Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir hipertensão ocular no olho murino que resulta na perda de células ganglionares da retina observada no glaucoma. microesferas magnéticas são injectados na câmara anterior e atraído para o ângulo iridocorneal utilizando um magnete para bloquear o escoamento do humor aquoso.
Abstract
O uso de modelos de roedores de glaucoma tem sido essencial para compreender os mecanismos moleculares que estão na base da fisiopatologia desta doença neurodegenerativa multifatorial. Com o advento de numerosos linhas transgénicas de ratinho, existe um interesse crescente em modelos murinos indutível da hipertensão ocular. Aqui, nós apresentamos um modelo de oclusão de glaucoma com base na injecção de microesferas magnéticas para dentro da câmara anterior do olho utilizando uma micro-agulha modificado com um chanfro facetado. As microesferas magnéticas são atraídas para o ângulo iridocorneal utilizando um magnete de mão para bloquear a drenagem do humor aquoso a partir da câmara anterior. Esta perturbação na dinâmica aquosas resulta em uma elevação constante da pressão intra-ocular, o que subsequentemente conduz à perda de células ganglionares da retina, como observado em pacientes com glaucoma humanos. O modelo de oclusão microbead apresentada neste manuscrito é simples em comparação com outros modelos indutíveis de glaucoma e também altamenteeficaz e reprodutível. É importante ressaltar que as modificações apresentadas aqui minimizar os problemas comuns que muitas vezes surgem em modelos de oclusão. Em primeiro lugar, o uso de uma micro-agulha de vidro biselado impede o refluxo de micropérolas e garante que o mínimo de danos ocorre na córnea durante a injecção, reduzindo assim os efeitos relacionados com o ferimento. Em segundo lugar, o uso de microesferas magnéticas garante a capacidade de atrair a maioria dos grânulos para o ângulo iridocorneal, reduzindo efectivamente o número de esferas que flutuam na câmara anterior evitando o contacto com outras estruturas (por exemplo., Íris, cristalino). Por último, a utilização de um íman portátil permite flexibilidade ao manusear o pequeno olho do rato para orientar eficazmente as microesferas magnéticas e assegurar que existe pouca refluxo das microesferas a partir do olho, quando a micro-agulha é retirada. Em resumo, o modelo do rato oclusão microbead aqui apresentado é uma poderosa ferramenta de investigação para estudar mudanças neurodegenerativas que ocorrem durante o aparecimento e progressão da glaucoma.
Introduction
O glaucoma é uma condição de cegueira progressiva e irreversível que vai afectar um número estimado de 80 milhões de pessoas em todo o mundo em 2020 um. Em pacientes com glaucoma, a perda de visão é causada pela morte selectiva de células ganglionares da retina (RGCs), os neurónios de saída que transmitem informação visual do retina para o cérebro. O glaucoma é uma doença neurodegenerativa relacionada com a idade com vários factores de risco das quais a mais comum é a pressão intra-ocular elevada (PIO). Na verdade, IOP é o único fator de risco modificável no glaucoma e tratamentos atuais se concentrar exclusivamente em gerir a pressão do olho. No entanto, vários factores genéticos, celulares, e ambientais afectar o aparecimento e progressão desta doença. Portanto, a compreensão dos diversos mecanismos que, finalmente, contribuir para a morte neuronal é essencial para desenvolver tratamentos eficazes para o glaucoma.
Os modelos animais de glaucoma são essenciais para estudar patofisiologia da doença e para identificar e testarterapêuticas promissoras. A crescente disponibilidade de linhagens de camundongos transgênicos incluindo estirpes knockout condicional e ratinhos que transportam marcadores fluorescentes geneticamente codificados tem impulsionado a necessidade de modelos de glaucoma murino induzíveis. Vários modelos de roedores de glaucoma têm sido desenvolvidos ao longo dos anos (revisto em 2,3). Em muitos destes modelos, o glaucoma é induzida por perturbar a dinâmica do humor aquoso, o que resulta na elevação da PIO. Modelos de oclusão, no qual microesferas ou outras substâncias são injectadas para dentro da câmara anterior do olho para bloquear o escoamento aquosa, ganharam popularidade nos últimos anos em parte devido à sua relativa facilidade para aumentar a PIO 4-14.
