Summary
Hier presenteren we een protocol om intraoculaire drukverhoging te induceren in het muizen oog dat resulteert in het verlies van retinale ganglioncellen zoals waargenomen in glaucoom. Magnetische microkralen worden geïnjecteerd in de voorste kamer en aangetrokken door de iridocorneale hoek met een magneet om de uitstroom van waterige humor te blokkeren.
Abstract
Het gebruik van diermodellen voor glaucoom is essentieel om de moleculaire mechanismen die de pathofysiologie van deze multifactoriële neurodegeneratieve ziekte ten grondslag liggen begrijpen zijn. Met de komst van talrijke transgene muizenlijnen, is er toenemende belangstelling induceerbare muismodellen van oculaire hypertensie. Hier presenteren we een occlusie model van glaucoom gebaseerd op de injectie van magnetische microkralen in de voorste kamer van het oog met een aangepaste micronaald met een schuine facetten. De magnetische microkralen worden aangetrokken door de iridocorneale hoek met een handheld magneet om de afvoer van kamerwater uit de voorste kamer te blokkeren. Deze verstoring in waterige dynamiek resulteert in een constante verhoging van de intraoculaire druk, die vervolgens leidt tot verlies van retinale ganglioncellen, zoals waargenomen in humane glaucoompatiënten. De microbead occlusie model in dit manuscript eenvoudig in vergelijking met andere induceerbare modellen van glaucoom en ook zeereffectief en reproduceerbaar. Belangrijk is dat de wijzigingen hier gepresenteerde minimaliseren voorkomende problemen die vaak ontstaan in occlusie modellen. Ten eerste, het gebruik van een afgeschuind glas micronaald voorkomt terugstroming van microkralen en garandeert dat minimale schade voordoet aan het hoornvlies tijdens de injectie, aldus schade gerelateerde effecten verminderen. Ten tweede, het gebruik van magnetische microkralen zorgt voor de mogelijkheid om de meeste kralen trekken om de iridocorneale hoek, het aantal parels drijven in de voorste kamer contact met andere structuren voorkomen (bijv., Iris, lens) effectieve vermindering. Tenslotte is het gebruik van een handheld magneet is flexibel om met de kleine muis oog op de magnetische microkralen efficiënt en zorgt dat er weinig terugstromen van de microkralen van het oog wanneer de micronaald wordt onttrokken. Samengevat, de microbead occlusie muismodel hier gepresenteerde is een krachtig onderzoeksinstrument neurodegeneratieve veranderingen die optreden tijdens het ontstaan en de progressie van Glau bestuderencoma.
Introduction
Glaucoom is een progressieve en onomkeerbare verblindende voorwaarde dat naar schatting 80 miljoen mensen wereldwijd zal beïnvloeden in 2020 1. Bij glaucoompatiënten, is visie verlies veroorzaakt door de selectieve dood van retinale ganglioncellen (RGC), de output neuronen die visuele informatie uit het uitzenden retina naar de hersenen. Glaucoom is een leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekte met vele risicofactoren waarvan de meest voorkomende is verhoogde intraoculaire druk (IOP). Inderdaad, IOP is de enige aanpasbaar risicofactor voor glaucoom en de huidige behandelingen uitsluitend richten op het beheer van de oogdruk. Echter, meerdere genetische, cellulaire en milieufactoren invloed op het ontstaan en de progressie van deze ziekte. Derhalve begrip van de verschillende mechanismen die uiteindelijk bijdraagt aan neuronale dood is essentieel voor effectieve behandelingen voor glaucoom.
Diermodellen van glaucoom zijn essentieel voor ziekte pathofysiologie bestuderen en te identificeren en testenveelbelovende therapeutica. De toenemende beschikbaarheid van transgene muizenlijnen inclusief conditionele knockout stammen en muizen die genetisch gecodeerd fluorescerende tracers heeft voortbewogen de noodzaak induceerbare glaucoom murine modellen. Verschillende knaagdiermodellen van glaucoom zijn ontwikkeld door de jaren heen (beoordeeld in 2,3). In veel van deze modellen wordt glaucoom geïnduceerd door het verstoren kamerwater dynamiek, waardoor de verhoging van IOP. Occlusie modellen, waarbij microkralen of andere stoffen worden geïnjecteerd in de voorste kamer van het oog om waterige drainage blokkeren, hebben aan populariteit gewonnen in de afgelopen jaren mede door hun relatieve gemak IOP 4-14 verhogen.
