de kunststofplaten worden in de lade stuk te dienen als een woord aan het geladen vliegen zijn plaats te houden typisch zetten we kleur tapes op de rand van de kunststof vellen (rode pijl). (D) het substraat (onder) en de verdeler (midden) delen van de kamer. Agarose wordt gestort in afzonderlijke goten om als leg substraten (pijlen). Quadrilateral worden de leg arena voor een vlieg. (E ) Dag 0 verzamelde vrouwen / mannen in een yeasted flacon (F) Dag 4 -.. 5 verzamelde vrouwen / mannen in een yeasted flacon NB larven en volwassen vrouwen hebben de meeste van de gist en het oppervlak van het voedsel gegeten geworden bezet door larven. De natte ondergrond eten krioelt van de larven voorkomt dat vrouwen uit leggen meer eieren in de flacon. (G) Schematische afbeelding van het protocol voor het opzetten van eierleggende gedrag experimenten. (Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te zien)
Figuur 2. Representatieve leg Resultaten voor Flies Kiezen tussen sucrose en Plain substraten. (A) Zijaanzicht van de eierleggende resultaten van wild type vliegt als ze een keuze tussen sucrose (150 mm), platte substraten werden gegeven. Witte doos schetst één-eierleggende arena voor een vlieg. (B) Bovenaanzicht van de eierleggende resultaten. Witte doos schetst één-eierleggende arena voor een vlieg. (C) Voorkeur index ( PI) van wild type vliegt wanneer u wordt gevraagd te kiezen tussen een sucrose bevattend substraat en een effen ondergrond. - / Totaal aantal eieren (aantal eieren op de vlakte substraten aantal eieren op sucrose substraat): PI voor elk vrouwtje wordt als volgt berekend. Fout balk geeft SEM. (Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te zien)
Aanvullende Figuur S1 Technische tekeningen voor de deler en het substraat Piece van de Kamer.. (A - A ") Verschillende meningen van het substraat stuk van de kamer. (B - B ') Verschillende uitzicht op het midden divider stuk van de kamer.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Klik hier om dit bestand te downloaden)
Aanvullende Figuur S2 Technische tekeningen voor het laden Piece van de Kamer.. (A - A ') Verschillende meningen van de bovenste laag van de lading stuk van de kamer. . (B - B ') Verschillende meningen van de onderste laag van de lading stuk van de kamer (Klik hier om dit bestand te downloaden)
Aanvullende Figuur S3.
Aanvullende Figuur S4. Accessoires en Customization van Egg leggen Chambers. (A) eierleggende kamers uitgerust met camera's om video opname vliegt tijdens eierleggende experimenten 13. Ctrax 14 met verlenging 12 wordt gebruikt om de vliegen en aangepaste MATLAB code wordt gebruikt om de trajecten plot volgen. (B) Setup eierleggende substraten met rode ligh verlichten t. LEDs (1) zijn verbonden met een LED-driver (2). LED intensiteit wordt geregeld door de microcontroller (3). Voor meer informatie over de camera, licht leveringssysteem en het bijhouden van dieren in abnormale lichtomstandigheden, zie Zhu et al. en Stern et al. (C) Red LED's (licht uit), bevestigd aan de top van eierleggende kamers. (D) De rode LED's (light on) bevestigd aan de top van eierleggende kamers. De LED intensiteit van de rode LED wordt typisch ingesteld op ongeveer 7 zijn - 10 uW / mm bij CsChrimson 15 wordt gebruikt om de neuronen activeren. (E) van het ei leggen kamers uitgerust met camera's en LED's om video op te nemen vliegen tijdens experimenten met rood licht (licht uit). (F) eierleggende kamers uitgerust met camera's en LED's om video op te nemen vliegen tijdens experimenten met rood licht (licht op). (t: 28px; "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kamers en protocollen hier beschreven hebben een aantal verbeteringen ten opzichte van vorige eierleggende assays. Ten eerste, ze verhogen de doorzet van testen voorkeur van enkele dieren aanzienlijk. Elke kamer kan assay 30 alleenstaande vrouwen en het duurt minder dan een uur op te zetten. Ten tweede, ze verhogen de consistentie van de eierleggende voorkeuren ten opzichte van eerdere methoden. De standaardisering van de afmetingen van de arena, grootte van de leg substraten, en de afstand tussen de substraten maakt het gemakkelijker om de resultaten te vergelijken tussen verschillende experimentele dagen en van verschillende onderzoeksgroepen. Ten derde kan de kamers voorzien zijn van bevestigingspunten voor aanvullende analyse men wil (aanvullende figuur 4) na te streven tegemoet te komen. Bijvoorbeeld, voor gedragsanalyse, videocamera's worden naar de top van de kamer naar de vliegen 7,11-13 record toegevoegd. Belangrijker, deze benadering is schaalbaar. Deze kamers zijn relatief inexpeinzende te produceren met behulp van een machine winkel. Ook duurt meestal een geschoolde arbeider minder dan 2 uur voor het opzetten van 5 kamers (150 alleenstaande vrouwen) ter waarde van eierleggende assays.