O modelo de oclusão micropérola de glaucoma, em primeiro lugar realizada em primatas 12, 8, coelhos e ratos 4,9,11, foi recentemente adaptado para utilização em ratinhos 5,6,10. Nestes estudos, a injecção de microesferas de poliestireno intracameral, isoladamente ou emcombinação com um material viscoelástico, resultou em elevação da PIO que conduz à morte das CGR 6,10 subsequente. No entanto, o refluxo quando a agulha é retirada do olho e deslocamento de microesferas a partir do ângulo iridocorneal são problemas comuns que surgem durante o procedimento. Para minimizar estes inconvenientes, imans foram usadas para atrair as microesferas magnéticas com o ângulo do olho iridocorneal 4,9.
O protocolo aqui descrito é um procedimento modificado baseado em estudos anteriores 9,10 que utiliza microesferas magnéticas e um íman de mão adaptado para o olho do rato (Figura 1). Várias modificações importantes foram introduzidas no nosso protocolo para assegurar um aumento da PIO eficaz e reprodutível em ratinhos. Em primeiro lugar, a injecção de microesferas é feito utilizando uma micro-agulha de vidro cuidadosamente preparado com um chanfro facetado. As superfícies lisas resultantes de a micro-agulha, bem como a sua ponta aguçada assegura que é o mínimo de danosinfligido uma vez que perfura a córnea. O uso deste micro-agulha de vidro também resulta num aumento do controlo quando a ponta da micro-agulha entra na câmara anterior, reduzindo assim o risco de danificar as estruturas vizinhas, tais como a íris e a lente. Além disso, a pequena lesão injecção facilita córnea auto-reparo e reduz efeitos relacionados com lesões indesejadas.
Em segundo lugar, a injecção de microesferas magnéticas e a utilização de um íman portátil permitem um controle preciso para atrair as esferas para o ângulo iridocorneal no pequeno olho do rato. microesferas magnéticas que são 4,5 m de diâmetro foram usadas porque este tamanho micropérola não obstruir a abertura microagulha preparada e mais importante, uma vez injectado, estas microesferas eficazmente bloqueada a drenagem do humor aquoso. Essa abordagem não só reduz o refluxo das micro-esferas injectados, mas também assegura que um número máximo de micropérolas acumula na área alvo para bloquear de forma eficaz a drenagem do humor aquoso. Furthermore, esta estratégia também reduz o número de esferas que flutuam na câmara anterior evitando o contacto com outras estruturas, tais como a íris e a lente, e impedindo a passagem para a câmara posterior. Colectivamente, estas modificações assegurar que a cirurgia de injecção micropérola é realizada com relativa facilidade e em tempo hábil resultando numa indução altamente reprodutível, eficaz, e sustentada da hipertensão ocular em ratos.
Protocol
O procedimento seguinte foi realizado em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care para o Uso de Animais Experimentais e da Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO).
1. Preparação de a micro-agulha para Injecção anterior intracameral
- Com um extractor, gerar uma micro-agulha de um capilar de vidro de borossilicato
- Sob um microscópio, utilizar uma lâmina afiada para criar cuidadosamente uma abertura na ponta da micro-agulha. A abertura resultante deve ter uma forma elíptica com um maior e menor diâmetro do eixo de cerca de 190 uM e 70 uM, respectivamente. Medir a área da abertura de microagulhas preparados primeiro por obtenção de imagens com uma régua colocada sob o microscópio seguido por quantificação usando software de análise de imagem.
- No sistema micropipeta chanfro, coloque o microagulhas em um 20 degree ângulo em relação à placa de biselamento de modo que a abertura de microagulhas está a tocar na placa. Bevel por aproximadamente 10 min até que as bordas são planas e lisas. Adicionar algumas gotas de água destilada para ajudar no processo.
- Gire a micro-agulha de bisel as duas bordas ao redor da abertura até que a ponta está afiada.
- Limpe todos os detritos e água a partir da abertura da ponta microneedle usando um espanador de aerossol.
- examinar cuidadosamente o microagulhas acabado sob um microscópio. microagulhas Descartar com fraturas para minimizar o risco da quebra de microagulhas durante a cirurgia.
- Esterilizar a micro-agulha por lavagem primeiro com etanol, depois com uma solução salina equilibrada estéril (BSS).
2. Preparação da Solução Microbead Magnética
Nota: As microesferas magnéticas usadas neste estudo são revestidos com grupos epoxi. Para evitar quaisquer efeitos adversos, tais como a aglutinação das esferas e interações moleculares indesejados, esses grupos epóxi deveprimeiro ser removido das microesferas antes de prosseguir com a operação de injecção.
- A remoção dos grupos epóxi de esferas magnéticas
- Prepara-se uma solução de hidróxido de sódio 0,02 M (NaOH, MW 39,997 g / mol) em tampão Tris 10x (PM 121,14 g / mol).
