Abstract
최근 초파리의 알을 낳는 환경 설정은 간단한 의사 결정 과정의 신경 기초를 공부하는 유전자 다루기 쉬운 모델로 떠오르고있다. 알을 증착하는 사이트를 선택하면, 여성의 파리는 옵션의 상대적 매력도 순위와 선택 할 수있다 "큰 두 가지 상품을." 하나는 그들이 인구 기반 및 설정하기 힘든만큼,이 간단한 의사 결정 과정의 기초가되는 회로의 기초를 검색 할 체계적인 유전자 검사 방법을 원하는 경우, 대부분의 알을 낳는 환경 분석은 실용적이지 않다. 한 여성의 알을 낳는 환경의 공부의 처리량을 증가시키기 위해, 우리는 최대 30 개인의 각 수를 동시에 분석 알을 낳는 환경 설정은 각 여성은 높은 알을 낳는 속도가 보장하는 프로토콜뿐만 아니라 파리 정의 챔버를 개발 (그래서 선호 쉽게 식별 할 더 설득력 있음). 우리의 접근 방식은 실행이 간단매우 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 이러한 챔버는 비디오가 알을 낳는 동물을 기록하고 optogenetics의 연구에 빛을 제공 할 수 있도록 다른 첨부 파일을 장착 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이러한 챔버에서 분석 할 수있는 파리를 준비 이러한 챔버 및 절차를 제조하기위한 청사진을 제공합니다.
Protocol
파리 준비 1.있는 분석한다
- 문화 표준 당밀에 파리 / 25 ° C 및 65 % 습도에서 설정 인큐베이터에서 옥수수 가루 미디어. 유리 병을 혼잡하게하지 않도록주의하십시오. 예를 들어, 좁은 식품 유리 병에 8 명의 여성과 6 명의 남성을 넣어.
주 : 여기에서 사용 된 "식품 좁은 병"은 2.3 cm의 내경을 갖는다. 우리는 일반적으로 각각의 유리 병에 플라이 음식의 약 10 ml의 분배. 우리가 사용하는 플라이 음식의 조리법은 여기에 설명되어 있습니다 http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 그림 1E에 도시 된 바와 같이, 삼일 여성의 우화 후, 신선한 효모 붙여 넣기와 유리 병을 준비합니다. 0.5 % proprionic 산 10 ml의 활성 효모 6g을 혼합하여 신선한 효모 붙여 넣기를합니다. 식품 유리 병의 측벽에 효모 페이스트를 적용 할 주걱을 사용합니다. 유리 병에 25 명의 남성 - 20 35 eclosed 여성 함께 - 30 수집합니다.
- 일반적으로, 여성은 수집 동일한 튜브에서 수집 수컷(수 있도록 시간과 노력을 절약하기 위해). 수컷의 생식 능력에 대한 우려가있는 경우에는, WT 대신 수컷을 사용한다. 또한, 효모 붙여 넣기 신선한 매일을 준비 따라서 달걀 생산을 자극하는 것이 중요합니다.
- 파리 온도 민감하지 않는 한, 25 ° C, 65 % 습도에서 수집 된 여성 / 남성을 유지한다.
- 4 ~ 후 - 오일, 암컷이 알을 낳는 실험 준비가되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 확인합니다. 식품 매체 표면 적극적 음식내는 유충 젖은 때 준비 (- F도 1E 참조).
참고 : 식품 표면이 젖어 유충으로 크롤링하게되면 암컷은 일반적으로 누워 계란을 보류. 이 단계는 암컷이 그들이 원하는 텍스처와 기판가 발생할 때 많은 알을 낳기 할 준비가되어있을 것이라는 점을 보장한다 (예., ~ 1 % 아가로 오스).
2. 상공 회의소 건설, 조립, 분석 설정
- (컴퓨터 가게 아크릴 알을 낳는 챔버를 구축 Fi 인터넷이gure의 1A - D). 다른 조각의 엔지니어링 도면을 보충 그림 1에 나타낸다 -. 3 고해상도 사진은 여기에서 찾을 수 있습니다 (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- 도 1c에 도시 된 바와 같이 챔버의 로딩 (위) 부재에 플라스틱 시트를 삽입한다. 로드 개별 알을 낳는 경기장에 날아 동안이 바닥면 역할을합니다.
- 공동 2 패드에 여성을 마취하고 각 알을 낳는 경기장에 개별적으로로드합니다. 파리는 CO 2를 복구하고 새로운 환경에 적응 될하기위한 ~ 30 분을 허용합니다.
- 아가로 오스 기판을 준비합니다.
- 편의를 위해 55 ° C의 물을 욕조에 녹아 1 % 아가로 오스의 미리 만들어진 병을 유지합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 재고 자당 용액 (2 M)의 원하는 금액을 추가하고 아가로 오스의 적절한 양을 혼합. 예를 들어, 150 mM의 수크로오스 기판 PLA를 제조CE는 750 튜브에 2 M 자당 솔루션의 μL 후 10 ml의 표시로 아가로 오스와 튜브를 입력합니다.
- 동일하게 일반 기판을 준비하는 대신 자당 용액에 증류수를 추가한다.
참고 :이 프로토콜의 아가로 오스의 최종 농도가 약간 1 % 미만이다. 1.1 % 및 두 기판이 같은 아가로 오스 농도의 것을 - ~ 0.9 이내로 제어 우리의 경험에 의하면, 아가로 오스의 정확한 농도는 너무 오래 중요하지 않습니다.
- 그림 1D에서 볼 수 있듯이 각각의 통에 챔버와 피펫 아가로 오스 기판의 1,000 μl를의 기판 (아래) 조각을 가져 가라.
- 아가 ~ 30 분 동안 응고하도록 허용합니다.
- 아가로 오스 기판과 파리 준비가되면 알을 낳는 챔버의 세 조각을 조립 한 후 플라스틱 시트를 꺼내.
- 플라이 인큐베이터에있는 챔버를 놓습니다.
참고 : 알을 낳는 실험의 길이 expe의에 따라 달라질 수 있습니다rimental 필요. (- 16 시간 14) 우리는 일반적으로 실험 O / N을 실행합니다. 또한, 알을 낳는 환경에 주기성 타이밍의 유의 한 효과는 관찰되지 않았다. - 챔버 내에 이산화탄소를 주입하여 마취 여성. 챔버를 분해 플라이 시체 공시 소에 마취 파리를 폐기 (예. 빈 커피는 일부 옥수수 기름 가득 수 있습니다.) 기록 관리에 대한 결과의 사진을 촬영합니다 (그림 2 참조).
- 수동으로 계란의 수를 계산 및 분석을위한 기본 인덱스를 계산합니다. 같은 환경 지표를 계산 (N A - B N) / (A + N의 N b) N N A 및 B는 각각의 사이트에 대 사이트 B를 알의 수를 나타내며.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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