Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט Published: March 24, 2016 doi: 10.3791/53716
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Pharmacology, Duke University
* These authors contributed equally

Abstract

לאחרונה, העדפת הטלה של תסיסנית התפתחה כמודל צייתן גנטי ללמוד את הבסיס העצבי של תהליכי קבלת החלטות פשוטים. בעת בחירת אתרים מטילים את ביציהן, נקבות זבוב מסוגל בדירוג האטרקטיביות היחסית של האופציות שלהם ובחירת "יותר משני מוצרים." עם זאת, מבחני ההעדפה ביותר ההטלה אינם מעשיים אם רוצה לנקוט בגישת סריקה גנטית שיטתית לחיפוש הבסיס המעגל שבבסיס תהליך קבלת החלטות פשוט זו, כפי שהן מבוססות על אוכלוסייה ומייגעת להקים. כדי להגדיל את התפוקה של הלימוד של העדפות הטלה של נקבות אחת, פתחנו תאי מנהג שכל יכול העדפות assay בו זמנית הטלה של עד שלושים פרט עפו כמו גם פרוטוקול המבטיח לכל נקבה יש שיעור גבוה הטלה (כך העדפתם היא להבחין בקלות ועוד משכנע). הגישה שלנו היא פשוטה לביצועומייצר תוצאות מאוד עקביות. בנוסף, החדרים האלה יכולים להיות מצוידים עם קבצים מצורפים שונים כדי לאפשר ווידאו הקלטת חי ההטלה, וכדי לספק אור ללימודי optogenetics. מאמר זה מספק את השרטוטים בודים תאים אלה ואת הליך הכנת הזבובים להיות assayed בתאים אלה.

Protocol

1. הכנת זבובים להיות assayed

  1. תרבות עפה על מולסה הסטנדרטי / מדיה קמח תירס בבית החממה נקבעה על 25 מעלות צלזיוס ו -65% לחות. תשמור על עצמך כדי לא לגדוש הצלוחיות. לדוגמא, לשים 8 נקבות ו 6 זכרים לתוך בקבוקון מזון צר.
    הערה: "בקבוקון מזון צר" משמש כאן יש בקוטר פנימי של 2.3 ס"מ. אנחנו בדרך כלל לוותר על 10 מ"ל של אוכל לטוס לתוך בקבוקון אחד. המתכון אוכל לטוס השתמשנו מתואר כאן: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html.
  2. 2 - 3 ימים לאחר eclosion הנקבות, להכין צלוחיות עם רסק שמרים טריים כפי שמוצג באיור 1E. הפוך רסק שמרים טריים ידי ערבוב 6 גרם של שמרים פעילים עם 10 מ"ל של חומצה proprionic 0.5%. להשתמש במרית להחיל את הרסק שמרים על הדפנות של צלוחיות המזון. אסוף 30 - 35 נקבות eclosed יחד עם 20 - 25 זכרים לתוך צלוחיות.
    1. באופן כללי, לאסוף זכרים מאותו הבקבוקונים שבו הנקבות נאספות(כדי לחסוך זמן ומאמץ). עם זאת, אם קיים חשש לגבי הפוריות של גברים, להשתמש זכרי WT במקום. כמו כן, רסק שמרים חשוב מגרה ייצור ביצים ולכן להכין אותו טרי מדי יום.
  3. לשמור על נקבות / זכרים שנאספו על 25 מעלות צלזיוס, 65% לחות, אלא אם הזבובים הם טמפרטורה רגישה.
  4. לאחר ~ 4 - 5 ימים, לבדוק את הבקבוקונים כדי לראות אם נקבות מוכנות לניסויי הטלה. הם מוכנים כאשר השטח של המדיום מזון רטוב מן הזחלים נבירה פעיל בתחום המזון (ראה איור 1E - F).
    הערה: נקבות בדרך כלל לעכב ביצים שתחזינה השטח האוכל הופך להיות רטוב בהם זחלים. צעד זה מבטיח כי נקבות תהיינה מוכנות להטיל ביצים רבות כאשר הם נתקלים מצעים עם מרקם רצוי (למשל., ~ 1% agarose).