- Gentilmente vortex o estoque de solução microbead magnética (4,5 mm de diâmetro, 4 x 10 8 contas / ml) até que as contas são uniformemente suspensas em solução.
- pipetar rapidamente 1 ml de solução de esferas magnéticas em 50 ml de NaOH 0,02 M em tampão Tris 10x.
- Girar durante 24 horas à temperatura ambiente para remover os grupos epoxi a partir dos grânulos.
- Recolher os grânulos por um íman de fixação para a parte inferior do tubo. Orientar o tubo horizontal para assegurar que todos os grânulos são atraídos para o íman. Rodar para 4 horas adicionais à temperatura ambiente.
- Com uma micropipeta, remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pelete de contas.
- Agitar em vórtice ligeiramente o sedimento em 50 ml de 10x tris tampão até que as esferas são bem suspensa.
- Repita os passos 2.1.4 a 2.1.6.
- A concentração e ressuspensão das microesferas magnéticas em solução salina equilibrada estéril
Nota: É necessário concentrar-se o stock de solução de esferas magnéticas em solução salina equilibrada estéril (BSS) para alcançar uma concentração final de 1,6 x 10 6 contas / ul de modo a que 2,4 x 10 6 contas podem ser injectados para dentro da câmara anterior em uma volume final de 1,5 ml, que é apropriado para o pequeno olho do rato.
- Lave as contas em 5 ml de água de grau laboratorial ultra-pura por vortex suavemente durante 2 min.
- Recolher os grânulos, atraindo-os para o fundo do tubo com um íman.
- Com uma micropipeta, remova cuidadosamente a água sem perturbar o sedimento de contas.
- Repita os passos mais 2.2.1 a 2.2.3 três vezes.
- Em uma câmara de fluxo laminar, lavagem das pérolas com 500 mL de BSS por pipetting cima e para baixo. Execute as etapas restantes nesta seção em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar.
- Recolher os grânulos, atraindo-os para o fundo do tubo com um íman.
- Com uma micropipeta, remova cuidadosamente o BSS sem perturbar o sedimento de contas.
- Repita os passos mais 2.2.5 a 2.2.7 três vezes.
- Ressuspender pipetando as contas cima e para baixo em 250 ul de BSS.
- Certifique-se de que a solução talão é bem homogeneizado. Em seguida, rapidamente alíquota de 25 ul da suspensão de 0,5 ml em tubos estéreis. A concentração final da solução de estoque do grânulo é de 1,6 x 10 6 contas / ul.
- Armazenar a 4 ° C.
3. Indução de Ocular Hypertension
Nota: A secção 3 é uma operação de duas pessoas. No caso em que uma determinada acção é para ser executado por uma pessoa específica, a pessoa é identificada apropriado. Em geral, uma pessoa lida com o rato sob o microscópio, enquanto Pessoa 2 é responsável para manipular a bomba de microsseringa. A duração total do processo cirúrgico deve ser inferior a 10 minutos (passos 3,9-3,17).
- Realizar procedimentos em adultos camundongos C57BL / 6. Ratos de casa em um ambiente padrão com acesso a comida e água ad libitum. Neste artigo, utilize feminino camundongos C57BL / 6 entre 3 e 4,5 meses de idade. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para ratinhos machos e de diferentes idades, bem como outras estirpes de ratinho, incluindo os ratinhos transgénicos e knockout.
- Medir a PIO basal em ratos acordados antes da injeção de anestesia e microbead usando um tonômetro rebote calibrado. Aplicar uma gota de cloridrato de proparacaína sobre a córnea.
- Gentilmente conter o mouse, mantendo a pele entre as orelhas. Posicione o mouse sobre a bancada para que o animal é confortável e os olhos são acessíveis. Segurar o tonómetro perpendicular à superfície da córnea e ter pelo menos três conjuntos de dez leituras consecutivas em cada olho para obter umamédia PIO. A medição da pressão intra-ocular em ratos acordados é o preferido para contornar os efeitos relacionados com a anestesia na IOP. Alternativamente, a PIO pode ser medida em ratos anestesiados após o passo 3.4.
- Prepara-se uma mistura de anestesia cocktail estoque rato composta por 20 mg / ml de cetamina, 2 mg / ml de xilazina, e 0,4 mg / ml de acepromazina.
- Induzir a anestesia no ratinho por administração intraperitoneal da mistura do cocktail (1 ul / g de peso corporal). O uso de um cocktail anestésico injectável é preferido sobre anestésicos de gás (por exemplo, isoflurano), pois permite flexibilidade no manuseamento da cabeça de rato enquanto o animal não está ligado a uma máscara de inalação. Além disso, o longo período de recuperação necessária com um anestésico injectável garante que micropérolas se depositam no ângulo iridocorneal sem desalojar de volta para a câmara anterior.