De microbead occlusie model van glaucoom, first out in primaten 12 uitgevoerd, konijnen 8 en ratten 4,9,11, werd onlangs aangepast voor gebruik in muizen 5,6,10. In deze studies was het intracamerale injectie van polystyreen microbolletjes, alleen of incombinatie met een visco-elastisch materiaal, resulteerde in IOP verhoging leidt tot daaropvolgende RGC dood 6,10. Echter, reflux wanneer de naald uit het oog en loskomen van microkralen van iridocorneale hoek onttrekkingen voorkomende problemen die zich voordoen tijdens de procedure. Om deze nadelen te minimaliseren, zijn magneten gebruikt om de magnetische microkralen trekken om de iridocorneale hoek van het oog 4,9.
De hier beschreven protocol is een aangepaste procedure op basis van eerdere studies die 9,10 magnetische microkralen en een handheld magneet aangepast aan de muis oog (figuur 1) gebruikt. Een aantal belangrijke wijzigingen aangebracht in ons protocol om effectieve en reproduceerbare IOP verhoging van de muizen te garanderen. Eerst wordt de injectie van microkralen uitgevoerd met een zorgvuldig bereid micronaald glas met een gefacetteerde afschuining. De verkregen gladde oppervlakken van de micronaald en de scherpe punt zodat minimale schadetoegebracht omdat het hoornvlies doorprikt. Het gebruik van deze glazen micronaald verhoogt bovendien controle bij de micronaald punt komt de voorste kamer, waardoor het risico op beschadiging nabijgelegen structuren reduceren, zoals de iris en de lens. Bovendien, de kleine laesie injectie vergemakkelijkt corneale zelfherstellende en vermindert onaangename letsel gerelateerde effecten.
Ten tweede, de injectie van magnetische microkralen en het gebruik van een handheld magneet maken een nauwkeurige controle om de korrels aan de iridocorneale hoek trekken in de kleine muis oog. Magnetische microbolletjes die zijn 4,5 micrometer in diameter werden gebruikt, omdat deze microbead omvang niet bereid microneedle opening leverde verstoppen en belangrijker nog, een keer geïnjecteerd, deze microbolletjes effectief geblokkeerd de afvoer van waterige humor. Deze benadering vermindert niet alleen terugstromen van de geïnjecteerde microkralen, maar verschaft ook dat een maximum aantal microkralen ophoopt in het doelgebied effectief blokkeren kamerwater drainage. Furthermore Deze strategie vermindert ook het aantal korrels zwevend in de voorste kamer contact met andere structuren, zoals de iris en de lens, en het voorkomen van de doorgang naar achterkamer vermijden. Tezamen zijn deze modificaties zorgen dat de microbead injectie operatie wordt uitgevoerd met relatief gemak en tijdig resulteert in een zeer reproduceerbare, effectieve en langdurige inductie van oculaire hypertensie bij muizen.
Protocol
De volgende procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care voor het gebruik van proefdieren en de verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Uit onderzoek van de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO).
1. Voorbereiding van de Microneedle voor anterieure intracamerale Injection
- Met een trekker, het genereren van een micronaald van een borosilicaatglas capillair
- Onder een microscoop met een scherp mes zorgvuldig maak een opening aan de punt van de micronaald. De resulterende gat moet een elliptische vorm met een hoofd- en nevenas diameter van ongeveer 190 urn en 70 urn respectievelijk. Meet het oppervlak van de bereide micronaald opening door eerst ophalen van afbeeldingen met een liniaal onder de microscoop gevolgd door kwantificering behulp van beeldanalyse software geplaatst.
- In de micropipet afschuining systeem, plaatst u de microneedle bij een 20 degree hoek ten opzichte van de afschuining plaat, zodat de microneedle opening de plaat raakt. Bevel gedurende ongeveer 10 minuten totdat de randen zijn vlak en glad. Voeg een paar druppels gedestilleerd water om te helpen bij het proces.