2. בנייה קאמרית, הרכבה, התקנת Assay

  1. יש חנות מכונית לבנות תאי אקריליק הטלה (אלחוטיאיור 1 א - ד). ציור ההנדסה של חלקים שונים הוצג משלים איור 1 -. 3 תמונות באיכות גבוהה ניתן למצוא גם כאן (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
  2. הכנס יריעות פלסטיק לתוך טעינה (למעלה) חתיכה של החדר כפי שמוצג באיור 1C. זה משמש את המשטח התחתון בזמן טעינת זבובים לתוך זירות ההטלה הפרט.
  3. להרדים נקבות על כרית CO 2 ומעלה אותם בנפרד לתוך אחד ממרכיבי הטלה. אפשר ~ 30 דקות לזבובים להתאושש CO 2 ולהפוך הסתגלו לסביבה החדשה.
  4. הכן את מצעי agarose.
    1. לנוחיותכם, להחזיק בקבוק התערובת של העוגיות של agarose 1% נמס בתוך אמבט מים 55 מעלות צלזיוס.
    2. מוסיפים את הכמות הרצויה של תמיסת סוכרוז המניות (2 מ ') לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו לערבב אותו עם כמות מתאימה של agarose. לדוגמה, כדי להכין את המצע סוכרוז 150 מ"מ, PLAce 750 μl של 2 M תמיסת סוכרוז לתוך הצינור ואז למלא את הצינור עם agarose אל 10 מ"ל סימן.
    3. מכין את המצע הרגיל באותו אופן, אלא להוסיף מים מזוקקים במקום תמיסת סוכרוז.
      הערה: הריכוז הסופי של agarose בפרוטוקול זה הוא מעט פחות מ -1%. מניסיוננו, הריכוז המדויק של agarose לא משנה כל עוד היא נשלטת להיות בתוך ~ 0.9 - 1.1%, וכי שני המצעים הם מאותו הריכוז agarose.
  5. קח את המצע (למטה) חתיכה של החדר ואת פיפטה 1,000 μl של המצע agarose לתוך כל שוקת כפי שניתן לראות באיור 1D.
  6. אפשר agarose כדי לחזק עבור ~ 30 דקות.
  7. לאחר המצעים וזבובי agarose מוכנים, להרכיב את כל שלוש החתיכות של חדר ההטלה ולאחר מכן להוציא את יריעות הפלסטיק.
  8. מניח את התאים באינקובטורים זבוב.
    הערה: אורך של ניסויי הטלה יכול להשתנות בהתאם expeהצרכים rimental. אנחנו בדרך כלל להפעיל את הניסוי O / N (14 - 16 שעות). כמו כן, אין השפעה משמעותית של עיתוי יממה על העדפות הטלה נצפתה.
  9. להרדים נשים על ידי הזרקת CO 2 לתוך התא. לפרק את התא, לבטל את הזבובים הרדימו לתוך מתי זבוב (כלומר., מקפה ריק יכול מלא מעט שמן תירס). צלמו תמונות של התוצאות עבור ניהול ספרים (ראה איור 2).
  10. ספירת הביצים ידנית ולחשב מדדי העדפה לניתוח. חישוב מדד העדפה לגבי (N א - N ב) / (N א ב + N) שבו N ו- B N לייצג מספר הביצים באתר א ב האתר לעומת, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי ההטלה מורכבים מכמה חתיכות: חתיכת מצע (למטה), מחיצה (באמצע) חתיכה, חתיכת טעינה (למעלה), ו -2 דלתות זזות (איור 1 א - ד). יצירות אלה משמשות זבובי התקנה באופן עצמאיים מצעים לפני ניסויי הטלה. איור 1F מראה כיצד בקבוקונים צריכים להיראות כאשר נקבות זבוב מוכנים-הטלה. כאשר זבובים מקבלים בחירה בין מצע פשוטו מצע המכיל סוכרוז, נקבות וחסונות עדיף המצע הרגיל עבור הטלה כפי שמוצג באיור 2.

איור 1
איור 1. צ'יימברס הטלה ו הטלת הפרוטוקול. (א) באופן מלא התאספה ביצת -laying קאמרית. (ב) חתיכות מפורקות. ת: יצירת הטעינה (למעלה), ב ':חתיכת מחיצה (באמצע), ג: מצע החתיכה (למטה). שרטוטים הנדסיים של יצירות אלה מוצגים משלים איור 1 -. 3 (ג) חתיכת הטעינה של החדר. א ': דלתות זזות, א':.. מסילות את יריעות הפלסטיק מוכנסות לתוך חתיכת טעינת לשמש רצפה כדי לשמור על הזבובים הטעונים במקום בדרך כלל שמינו קלטות צבע על הקצה של יריעות הפלסטיק (חץ אדום). (ד) המצע (למטה) ואת המחיצה (באמצע) חתיכות של החדר. Agarose מופקדים לתוך שקתות פרט לשמש מצעי הטלה (חיצים). מרובע מתאר בזירת ההטלה עבור זבוב אחד. (E יום) 0 של נקבות שנאספו / זכרים בבקבוקון yeasted (F) יום 4 -.. 5 של נקבות שנאספו / זכרים בבקבוקון yeasted שימו לב נקבות הזחלים בוגרים אכלו רוב השמרים ואת השטח של האוכל הפך שנכבש על ידי זחלים. אוכל המשטח הרטוב בם זחלים מונע נקבות מן להטיל ביצים יותר בבקבוקון. (G) סכמטי המתאר את פרוטוקול הגדרת ניסויי התנהגות הטלה. (אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו)