- Administrar 0,05 mg por kg de peso corporal de buprenorfina por via subcutânea.
- Tratar o olho com uma EY tropicamidae cair para induzir a dilatação da pupila. Devido ao tamanho pequeno da câmara anterior de murino, o aluno tem de ser dilatado para visualizar facilmente o posicionamento e o avanço da micro-agulha durante a injecção.
- Aplicar pomada tópica no olho contralateral (ONU-operada) para evitar a secagem da córnea durante o procedimento.
- Anexar uma micro-agulha limpa para o conjunto de injeção da bomba de microsseringa. Substitua a micro-agulha depois de cada operação para evitar a contaminação cruzada animal.
- Pessoa 1: Transferir o rato anestesiado para a plataforma operacional. Sob o microscópio, assegurar que a pupila está totalmente dilatada e que os músculos oculares são relaxadas de modo que não existe movimento dos olhos. A ausência de movimentos oculares garante a estabilidade durante a injecção. Limpe cuidadosamente a queda tropicamida olho do olho usando cotonetes absorventes.
- Pessoa 2: Misturar a solução microbead magnética pipetando cima e para baixo.
- Usando a bomba de microsseringa, coloque imediatamente a microneedle (preparado na seção 1) com 1,5 ml da solução microbead magnética homogeneizada (2,4 x 10 6 esferas). Assegurar que as bolhas de ar estão ausentes na ponta da micro-agulha. Depois de a micro-agulha é carregado, levar a cabo os passos 3,12-3,13 tão rapidamente quanto possível, de modo que a solução permanece micropérola magnético numa suspensão homogénea.
- Posicionar a micro-agulha carregada a um ângulo de 45 °, colocada anteriormente em relação ao limbo. Pessoa 1: apoiar o olho usando uma pinça de plástico. Certifique-se de que o ângulo entre a micro-agulha e as pinças de plástico é de aproximadamente 90 °.
- Pessoa 2: Com a micro-agulha carregada, perfurar suavemente a córnea para que a ponta da micro-agulha entra na câmara anterior. Assegure-se que a micro-agulha carregada permanece em um ângulo de 45 ° em relação ao limbo durante a punção. Evitar qualquer contacto com a lente ou da íris. Certifique-se que a micro-agulha não entra na câmara posterior. Pessoa 1: continuar a apoiar o olhousando uma pinça de plástico.
- Pessoa 1: Sem mover a cabeça de rato, coloque o íman ao lado do olho, do lado oposto à ponta de microagulhas, para atrair as esferas magnéticas para a câmara anterior e minimizar o contacto das pérolas com a superfície interna da córnea. Pessoa 2: Usando a bomba de microsseringa, injectar 1,5 ul da solução de esférulas magnéticas para a câmara anterior. A solução micropérola é injectado ao longo de um período de 15 a 30 seg. Pessoa 1: Continue a segurar o oposto ímã para a ponta microneedle durante toda a duração da injeção.
- Pessoa 2: Uma vez que o volume total dos grânulos ter sido injectado, a micro-agulha lentamente retirada do olho. Pessoa 1: Para evitar o refluxo das microesferas, continuam a atrair as esferas magnéticas no sentido da câmara anterior, mantendo o íman ao lado do olho por 30 a 60 segundos adicionais.
- Pessoa 1: Usando o ímã, atrair as contas para o ângulo iridocorneal. Assegure-se que os grânulos formam um anel uniformemente distribuídaem torno da circunferência da câmara anterior. Durante este passo, evitar atrair grânulos para a córnea, que têm uma tendência para ficar à superfície interna da córnea após o contacto.
- Tratar o olho operado com um colírio antibiótico para minimizar o risco de infecção.
- Permitir que o mouse para se recuperar em uma almofada de calor até que esteja totalmente acordado (~ 3 a 4 horas). Posicione o mouse para que o olho operado está voltada para cima. Este posicionamento irá impedir a acumulação das esferas injectados para a superfície interna da córnea pela força gravitacional. Além disso, nesta posição irá reduzir o potencial de infecção, o olho operado, não estará em contacto com qualquer roupa de cama e / ou outros materiais que possam estar presentes na gaiola. No caso em que um animal apresenta qualquer sinal de desconforto, administrar doses adicionais de buprenorfina conforme necessário.
- Permitir que os ratos se recuperar do procedimento para, pelo menos, 2 dias antes de tomar medidas de PIO. Medir a PIO, conforme descrito no ponto 3.2. MoniTor PIO, pelo menos, uma vez por semana, ou mais frequentemente, conforme for necessário, e, ao mesmo tempo do dia para minimizar flutuações circadianos-relacionadas.
- Para as medições de IOP, usar o olho contralateral do rato operado como um controlo interno. Em alternativa, usar medidas de controles intactos, não operados ou ratos sham-operados como ingênuos.
4. Avaliação da retina do gânglio Soma celular e Axon Survival
- Perfundir ratos submetidos a hipertensão ocular por injecção intracardíaca de uma solução 0,1 M de tampão fosfato (PBS) seguido imediatamente por gelada 4% de paraformaldeído (PFA).
- Perfundir ratos intactos, não operados, conforme descrito na versão 4.1 e usá-los como controles não lesionados. O uso dos olhos contralateral de ratos operados não é recomendado para avaliar a sobrevivência RGC porque as mudanças no olho contralateral após a lesão foram relatados 15,16 e pode confundir a interpretação dos dados. Como alternativa, use os olhos operados por simulação injetados com 1.5 Ul de BSS como controlos.
- Usando microtesoura, corte cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor do olho para o isolar a cavidade ocular. Separa-se o nervo óptico a partir do olho, cortando-a ao nível da cabeça do nervo óptico.
- Usando uma agulha G 30, fazer um furo na córnea para permitir a penetração da solução fixadora para dentro do olho. Colocar o olho em PFA a 4% e incubar durante 1 hora a 4 ° C para a fixação adicional.
- Colocar o nervo óptico numa solução contendo 2% de PFA e 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M de cacodilato de sódio (PM: 214 g / mol) e incubar O / N a 4 ° C para a fixação adicional.
5. retinas Quantificação de RGC Soma Densidade sobre Flat-montados
Nota: O procedimento a seguir é uma adaptação de um protocolo por Nadal-Nicolas et al 17 e descreve a quantificação de RGCs utilizando um anticorpo contra o 3A específicas do cérebro homeobox / POU proteína de domínio (Brn3a) na retina planas montagens.. meth alternativaODS para rotulagem RGCs também pode ser utilizado, incluindo imuno-histoquímica com um anticorpo contra a proteína de ligação a ARN com splicing múltipla (RBPMS) ou marcação retrógrada com Fluorogold ou DII.
- Sob um microscópio de dissecação, remover a parte anterior do olho através de uma incisão ao longo de todo o limbo até que a córnea separa facilmente. Remover a córnea e do cristalino. Retirar cuidadosamente a retina do olho, fazendo cortes ao longo da ora serrata e nervo óptico.
- Prepare uma retina flat-mount, fazendo quatro pequenas incisões equidistantes a partir da periferia da retina em direção ao nervo óptico para delinear claramente os quatro quadrantes da retina. Usando uma escova pequena, retire cuidadosamente qualquer vítreo remanescente da retina. A remoção do humor vítreo, tanto quanto possível, é crucial para a obtenção de um sinal limpo e imuno-histoquímica forte.
- Transferir cuidadosamente a retina para uma placa de cultura de fundo plano de 48 poços contendo 0,5% de Triton X-100 em PBS de modo a que a retina éde livre flutuação. Certifique-se a camada de células ganglionares está voltada para cima.
- Colocar a placa de cultura a -70 ° C durante 15 min. Depois de descongelar as retinas, mais permeabilizar através de lavagem duas vezes em fresco 2% de Triton X-100 em PBS.
- Diluir o anticorpo Brn3a para 0,3-0,5 ug / mL com PBS contendo 2% de Triton X-100 e 2% de soro de burro normal. Incubar a retina na solução de anticorpo primário Brn3a agitando suavemente O / N a 4 ° C. As retinas deve ser totalmente imerso em 150 a 200 ml de solução em todos os momentos.
- Dilui-se o anticorpo secundário de burro anti-IgG de cabra a 2 ug / ml, com PBS contendo 2% de Triton X-100 e incubar a retina nesta solução durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. A retina devem ser totalmente imerso na solução de anticorpos em todos os momentos. Cobrir a placa de cultura com folha de alumínio para as etapas restantes para evitar a fotodegradação.
- Utilizando uma escova, transferir cuidadosamente a retina para uma lâmina de modo que o tecido se encontra tão plano quanto possível. Secar ao ar durante 10 min. Montagem utilizando meio de montagem anti-fade.
- Examine as montagens planas da retina sob um microscópio fluorescente. Quantificar o número de CGR Brn3a positivos em três zonas não sobrepostas por quadrante da retina, tal como descrito 18.