- Draai de microneedle om de twee randen rondom de opening totdat de tip is scherp bevel.
- Maak alle puin en water uit de microneedle tip opening met behulp van een spuitbus stofdoek.
- Zorgvuldig onderzoek van de afgewerkte microneedle onder een microscoop. Ontdoen micronaalden met breuken het risico van het breken micronaald minimaliseren tijdens de operatie.
- Steriliseer de micronaald door eerst spoelen met ethanol, daarna met steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS).
2. Voorbereiding van de Magnetic Microbead Solution
Opmerking: De magnetische microkralen die in deze studie zijn gecoat met epoxygroepen. Om eventuele nadelige effecten, zoals klonteren van de kralen en ongewenste moleculaire interacties te voorkomen, moeten deze epoxygroepeneerst worden verwijderd uit de microkralen alvorens de injectie operatie.
- Verwijdering van Epoxy groepen van Magnetic Beads
- Bereid een oplossing van 0,02 M natriumhydroxide (NaOH, MW 39,997 g / mol) in 10 x Tris buffer (MW 121,14 g / mol).
- Voorzichtig vortex de voorraad microkorrel magnetische oplossing (4,5 urn diameter, 4 x 10 8 kralen / ml) totdat de korrels gelijkmatig gesuspendeerd in oplossing.
- Snel Pipetteer 1 ml van magnetische bead oplossing in 50 ml 0,02 M NaOH in 10 x Tris buffer.
- Draai gedurende 24 uur bij KT om de epoxygroepen van de bolletjes te verwijderen.
- Verzamel de kralen door het bevestigen van een magneet om de bodem van de buis. Oriënteren de buis horizontaal zodat alle korrels worden aangetrokken door de magneet. Roteren tegen 4 uur bij KT.
- Met een micropipet voorzichtig het supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren kralen.
- Voorzichtig vortex de pellet in 50 ml van 10x Tris buffer totdat de kralen goed zijn opgehangen.
- Herhaal de stappen 2.1.4 tot 2.1.6.
- Concentratie en de resuspensie van Magnetic Microkralen in steriele Balanced Salt Solution
Opmerking: Het is noodzakelijk om de voorraad van magnetische bolletje oplossing in steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS) concentreer tot een eindconcentratie van 1,6 x 10 6 kralen / ul bereikt zodat 2,4 x 10 6 kralen in de voorste kamer kan worden geïnjecteerd in een eindvolume van 1,5 pl, die geschikt is voor kleine muis oog.
- Was de kralen in 5 ml ultrazuiver water laboratoriumkwaliteit door voorzichtig vortexen gedurende 2 min.
- Verzamel de kralen door ze te lokken naar de bodem van de buis met een magneet.
- Met een micropipet, voorzichtig het water te verwijderen zonder de pellet van kralen te verstoren.
- Herhaal de stappen 2.2.1 tot 2.2.3 nog drie keer.
- In een laminaire stroming kap, was de kralen met 500 pi van BSS door pipetting op en neer. Voer de overige stappen van deze afdeling onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap.
- Verzamel de kralen door ze te lokken naar de bodem van de buis met een magneet.
- Met een micropipet, voorzichtig de BSS te verwijderen zonder de pellet van kralen te verstoren.
- Herhaal de stappen 2.2.5 tot 2.2.7 nog drie keer.
- Resuspendeer de kralen door pipetteren en neer in 250 pl BSS.
- Zorg ervoor dat de kraal oplossing is goed gehomogeniseerd. Vervolgens snel aliquot 25 ul van de suspensie in steriele 0,5 ml buizen. De uiteindelijke concentratie van de voorraad kraal oplossing is 1,6 x 10 6 kralen / ul.
- Bewaren bij 4 ° C.
3. Inductie van oculaire hypertensie
Let op: Deel 3 is een twee-persoons bediening. Indien een bepaalde actie moet worden uitgevoerd door een bepaalde persoon, wordt de juiste persoon geïdentificeerd. In het algemeen Persoon 1 verzorgt de muis onder de microscoop tijdens Person 2 rresponsabilisering voor het manipuleren van de micro-pomp. De totale duur van de chirurgische procedure moet minder dan 10 min (stappen 3,9-3,17).