Een van de meest kritische factoren bij het bestuderen van eierleggende voorkeur van de alleenstaande vrouwen is ervoor te zorgen dat elke vrouw wordt opgeleid om veel eieren te leggen. (Een voorkeur voor "50 versus 0 ei" is veel overtuigender dan een voorkeur van "1 vs. 0 ei"). Dit protocol, mits goed uitgevoerd, moeten regelmatig wild-type vliegt (Canton S en w1118) ten minste 50 eieren te leggen / per vrouwelijke O / N mogelijk te maken. Verschillende factoren dragen bij aan de productie van vrouwen met een hoge-eierleggende tarief. Ten eerste moet men zorgen voor niet overpopulate de flesjes / flessen bij het kweken van de vrouwtjes te worden getest. Overbevolking levert vaak kleinere larven, die zou uitgroeien tot kleinere vrouwtjes dat er minder eieren te leggen. Ten tweede moet men ervoor zorgen dat vrouwen moeten worden getest hebben toegang tot tal van gist plakken wanneer ze samen gemengd with mannetjes in het voedsel flesjes. Aanbevolen wordt 0,5% propionzuur in plaats van water gebruikt worden gistpasta bereiden omdat propionzuur verhoogt niet alleen eierleggende maar vermindert schimmelinfectie in flesjes. Ten derde bevat niet de vrouwtjes totdat de larven / voedseloppervlak van het voedsel flesjes lijken de in figuur 1F foto testen; indien niet voldoende leg beroofd, zou vrouwtjes leggen niet zoveel eieren wanneer getest in de kamers. Merk ook op dat het voedsel flacons die hier gebruikt zijn de "smalle flesjes". Gebruikt men injectieflacons met grotere diameter, moet men het aantal vrouwen / mannen in de flacon te plaatsen verhogen zodat de vrouwtjes klaar om te worden getest in 4 zou - 5 dagen.
Hoewel de hier specifiek beschreven protocol onderzoekt vooral vrouwtjes voorkeur tussen sucrose en vlakte substraten, kan worden aangepast om vrouwen studeren 'voorkeur in andere omstandigheden. Zo kunnen deze kamers worden gebruikt ASSAy vliegt 'voorkeur bij de keuze tussen harde en zachte agarose (bijv., 1% versus 1,5% agarose), en substraten die verschillen chemosensory andere signalen (bv., 3% azijnzuur). Indien uitgerust met deksel bevat die leiden aan een of beide substraten verlichten, kan de kamer ook een efficiënte platform optogenetic studies (aanvullend figuur 4) te voeren.
Tenslotte zij opgemerkt dat, hoewel deze opstelling laat hogere doorvoersnelheid voor het analyseren leg voorkeuren van Drosophila, het heeft enkele belangrijke beperkingen. Ten eerste, de vaste afmetingen van de kamers beperkt de flexibiliteit van de gedrags assay. Zo zal men moeten nieuwe kamers maken om te testen hoe andere parameters (bijv., De afstand tussen de substraten) kan leg voorkeuren vliegen beïnvloeden. Bovendien is dit systeem niet de complexe omgeving Drosophila tegenkomen in het wild vangen. Het is zeer zeldzaam dat vliegt zal moeten beslissen tussen een pure sucrose substraat ten opzichte van een pure vlakte substraat voor leg in de natuur. Dus terwijl onze test is efficiënt in het bestuderen van de neurale basis van een eenvoudig besluit taak, moet men zich ervan bewust dat de specifieke "besluiten" vrouwtjes in onze kamers kunnen niet ethologisch relevant zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