6. Quantificação de RGC Os axônios do nervo óptico Transversais
- Recolhe-se o nervo óptico a partir do passo 4.5 e incubar em 2% de tetróxido de ósmio (OsO4, MW 254,23 g / mol) durante 2 h.
Cuidado: Devido à sua alta toxicidade, tetróxido de ósmio deve ser tratado em um exaustor com traje de laboratório apropriado. - Desidratar o nervo óptico por imersão em concentrações de etanol crescente (50%, 70%, 90%, 95% e 100%) durante 15 min cada.
- Preparar a resina epoxi com a seguinte receita: 15,72 ml Incorporar-812, 6,45 ml de anidrido dodecenil succínico, 7,83 ml de anidrido nádico de metilo, 0,45 ml de DMP-30.
- Sequencialmente incubar o nervo óptico em soluções compostasdas seguintes proporções de resina epoxi para óxido de propileno (PM 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 e 1: 0. O nervo óptico é incubada em cada solução à temperatura ambiente durante um N / O período.
- Incubar nervos ópticos embutidos em 100% de resina epoxi (último passo de 6,4) a 60 ° C durante uma 48 horas adicionais.
- Gerar secções transversais do nervo óptico semi-fino (0,75 mm) usando um micrótomo.
- Manchar seções transversais do nervo óptico com 1% de azul de toluidina.
- Quantificar os axônios RGC em cinco áreas não sobrepostas de cada secção do nervo óptico como descrito 19.
Representative Results
A injecção de microesferas magnéticas para a câmara anterior de murganhos adultos descritos neste protocolo resultou em um alçado robusta e reprodutível da pressão intra-ocular. Uma semana após o procedimento, a PIO aumentada de 10 ± 0,6 mmHg (média ± SEM), a PIO média da linha de base no olho contralateral, a 19 ± 0,5 mm de Hg em olhos hipertensos (teste t de Student; *** p <0,001, n = 12, Tabela 1, Figura 2). PIO estabilizado e depois manteve-se elevada a uma média de 20 mm Hg durante pelo menos 6 semanas, a mais longa ponto de tempo examinados neste estudo. A PIO média do pico nos olhos injetados de microbead em 2, 3 e 6 semanas após a cirurgia foi de 25 mm Hg. A grande maioria dos ratinhos tratados desenvolveram PIO elevada sustentada, por conseguinte, este protocolo não necessita de uma segunda injecção de microesferas.
Para avaliar o tempo de curso da perda das CGR neste modelo, RGC foram Somaprimeiro quantificado por coloração imunológica com Brn3a, um marcador específico das CGR-17. O número de células Brn3a-positivos foi quantificado em retinas plana montada de 1, 2, 3 e 6 semanas após a indução da hipertensão ocular. Embora um aumento da PIO significativa foi detectada tão cedo como 1 semana após a injecção de microesferas, foi observada nenhuma perda significativa de RGC Soma dentro das primeiras 2 semanas do procedimento (Figura 3). A morte das CGR substancial (22%), no entanto, foi evidente em 3 semanas (2.430 ± 67 RGCs / mm2, média ± SEM, n = 12) e 6 semanas (2.350 ± 74 RGCs / mm 2, n = 10) pós a indução da hipertensão ocular, em comparação com os olhos de controlo intactos de murganhos operada-un (3.141 ± 49 RGCs / mm 2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).
Disfunção e degeneração de axônios RGC é uma característica fundamental do glaucoma. Portanto, a perda axonal foi analisado aos 3 e 6 semanas após a injecção de microesferas pelaquantificação de axónios nervosos RGC em secções transversais óptica coradas com azul de toluidina (Figura 4). A perda substancial de axónios RGC (25%) foi observada às 3 semanas (28,401 ± 702 axónios / nervo, média ± SEM, n = 5) e 6 semanas (29,426 ± 948 axónios / nervo, n = 6) após a injecção de microesferas em comparação com os nervos ópticos dos olhos intactos operada-un (39467 ± 137 / axónios do nervo, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Colectivamente, estes dados demonstram que a injecção de microesferas magnéticas para dentro da câmara anterior do rato leva a reprodutível e sustentada elevação da PIO que resulta em RGC soma e degeneração axonal.