איור 2
איור 2. נציגי הטלת תוצאות עבור זבובי בחירה בין סוכרוז מישור מצעים. (א) צד לנוכח תוצאות הטלה של סוג בר זבובים כאשר ניתנו להם בחירה בין סוכרוז (150 מ"מ) מצעים רגילים. קופסא לבנה מתארת ​​בזירת הטלה אחד זבוב אחד. (ב) לאור לראש תוצאות ההטלה. קופסא לבנה מתארת ​​בזירת הטלה אחד זבוב אחד. (ג) מדד העדפה ( PI) של סוג בר זבובים כשהתבקש לבחור בין מצע המכיל סוכרוז מצע רגיל. PI לכל נקבה מחושב כדלקמן: (מספר ביצים על מצע סוכרוז - מספר הביצים על המצעים הרגילים) / מספר כולל של ביצים. שגיאת עמודה מציינת SEM. (אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו)

משלים איור 1
S1 איור משלים הנדסת שרטוטים עבור המפריד ואת Piece המצע של הלשכה.. (א - א ') נופים שונים של יצירת המצע של החדר. (B - ב') נופים שונים של היצירה המחלקת באמצע החדר.ד / 53,716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ)

משלים איור 2
S2 איור משלים הנדסת שרטוטים עבור Piece טוען של הלשכה.. (א - א ') תצוגות שונות של השכבה העליונה של יצירת הטעינה של החדר. . (B - ב ') תצוגות שונות של השכבה התחתונה של יצירת הטעינה של החדר (אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ)

משלים איור 3
S3 איור משלים. (א) הרכבת מקובעת החתיכה העליונה של החדר. (ב) דלת הזזה עבור החדר. ( אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ)

משלים איור 4
S4 איור משלים. אבזרים והתאמה אישי של הטלת צ'יימברס. (א) תאי הטלה מצוידים במצלמות כדי להקליט וידאו טס במהלך ניסויי הטלה 13. Ctrax 14 עם סיומת 12 משמש כדי לעקוב אחר זבובי מנהג קוד MATLAB משמש עלילת המסלולים. (ב) הגדיר להאיר מצעי הטלה עם תאורת אדום t. נוריות (1) מחוברות נהג LED (2). עוצמת LED נשלטת על ידי מיקרו-בקר (3). לקבלת מידע נוסף על המצלמה, מערכת מסירת אור וחיות מעקב בתנאי תאורה לא תקינים, רואה ג'ו et al. ושטרן et al. (C) נוריות אדומות (אור כבוי) המצורפות העליון של תאי הטלה. (ד) נוריות אדומות (אור על) מצורפות העליון של תאי הטלה. עוצמת LED של נוריות אדומות מוגדרת בדרך כלל להיות סביב 7 - 10 μW / מ"מ כאשר CsChrimson 15 משמש כדי להפעיל את הנוירונים. (E) הטלה תא מצוידים במצלמות נוריות זבובים להקליט וידאו במהלך ניסויים עם אור אדום (אור כבוי). (F) תאי הטלה מצוידים במצלמות נוריות זבובים להקליט וידאו במהלך ניסויים עם אור אדום (אור על). (t: 28px; "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-500
Sucrose Sigma S0389
Water bath  Fisher 15-462-6Q
LifeCam Cinema webcam Microsoft H5D-00013
Red LEDs Cree C503B-RAN-CA0B0AA1
Egg-laying chambers Custom Built
Camera holders Custom Built
LED holders Custom Built
Fly vials (narrow) Genesee 32-116BC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
  2. Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  3. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
  4. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  5. Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
  6. Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
  7. Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  8. Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
  9. Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
  10. Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
  11. Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
  12. Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
  13. Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
  14. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
  15. Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

Neuroscience גיליון 109, הטלה העדפות ניתוח התנהגות קבלת החלטות העדפת סוכרוז תפוקה גבוהה assay
Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gou, B., Zhu, E., He, R., Stern, U., … More

Gou, B., Zhu, E., He, R., Stern, U., Yang, C. H. High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (109), e53716, doi:10.3791/53716 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter