Abstract
Recentemente, a preferência de postura de Drosophila tem emergido como um modelo geneticamente tratável para estudar a base neural dos processos de tomada de decisão simples. Ao selecionar locais para depositar seus ovos, as moscas fêmeas são capazes de classificar a atratividade relativa das suas opções e escolher o "maior dos dois bens." No entanto, a maioria dos ensaios de preferência poedeiras não são práticos quando se quer ter uma abordagem sistemática rastreio genético para procurar a base circuito subjacente a este processo de tomada de decisões simples, como elas são e trabalhoso para configurar base populacional. Para aumentar a taxa de transferência de estudar de preferências de postura de ovos das fêmeas individuais, desenvolvemos câmaras personalizados que cada um pode simultaneamente ensaio preferências de postura de até trinta indivíduo voa, bem como um protocolo que garante a cada fêmea tem uma alta taxa de postura (de modo a que a sua preferência é facilmente discernível e mais convincente). Nossa abordagem é simples de executare produz resultados muito consistentes. Além disso, estas câmaras podem ser equipados com acessórios diferentes para permitir a gravação de vídeo os animais que põem ovos e fornecer luz para estudos optogenética. Este artigo fornece os planos para fabricar estas câmaras e ao processo de preparação das moscas a ser analisadas nestas câmaras.
Protocol
1. Preparar Flies a ser testada
- Cultura voa em melaço padrão / media farinha de milho na incubadora a 25 ° C e 65% de humidade. Tome cuidado para não sobrecarregar os frascos. Por exemplo, colocar 8 mulheres e 6 homens para um frasco de alimentos estreita.
Nota: O "comida frasco estreito" usado aqui tem um diâmetro interno de 2,3 cm. Nós normalmente dispensados cerca de 10 ml de alimentos voar em cada frasco. A receita mosca alimentos que usamos é descrito aqui: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dias após a eclosão do sexo feminino, preparar frascos com pasta de levedura fresca, como mostrado na Figura 1E. Fazer a pasta de levedura fresco por mistura de 6 g de fermento activo com 10 ml de ácido proprionic 0,5%. Usar uma espátula para aplicar a pasta de levedura para a parede lateral dos frascos de alimentos. Colete 30 - 35 fêmeas eclosed juntamente com 20 - 25 machos em frascos.
- Em geral, recolher os machos de as mesmas frascos em que as fêmeas são recolhidos(De forma a poupar tempo e esforço). No entanto, se há uma preocupação com a fertilidade dos machos, use machos WT vez. Além disso, pasta de levedura é importante para estimular a produção de ovos, portanto, prepará-lo diariamente.
- Manter as fêmeas recolhidas / machos a 25 ° C, 65% de humidade, a menos que as moscas são sensíveis à temperatura.
- Depois de ~ 4 - 5 dias, verifique os frascos para ver se as fêmeas estão prontas para experimentos de postura de ovos. Eles estão prontos quando a superfície do meio alimentar está molhado a partir de larvas escavando ativamente na alimentos (ver Figura 1E - F).
Nota: As fêmeas geralmente reter colocar ovos uma vez a superfície do alimento torna-se molhado e cheio de larvas. Essa etapa assegura que as fêmeas estaria pronto para colocar muitos ovos quando se deparam com substratos com textura desejada (por exemplo., ~ 1 agarose%).
2. Câmara de Construção, Montagem, Configuração Assay
- Tem uma loja de máquina construir câmaras poedeiras acrílico (Figura 1A - D). O desenho de engenharia de diferentes peças foram mostrados em Suplementar Figura 1 -. 3 imagens de alta resolução também pode ser encontrada aqui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserir folhas de plástico em carregamento (topo) pedaço da câmara, como mostrado na Figura 1C. Isso serve como a superfície inferior durante o carregamento voa em arenas individuais de postura de ovos.
- Anestesiar fêmeas em uma almofada de CO 2 e carregá-los individualmente em cada arena de postura. Permitir ~ 30 min para as moscas para se recuperar do CO 2 e para se aclimatar ao novo ambiente.
- Prepare os substratos de agarose.
- Por conveniência, manter uma garrafa de premade derretido 1% de agarose, num banho de água a 55 ° C.
- Adicionar a quantidade desejada de solução de sacarose (2 M) em um tubo de 50 ml e misturando-a com a quantidade apropriada de agarose. Por exemplo, para preparar o substrato de sacarose 150 mM, PLAce 750 ul de uma solução 2 M de sacarose para dentro do tubo e, em seguida, encher o tubo com agarose para a marca de 10 mL.
- Prepara-se o substrato liso, da mesma maneira, mas adicionar água destilada em vez da solução de sacarose.
Nota: A concentração final de agarose, este protocolo é ligeiramente inferior a 1%. Na nossa experiência, a concentração exacta de agarose não interessa, desde que ele é controlado para estar dentro de ~ 0,9-1,1% e que os dois substratos são da mesma concentração de agarose.
- Aqui a peça do substrato (em baixo) da câmara de pipeta e 1000 ul de substrato de agarose em cada calha como pode ser visto na Figura 1D.
- Permitir agarose para solidificar para ~ 30 min.