- Werkzaamheden uitvoert bij volwassen C57BL / 6-muizen. Huis muizen in een standaard omgeving met toegang tot voedsel en water ad libitum. In dit artikel gebruiken vrouwelijke C57BL / 6 muizen tussen de 3 en 4,5 maanden oud. Dit kan echter worden aangepast protocol mannetjes en muizen van verschillende leeftijden, evenals andere muizenstammen, waaronder transgene en knockout muizen.
- Meet de basislijn IOP in wakkere muizen voorafgaand aan de anesthesie en microbead injectie met behulp van een gekalibreerde rebound tonometer. Breng een druppel proparacaïne hydrochloride op het hoornvlies.
- Voorzichtig weerhouden de muis door het houden van de huid tussen de oren. Plaats de muis in de stationaire zodat het dier comfortabel en de ogen zijn toegankelijk. Houd de tonometer loodrecht op het corneale oppervlak en neemt ten minste drie reeksen van tien opeenvolgende aflezingen per oog wordt verkregen waarvanIOP gemiddelde. Het meten van IOP wakkere muizen voorkeur anesthesiegerelateerde effecten op IOP omzeilen. Als alternatief kan IOP worden gemeten in verdoofde muizen na stap 3.4.
- Bereid een voorraad muis cocktail verdoving mengsel van 20 mg / ml ketamine, 2 mg / ml xylazine en 0,4 mg / ml acepromazine.
- Anesthesie induceren bij muizen door intraperitoneale toediening van de cocktail mengsel (1 ul / g lichaamsgewicht). Het gebruik van een injecteerbaar anestheticum cocktail voorkeur boven gas anesthetica (bijvoorbeeld isofluraan), omdat het zorgt voor flexibiliteit bij het hanteren van de muis hoofd als het dier niet is aangesloten op een inhalatiemasker. Bovendien is de langere termijn herstel vereist met een injecteerbare verdoving zorgt ervoor dat microbolletjes vestigen op de iridocorneale hoek zonder loskomen terug in de voorste kamer.
- Dien 0,05 mg per kg lichaamsgewicht subcutaan buprenorfine.
- Behandel het oog met een tropicamide eye dalen tot pupilverwijding induceren. Vanwege de kleine afmetingen van het muizen voorste kamer, moet de pupil gedilateerd om gemakkelijk te visualiseren de positionering en de vooruitgang van de micronaald gedurende de injectie.
- Toepassen topische zalf op het contralaterale oog (vn bediend) om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
- Bevestig een schone microneedle aan de injectie assemblage van de micro-pomp. Vervang de microneedle na elke operatie om verontreiniging cross-dier te voorkomen.
- Persoon 1: Breng de verdoofd muis om de operationele platform. Onder de microscoop, opdat de pupil volledig verwijd en dat de oculaire spieren ontspannen zodat er geen oogbeweging. De afwezigheid van oogbewegingen zorgt voor stabiliteit tijdens de injectie. Veeg het tropicamide oogdruppels uit het oog met behulp van absorberende swabs.
- Persoon 2: Meng de magnetische microbead oplossing door en neer te pipetteren.
- Met behulp van de micro-pomp, onmiddellijk de MICR ladenoneedle (opgesteld in paragraaf 1) met 1,5 ul van het gehomogeniseerde magnetische microbead-oplossing (2,4 x 10 6 bolletjes). Zorg ervoor dat de luchtbellen afwezig zijn op het puntje van de microneedle. Nadat de micronaald is geladen, voert stap 3,12-3,13 zo snel mogelijk, zodat de magnetische microbead oplossing in een homogene suspensie blijft.
- Plaats de micronaald geladen op een 45 ° hoek geplaatst ventraal ten opzichte van de limbus. Persoon 1: ondersteuning van het oog met behulp van plastic tang. Waarborgen dat de hoek tussen de micronaald en de plastic tang ongeveer 90 °.