| Tempo após a cirurgia OHT | N | A média de PIO (mmHg) ± SEM | Pico da PIO (mm Hg) | ||||
| contralateral | Glaucoma | diferença | contralateral | Glaucoma | |||
| 1 semana | 12 | 10 ± 0,4 | 19 ± 0,5 | 9 ± 0,6 | 12 ± 0,4 | 22 ± 0,6 | |
| 2 semanas | 13 | 11 ± 0,5 | 20 ± 0,8 | 9 ± 0,5 | 12 ± 0,9 | 25 ± 0,7 | |
| 3 semanas | 10 | 11 ± 0,8 | 20 ± 0,7 | 10 ± 0,9 | 13 ± 0,2 | 25 ± 0,9 | |
| 6 semanas | 12 | 12 ± 0,5 | 20 ± 0,6 | 9 ± 0,7 | 13 ± 0,5 | 24 ± 0,6 | |
Tabela 1. Elevação de Pressão Intraocular na Murino Magnetic Microbead Occlusino modelo. Em feminina acordado C57 BL / 6 ratos, a PIO foi medida usando um tonômetro rebote calibrado. olhos operados apresentado um aumento na pressão intra-ocular detectada no pós-cirurgia de uma semana, que permaneceu elevada durante pelo menos seis semanas após o procedimento.
Figura 1. Fluxo de trabalho das etapas envolvidas na Murino Magnetic Microbead Oclusão Model of Glaucoma. Passo-a-passo esboço de todos os procedimentos realizados antes, durante e após a cirurgia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Aumento na pressão intra-ocular no modelo murino Magnética Microbead oclusão. Em acordadofêmeas C57 BL / 6 ratos, a PIO foi medida usando um tonômetro rebote calibrado. Os IOPs de olhos injetados de microbead foram significativamente elevados em um pós-operatório semana (ANOVA, p <0,001). Os PIOs permaneceu significativamente elevada em relação ao olho contralateral de ratinhos injectados durante pelo menos 6 semanas (ANOVA, p <0,001). (Intact: n = 12; 1 semana: n = 12, 2 semanas: N = 13, 3 semanas: n = 10, 6 semanas: n = 12). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. retina do gânglio Cell Death nas murino magnéticos Microbead Oclusão Model. RGCs foram visualizadas por imunocoloração das retinas planas montado usando Brn3a em retinas intactas de controle (A) e retinas glaucomatosos aos 3 e 6 semanas após a injeção microbead para induzirhipertensão ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 20 pm. (D) A análise quantitativa confirmou que a injecção de microesferas resultou em perda significativa Soma RGC às 3 e 6 semanas após o procedimento comparado com o controlo olhos. A densidade do RGC soma em intacta C57 não glaucomatosa ratos, / BL6 é mostrado como referência (barras brancas, 100% de sobrevivência). Os valores são expressos como a média ± SEM (intactos: n = 23; 1 semana: n = 6, 2 semanas: n = 6, 3 semanas: n = 12, 6 semanas: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. axonal Degeneração nas murino axônios Magnetic Microbead Oclusão Model. RGC foram visualizados por coloração do nervo óptico secções transversais com azul de toluidina emcontrolo intacto (A) e glaucomatosos retinas às 3 e 6 semanas após a injecção de microesferas para induzir hipertensão ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 10 pm. (D) A análise quantitativa confirmou que a injecção de microesferas resultou em perda significativa axónio RGC às 3 e 6 semanas após o procedimento comparado com o controlo olhos. A densidade de axônios RGC em intacta C57 não glaucomatosa ratos, / BL6 é mostrado como referência (barras brancas, 100% de sobrevivência). Os valores são expressos como a média ± SEM (Intact: n = 4; 3 semanas: N = 5, 6 semanas: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Discussion
A técnica de vídeo aqui apresentado fornece instruções detalhadas passo-a-passo sobre como realizar a injeção intracameral de microesferas magnéticas de forma eficaz e reprodutível induzir IOP elevação em camundongos. Este procedimento resulta em aumento da PIO sustentou que não requer injeções adicionais e promove detectável soma RGC e perda axonal dentro das primeiras 3 semanas de hipertensão ocular induction.Elevated IOP é um importante fator de risco para o desenvolvimento de glaucoma em seres humanos. Portanto, este é um modelo murino valioso ocular dependente da hipertensão glaucoma que tem potencial para uma ampla gama de aplicações.