- Uma vez que os substratos de agarose e moscas estão prontos, montar todas as três peças da câmara de postura e em seguida, retire as folhas de plástico.
- Coloque as câmaras em incubadoras de voar.
Nota: O comprimento de experimentos de postura de ovos pode variar dependendo expenecessidades rimental. Nós normalmente executar o experimento O / N (14-16 h). Além disso, não se observou qualquer impacto significativo de temporização circadiana nas preferências de postura de ovos. - Anestesiar fêmeas por injecção de CO 2 para dentro da câmara. Desmontar a câmara, descartar as moscas anestesiadas em necrotério mosca (ie., Um café vazia pode preenchido com um pouco de óleo de milho). Tire fotos dos resultados para manutenção de registros (ver Figura 2).
- Contar o número de ovos manualmente e o cálculo dos índices de preferência para análise. Calcule preferência índice como (N a - N b) / (N a + N b) onde N a e N b representam número de ovos no local um site vs. b, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As câmaras de postura de ovos são compostos de várias peças: um pedaço de substrato (inferior), um pedaço divisor (meio), uma carga (parte superior) peça, e 2 portas de correr (Figura 1A - D). Estas peças são usadas para independentemente moscas configuração e substratos antes experimentos poedeiras. Figura 1F mostra como frascos devem olhar quando as moscas fêmeas estão prontas para postura de ovos. Quando as moscas recebem uma escolha entre um substrato liso e um substrato contendo sacarose, fêmeas robustamente preferido o substrato simples para a postura de ovos, conforme mostrado na Figura 2.
Figura 1. Câmaras de postura e postura de ovos protocolo. (A) de ovo completamente montado -laying câmara. (B) peças desmontado. A: o carregamento peça (topo), b: opeça divisor (meio), c: o substrato (parte inferior) peça. Desenhos de engenharia de estas peças são mostradas na Figura Suplementar 1 -. 3 (C) A peça de carregamento da câmara. a ': portas, um "deslizamento:.. carris As folhas de plástico são inseridos na peça de carga para servir como um piso para manter as moscas carregados no lugar Nós normalmente colocar fitas de cores para a borda das folhas de plástico (seta vermelha). peças da câmara (D) o substrato (inferior) e o divisor (meio). Agarose é depositado em calhas individuais para servir como substratos poedeiras (setas). Quadrilátero descreve a arena de postura para uma única mosca. (e ) Dia 0 das fêmeas / machos em um frasco fermentado recolhidos) Dia (F 4 -.. 5 de fêmeas / machos em um frasco fermentado recolhidos Nota que as larvas e adultos fêmeas têm consumido a maior parte do fermento e a superfície do alimento se tornou ocupada por larvas. A comida superfície molhada cheio de larvas impede as fêmeas de colocar mais ovos no frasco. (G) esquemático que representa o protocolo para a criação de experiências de comportamento de postura de ovos. (Clique aqui para ver uma versão maior desta figura)
Figura 2. Resultados para Moscas Escolhendo entre a sacarose e substratos lisos Representante postura de ovos. (A) Vista lateral dos resultados de postura de tipo selvagem voa quando foi dada uma escolha entre a sacarose (150 mm) e substratos lisos. caixa branca apresenta uma arena de postura para uma única mosca. (B) Vista de cima de resultados de postura de ovos. caixa branca apresenta uma arena de postura para uma única mosca. (C) Índice de Preferência ( PI) do tipo selvagem voa quando solicitado a escolher entre um substrato contendo sacarose e um substrato simples. PI para cada fêmea é calculado da seguinte forma: (número de ovos em substrato sacarose - número de ovos nos substratos lisos) / número total de ovos. Barra de erro indica SEM. (Clique aqui para ver uma versão maior desta figura)
Suplementar Figura S1 desenhos de engenharia para os separadores eo pedaço de substrato da Câmara.. (A - A ") Diferentes vistas da peça substrato da câmara. (B - B ') Diferentes vistas da peça divisor meio da câmara.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Por favor clique aqui para baixar esse arquivo)
Suplementar Figura S2 desenhos de engenharia para o carregamento Pedaço da Câmara.. (A - A ') Diferentes pontos de vista da camada superior da peça de carga da câmara. . (B - B ') Diferentes pontos de vista da camada inferior da peça de carga da câmara (Por favor clique aqui para baixar esse arquivo)
Suplementar Figura S3.