- Persoon 2: Met geladen micronaald voorzichtig doorboren de cornea, zodat de punt van de micronaald komt in de voorste kamer. Controleer of de geladen micronaald blijft een 45 ° hoek ten opzichte van de limbus tijdens de punctie. Vermijd elk contact met de lens of de iris. Zorg ervoor dat de microneedle de achterste kamer niet in te voeren. Persoon 1: doorgaan met het oog ondersteunenkunststofleidingen pincet.
- Persoon 1: Zonder de muis hoofd plaatst de magneet naast het oog, tegenover de micronaald tip, de magnetische korrels in de voorste kamer te trekken en contact van de bolletjes met het binnenoppervlak van de cornea te minimaliseren. Persoon 2: De injectiespuit pomp, injecteer 1,5 ul van het magnetische bolletje oplossing in de voorste kamer. De microbead oplossing wordt geïnjecteerd over een periode van 15 tot 30 sec. Persoon 1: Blijf de magneet tegenover de microneedle tip tijdens de gehele duur van de injectie te houden.
- Persoon 2: Zodra de volledige omvang van de kralen is geïnjecteerd, langzaam terug te trekken van de microneedle uit het oog. Persoon 1: oprisping van de microkralen voorkomen, blijven de magnetische korrels naar de voorste kamer te trekken door de magneet naast het oog gedurende 30 60 sec.
- Persoon 1: Met behulp van de magneet, het aantrekken van de kralen om de iridocorneale hoek. Zorg ervoor dat de kralen vormen een gelijkmatig verdeelde ringrond de omtrek van de voorste kamer. Tijdens deze stap vermijden kralen om de cornea als ze de neiging hebben om zich aan de binnenzijde van het hoornvlies bij contact.
- Behandel het geopereerde oog met antibiotische oogdruppel om het risico op infectie.
- Laat de muis om te herstellen op een warmte-pad, totdat helemaal wakker (~ 3-4 uur). Plaats de muis, zodat de geopereerde oog naar boven wordt geconfronteerd. Deze positionering wordt ophoping van de geïnjecteerde korrels voorkomen dat het binnenoppervlak van het hoornvlies door zwaartekracht. Daarnaast zal deze positie de kans op infectie van de geopereerde oog niet in contact komt met bedden en / of andere materialen die in de kooi kan afnemen. Indien een dier toont tekenen van leed toedienen bijkomende doses van buprenorfine zoals nodig.
- Sta muizen te herstellen van de procedure minstens 2 dagen alvorens IOP metingen. Meet IOP zoals beschreven in 3.2. Monitor IOP ten minste eenmaal per week of vaker indien nodig, en op hetzelfde tijdstip van de dag circadiane-fluctuaties te minimaliseren.
- Voor IOP metingen, gebruik dan de contralaterale oog van de geopereerde muis als een interne controle. U kunt ook gebruik maken van metingen van intact, niet-bediend of schijn-geopereerde muizen als naïeve controles.
4. Beoordeling van retinale ganglioncel Soma en Axon Survival
- Perfuseren muizen blootgesteld aan oculaire hypertensie door intracardiale injectie van 0,1 M fosfaatbufferoplossing (PBS) direct gevolgd door ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA).
- Perfuseren intact, niet-geopereerde muizen, zoals beschreven in 4.1 en gebruik ze als ongedeerd controles. Het gebruik van contralaterale ogen uit bediend muizen is niet aan te raden om RGC overleven beoordelen, omdat veranderingen in de contralaterale ogen na letsel gemeld 15,16 en kan data interpretatie verwarren. Als alternatief gebruik schijn-geopereerde ogen geïnjecteerd met 10,5 gl BSS als controles.
- Gebruik microscissors voorzichtig snijd het bindweefsel rond het oog waarmee het van de oogkas. Scheid de optische zenuw van het oog door te snijden ter hoogte van de oogzenuw.
- Met een 30 G naald, een gat in het hoornvlies om penetratie van het fixeermiddel oplossing in het oog mogelijk. Plaats het oog in 4% PFA en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C voor extra fixatie.
- Plaats de oogzenuw in een oplossing die 2% PFA en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat (MW: 214 g / mol) en geïncubeerd O / N bij 4 ° C voor extra fixatie.