Um inconveniente comum associado com a injecção de microesferas para a câmara anterior refere-se a grânulo de refluxo através do local de injecção quando a agulha é retirada, o que muitas vezes resulta em apenas obstrução parcial do fluxo aquoso e maior variabilidade. Para abordar esta questão, foram implementadas várias modificações importantes. Firs t, a uma preparação cuidadosa de uma micro-agulha afiada vidro limpa com um chanfro facetado é essencial para a injecção bem sucedida das microesferas. Uma micro-agulha adequadamente preparada permite a penetração controlada e suave da córnea com aplicação mínima de pressão para a superfície ocular delicada. O pequeno furo da córnea impede o refluxo de microesferas. Além disso, a fina microagulhas reduz o risco de danificar as estruturas vizinhas, tais como a íris e a lente, o que pode resultar em inflamação não relacionadas com a doença. Em segundo lugar, a aplicação de um magneto de mão para áreas estratégicas oculares durante e depois da injecção é um outro aspecto importante desta técnica. Durante a injecção, o íman é usada para desenhar as microesferas magnéticas para a câmara de prevenção de refluxo anterior das microesferas quando a micro-agulha é retirada. Após a injecção, o íman é então utilizado para dirigir as micropérolas para o ângulo iridocorneal para bloquear o escoamento do humor aquoso.
tenda "> Outro problema frequentemente encontrado em modelos de oclusão microbead é que as injeções repetidas talão são muitas vezes necessários para alcançar sustentada IOP elevação 10,11. Isso pode ser o resultado de microesferas de desalojar a partir do ângulo iridocorneal com o tempo. A combinação de um ímã de mão, como descrito acima, e o posicionamento do rato pós-operatório melhora significativamente o resultado. a utilização de anestésicos injectáveis, o que permite a flexibilidade para mover a cabeça durante o procedimento e requerem um longo período de recuperação pós-operatório, é favorecida. a colocação do rato com o olho operado voltado para cima durante um par de horas após a cirurgia contribui para a resolução de micro-esferas no ângulo iridocorneal e diminui o risco de deslocar para trás para a câmara anterior.Assegurar que o número de grânulos injectados é relativamente consistente é um passo crítico para minimizar as variações inter-animal. Uma vez que as microesferas se depositam no bottom do tubo, que é necessária para homogeneizar completamente a solução micropérola e retirar o volume apropriado para a micro-agulha de uma forma atempada. A injeção de menos esferas para a câmara anterior pode resultar em bloqueio incompleta das estruturas de drenagem humor aquoso, que é provável que resulte em fraca ou variável elevação da PIO. De nota, embora o objetivo final da injeção microbead é elevar a PIO, o cuidado deve ser tomado quando medidas de PIO de ratos acordados são maiores do que os valores de pico reportados neste estudo (~ 25 mmHg). Extremamente PIO altas aumentam o risco de danos isquémicos e pode também causar dor para o animal. A elevação da pressão intra-ocular deve ser considerado como um dos muitos factores para avaliar o sucesso da cirurgia. Como tal, o resultado do processo deve ser avaliada com base em vários parâmetros, incluindo o aumento da PIO, a morte soma RGC e perda axonal.
Embora o protocolo descrito aqui resulta na maioria das micropérolas sucessoLY fixando-se em ângulo, uma limitação potencial deste modelo é que esses grânulos flutuantes que permanecem na câmara anterior pode interferir com a imagem da retina ao vivo através da córnea, bem como ensaios electrofisiológicos ou comportamentais que requerem passagem de luz eficaz. Outro aspecto importante a considerar quando se utiliza este modelo oclusão microbead é que a extensão da elevação da PIO e subsequente degeneração RGC varia com a idade e antecedentes genéticos do mouse operado [4]. Portanto, a medida da PIO elevação e o cronograma de degeneração RGC terá de ser determinado para cada linha específica rato transgénico e / ou faixa etária.
Uma característica deste modelo é que elevados resultados PIO na perda gradual da morte das CGR, durante as primeiras três semanas após a injecção de microesferas, e a morte das CGR significativa é detectada às 3 semanas após o procedimento. Assim, este modelo permite a análise de alterações precoces e / ou subtis que ocorrem neste disease, antes overt RGC soma e perda axonal. Não foi observado um aumento significativo na morte das CGR entre 3 e 6 semanas após a indução da hipertensão ocular. Na verdade, RGC soma e axônio perda permaneceu estável em ~ 22 - 25% entre 3 e 6 semanas, apesar de bem sucedida e sustentada IOP elevação em todos esses momentos. Uma maior duração da pressão intra-ocular sustentada pode ser necessário para a perda de CGR adicional para ocorrer em ratinhos C57BL / 6, que parecem ser mais resistentes a danos de RGC em comparação com outras estirpes de ratinho. 5 As modificações adicionais com o protocolo aqui apresentado, incluindo o ajustamento do tamanho do grânulo e injecções adicionais, pode ser necessária para estudar a perda de CGR em pontos de tempo posteriores. Portanto, o nosso protocolo é ideal para estudos voltados para alterações fisiopatológicas iniciais que se correlacionam com a neurodegeneração modesta RGC que são relevantes para o aparecimento e progressão no início de glaucoma humano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
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