Suplementar Figura S4. Acessórios e Personalização de secção oviposição. Câmaras de postura (A) equipados com câmeras para gravar o vídeo voa durante experimentos poedeiras 13. Ctrax 14 com extensão de 12 é usado para controlar as moscas e personalizado código MATLAB é usado para traçar as trajectórias. (B) Configuração para iluminar substratos poedeiras com ligh vermelho t. Os LEDs (1) estão ligados a um condutor de LED (2). intensidade do LED é controlado pelo microcontrolador (3). Para mais informações sobre a câmera, sistema de fornecimento de luz e animais de rastreamento em condições de iluminação anormais, consulte Zhu et al. e Stern et ai. (C) LEDs vermelhos (luz desligada) ligados à parte superior da câmara de postura de ovos. (D) LEDs vermelhos (luz acesa) anexado ao topo das câmaras de postura de ovos. A intensidade LED de LEDs vermelhos é normalmente definido para ser em torno de 7-10 mW / mm quando CsChrimson 15 é usado para ativar os neurônios. (E) Ovípara câmaras equipadas com câmeras e LEDs para moscas gravar vídeo durante experimentos com luz vermelha (luz desligada). (F) câmaras de postura equipados com câmeras e LEDs para moscas gravar vídeo durante experimentos com luz vermelha (luz acesa). (t: 28px; "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar esse arquivo)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As câmaras e protocolos aqui descritos têm várias melhorias em relação ensaios poedeiras anteriores. Em primeiro lugar, aumentar a taxa de transferência de doseamento preferências dos animais individuais de forma significativa. Cada câmara pode testar 30 fêmeas individuais e leva menos de uma hora de configurar. Em segundo lugar, eles aumentam a consistência das preferências de postura em relação aos métodos anteriores. A padronização das dimensões da arena, o tamanho dos substratos de postura e distância entre substratos torna mais fácil comparar os resultados entre os diferentes dias experimentais e de diferentes grupos de pesquisa. Em terceiro lugar, as câmaras podem ser equipados com acessórios para acomodar uma análise adicional quer para prosseguir (Figura 4 suplementar). Por exemplo, para a avaliação comportamental, câmaras de vídeo pode ser ligado à parte superior da câmara para gravar as moscas 7,11-13. Mais importante ainda, esta abordagem é escalável. Estas câmaras são relativamente INEXpensativo para produzir com a ajuda de uma oficina mecânica. Além disso, ele normalmente leva um trabalhador qualificado menos de 2 horas para configurar 5 câmaras (150 fêmeas solteiras) no valor de ensaios de postura de ovos.
Um dos fatores mais críticos ao estudar a preferência de postura de ovos das fêmeas solteiras é garantir que cada fêmea está preparado para colocar muitos ovos. (A preferência dos "50 vs. 0 ovo" é muito mais convincente do que uma preferência de "1 vs 0 ovo"). Este protocolo, quando bem executada, deve permitir que as moscas do tipo selvagem regulares (Canton S e w1118) para colocar pelo menos 50 ovos / por fêmea O / N. Vários fatores contribuem para a produção de fêmeas com alta taxa de postura. Em primeiro lugar, deve-se tomar cuidado para não overpopulate os frascos / garrafas quando a cultura das fêmeas a ser testada. A superlotação muitas vezes produz larvas menores, o que iria crescer em fêmeas menores que põem menos ovos. Em segundo lugar, deve-se certificar de que as fêmeas a ser testada tem acesso à abundância de pasta de levedura quando misturados with machos nos frascos de alimentos. Recomenda-se que o ácido proprionic 0,5% em vez de água ser utilizada para preparar pasta de levedura porque o ácido proprionic não só aumenta a postura de ovos, mas também reduz a infecção fúngica em frascos. Em terceiro lugar, não se deve testar as fêmeas até que a superfície das larvas / comida da comida frascos parecido com a imagem mostrada na Figura 1F; se não for suficientemente egg-laying privados, as fêmeas não iria colocar os ovos quando ensaiado nas câmaras. Além disso, observe que os frascos de alimentos usados aqui são os "frascos estreitas". Se se utilizar frascos com diâmetro maior, é necessário aumentar o número de fêmeas / machos a ser colocada no frasco, de forma que as fêmeas estaria pronto para ser ensaiado em 4 - 5 dias.
Embora o protocolo descrito aqui especificamente centra-se na análise de fêmeas 'preferências entre sacarose e substratos de deslizamento, ele pode ser adaptado para estudar fêmeas' preferência em outras condições. Por exemplo, estas câmaras podem ser usadas para assade preferência Y 'moscas ao escolher entre mais duro e mais macio de agarose (por exemplo., 1% versus 1,5% de agarose), bem como substratos que diferem em outras pistas quimio (por ex., 3% de ácido acético). Se equipado com tampa que contém LED para iluminar um ou ambos os substratos, a câmara pode também fornecer uma plataforma eficiente para conduzir estudos optogenetic (Recurso Figura 4).
Finalmente, vale a pena notar que, embora esta configuração permite um maior rendimento para analisar as preferências de postura de ovos de Drosophila, tem algumas limitações importantes. Em primeiro lugar, a dimensão fixada das câmaras limita a flexibilidade do ensaio comportamental. Por exemplo, um terá que fazer novas câmaras a fim de testar como os outros parâmetros (por exemplo., Distância entre substratos) pode afetar as preferências de postura de ovos de moscas. Além disso, este sistema não capturar o complexo ambiente Drosophila encontro na natureza. É muito raro que voa terá que decidir entre um substrato de sacarose pura vs. um substrato simples puro para postura de ovos na natureza. Assim, enquanto o nosso ensaio é eficiente no estudo da base neural de uma tarefa simples decisão, é preciso estar ciente de que as "decisões" fêmeas específicos fazemos em nossas câmaras podem não ser etologicamente relevante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