5. Kwantificering van RGC Soma Density op Flat-gemonteerde netvliezen
Opmerking: De volgende procedure is een bewerking van een protocol door Nadal-Nicolas et al 17 en schetst de kwantificering van RGC met behulp van een antilichaam tegen de hersenen specifieke homeobox / POU-domein eiwit 3A (Brn3a) op het netvlies flatscreen-mounts.. alternatieve methods voor etikettering RGC kan ook worden gebruikt, waaronder immunohistochemie met een antilichaam tegen RNA-bindend eiwit met meerdere splicing (RBPMS) of retrograde labeling met Fluorogold of DII.
- Onder een stereomicroscoop, verwijder het voorste deel van het oog door een incisie over de gehele limbus tot het hoornvlies gemakkelijk loskomt. Verwijder het hoornvlies en lens. Haal voorzichtig het netvlies van het oog door het maken van sneden langs de ora serrata en de oogzenuw.
- Bereid een retinale flat-mount door vier kleine incisies op gelijke afstand van de omtrek van de retina naar de oogzenuw om duidelijk af te bakenen de vier kwadranten van het netvlies. Met behulp van een kleine borstel, verwijder voorzichtig alle resterende glasvocht van het netvlies. De verwijdering van zoveel mogelijk glasvocht mogelijk cruciaal voor het verkrijgen van een schone en sterke immunohistochemische signaal.
- overdracht van de retina voorzichtig een 48 putjes met vlakke bodem kweekplaat met 0,5% Triton X-100 in PBS zodat het netvliesvrij zwevende. Zorg ervoor dat de ganglion cellaag naar boven is gericht.
- Plaats de petrischaal bij -70 ° C gedurende 15 minuten. Na ontdooien het netvlies, verder permeabilize door tweemaal wassen in vers 2% Triton X-100 in PBS.
- Verdun de Brn3a antilichaam 0,3-0,5 ug / ml met PBS dat 2% Triton X-100 en 2% normaal serum ezel. Incubeer de retina in het Brn3a primaire antilichaamoplossing door voorzichtig schudden O / N bij 4 ° C. Het netvlies moet volledig ondergedompeld in 150 tot 200 gl oplossing op elk moment.
- Verdun de ezel anti-geit IgG secundair antilichaam tot 2 ug / ml met PBS dat 2% Triton X-100 en incubeer het netvlies in deze oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Het netvlies moet volledig ondergedompeld in de antilichaamoplossing allen tijde. Bedek de cultuur plaat met aluminiumfolie voor de resterende stappen om fotobleken te voorkomen.
- Met behulp van een borstel, zorgvuldig het netvlies over te dragen aan een dia, zodat het weefsel ligt zo plat als poslijk. Drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. Monteer met behulp van anti-fade montage medium.
- Bestudeer de retinale flat-mounts onder een fluorescentiemicroscoop. Kwantificeren van het aantal Brn3a positieve RGC in drie niet-overlappende gebieden per retinale kwadrant zoals beschreven. 18
6. Kwantificering van RGC Axonen op Optic Nerve Dwarsdoorsneden
- Verzamel de oogzenuw uit stap 4.5 en incubeer in 2% osmiumtetroxide (OsO 4, MW 254,23 g / mol) gedurende 2 uur.
Let op: Vanwege de hoge toxiciteit, osmiumtetroxide moet worden in een zuurkast met adequate laboratorium kledij behandeld. - Uitdrogen de oogzenuw door onderdompeling in toenemende concentraties ethanol (50%, 70%, 90%, 95% en 100%) gedurende 15 minuten elk.
- Bereid de epoxyhars met het volgende recept: 15,72 ml insluiten-812, 6,45 ml dodecenylbarnsteenzuuranhydride, 7,83 ml methyl nadinezuur anhydride, 0,45 ml DMP-30.
- Opeenvolgend uitbroeden de oogzenuw in oplossingen bestaandevan de volgende verhoudingen van epoxyhars naar propyleenoxide (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 en 1: 0. De oogzenuw wordt geïncubeerd in elke oplossing bij kamertemperatuur een O / N periode.
- Incubeer optische zenuwen ingesloten in 100% epoxyhars (laatste stap van 6,4) bij 60 ° C gedurende nog 48 uur.
- Genereer semi-dunne optische zenuw dwarsdoorsneden (0,75 pm) met behulp van een microtoom.
- Vlek oogzenuw doorsneden met 1% toluidine blauw.
- Kwantificeren van de RGC axonen in vijf niet-overlappende gebieden van elke oogzenuw sectie zoals beschreven 19.
Representative Results
De injectie van magnetische microkralen in de voorkamer van volwassen muizen beschreven in dit protocol resulteerde in een robuuste en reproduceerbare verhoging van IOP. Een week na de ingreep, IOP toe van 10 ± 0,6 mm Hg (gemiddelde ± SEM), de gemiddelde basislijn IOP contralaterale ogen, op 19 ± 0,5 mm Hg bij hypertensieve ogen (t-test van Student, *** p <0,001, n = 12, Tabel 1, Figuur 2). IOP gestabiliseerd en daarna bleef verhoogd met gemiddeld 20 mm Hg gedurende ten minste 6 weken, de langste tijd-punt in deze studie. De gemiddelde piek IOP in microbead geïnjecteerde ogen bij 2, 3 en 6 weken na de operatie was 25 mm Hg. De meeste van de behandelde muizen ontwikkelden aanhoudend hoge IOP derhalve het protocol niet een tweede injectie van microparels vereisen.
Om het tijdsverloop van RGC verlies te beoordelen in dit model, RGC soma wareneerst gekwantificeerd door immunokleuring met Brn3a, een RGC-specifieke marker 17. Het aantal Brn3a-positieve cellen werd gekwantificeerd op vlakke Gedragen netvlies op 1, 2, 3 en 6 weken na inductie van oculaire hypertensie. Hoewel een significante IOP-verhoging werd waargenomen al 1 week na microbead injectie, werd geen significant verlies van RGC soma waargenomen binnen de eerste 2 weken van de behandeling (figuur 3). Substantiële RGC dood (22%) was echter duidelijk op 3 weken (2430 ± 67 RGCs / mm2, gemiddelde ± SEM, n = 12) en 6 weken (2350 ± 74 RGCs / mm2, n = 10) post- inductie van oculaire hypertensie, vergeleken met gezonde controle ogen-un bediende muizen (3141 ± 49 RGCs / mm2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).
Dysfunctie en degeneratie van RGC axonen is een kardinale functie van glaucoom. Daarom werd onderzocht op axonaal verlies 3 en 6 weken na injectie microkorrelskwantificering van RGC axons in oogzenuw doorsneden gekleurd met toluïdine blauw (Figuur 4). Een aanzienlijk verlies van RGC axonen (25%) werd waargenomen na 3 weken (28.401 ± 702 axons / zenuw, gemiddelde ± SEM, n = 5) en 6 weken (29.426 ± 948 axons / zenuw, n = 6) na injectie van microparels tegenover intacte optische zenuwen van un-bediende ogen (39.467 ± 137 axons / zenuw, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat de injectie van magnetische microkralen in de muis voorste kamer leidt tot reproduceerbare en duurzame IOP verhoging die resulteert in RGC soma en axon degeneratie.
| Tijd na de operatie OHT | N | Mean IOP (mmHg) ± SEM | Peak IOP (mmHg) | ||||
| contralaterale | glaucoma | difference | contralaterale | glaucoma | |||
| 1 week | 12 | 10 ± 0,4 | 19 ± 0,5 | 9 ± 0,6 | 12 ± 0,4 | 22 ± 0,6 | |
| 2 weken | 13 | 11 ± 0,5 | 20 ± 0,8 | 9 ± 0,5 | 12 ± 0,9 | 25 ± 0,7 | |
| 3 weken | 10 | 11 ± 0,8 | 20 ± 0,7 | 10 ± 0,9 | 13 ± 0,2 | 25 ± 0,9 | |
| 6 weken | 12 | 12 ± 0,5 | 20 ± 0,6 | 9 ± 0,7 | 13 ± 0,5 | 24 ± 0,6 | |
Tabel 1. Verhoging van de intra-oculaire druk in het Muizen Magnetic Microbead Occlusiover Model. In wakkere vrouwelijke C57 BL / 6 muizen, IOD werd gemeten met een geijkte rebound tonometer. Uitgevoerd ogen weergegeven verhoging van IOP gedetecteerd door een week na de operatie dat verhoogde gedurende ten minste zes weken na de procedure.
Figuur 1. Workflow van de stappen die betrokken zijn in het Muizen Magnetic Microbead occlusie Model van glaucoom. Stap-voor-stap overzicht van alle eerder uitgevoerde, tijdens de procedures, en na de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Verhoging van de intra-oculaire druk in het Muizen Magnetic Microbead Occlusion Model. In wakkervrouwelijke C57 BL / 6 muizen, IOD werd gemeten met een geijkte rebound tonometer. De IOP van microbead geïnjecteerde ogen waren significant verhoogd op één week na de operatie (ANOVA, p <0,001). De IOP bleef significant verhoogd ten opzichte van de contralaterale oog van geïnjecteerde muizen gedurende tenminste 6 weken (ANOVA, p <0,001). (Intact: n = 12; 1 week: n = 12, 2 weken: n = 13, 3 weken: n = 10, 6 weken: n = 12). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. retinale ganglion celdood in het Muizen magnetische microkorrels Occlusie Model. RGCs werden gevisualiseerd door immunokleuring van plat gemonteerde netvlies behulp Brn3a in intacte controle netvlies (A) en glaucomateuze retina na 3 en 6 weken na injectie microbead inducerenoculaire hypertensie (OHT) (B, C). Schaalbalken: 20 urn. (D) Kwantitatieve analyse bevestigde dat microbead injectie resulteerde in significant RGC soma verlies bij 3 en 6 weken na de ingreep in vergelijking met controle ogen. De dichtheid van RGC soma in intacte, niet-glaucomateus C57 / BL6 muizen wordt getoond als referentie (witte balken, 100% overleving). De waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM (Intact: n = 23; 1 week: n = 6, 2 weken: n = 6, 3 weken: n = 12, 6 weken: n = 10, ANOVA, *** p < 0.001). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Axonale Degeneratie in het Muizen Magnetic Microbead Occlusion Model. RGC axonen werden zichtbaar gemaakt door kleuring van oogzenuw doorsneden met toluidine blauw ingezonde controle (A) en glaucomateuze retina na 3 en 6 weken na injectie microbead oculaire hypertensie (OHT) (B, C) te induceren. Schaalbalken: 10 urn. (D) Kwantitatieve analyse bevestigde dat microbead injectie resulteerde in significant RGC axon verlies bij 3 en 6 weken na de ingreep in vergelijking met controle ogen. De dichtheid van RGC axonen in intacte, niet-glaucomateus C57 / BL6 muizen wordt getoond als referentie (witte balken, 100% overleving). De waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM (Intact: n = 4; 3 weken: n = 5, 6 weken: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Discussion
De video techniek hier gepresenteerde geeft gedetailleerde stap-voor-stap instructies over hoe om intracamerale injectie van magnetische microkralen uit te voeren om effectief en reproduceerbaar induceren IOP verhoging in muizen. Deze procedure resulteert in aanhoudende stijging IOP dat aanvullende injecties niet vereist en bevordert detecteerbare RGC soma en axon schade in de eerste 3 weken van oculaire hypertensie induction.Elevated IOD is een belangrijke risicofactor voor glaucoom bij mensen. Daarom is dit een belangrijke murine oculaire hypertensie-afhankelijke glaucoom model kan een breed scala van toepassingen heeft.
Een gemeenschappelijk nadeel in verband met injectie van microbolletjes in de voorkamer betreft reflux kraal via de injectieplaats, wanneer de naald wordt teruggetrokken, wat vaak leidt tot slechts gedeeltelijke obstructie van uitstroming van water en verhoogde variabiliteit. Om dit probleem aan te pakken, werden enkele belangrijke wijzigingen doorgevoerd. Firs t, de goede voorbereiding van een schone, scherpe micronaald glas met een gefacetteerde afschuining is essentieel voor een succesvolle injectie van de microkralen. Een goed bereid micronaald maakt gecontroleerde en soepele penetratie van de cornea met minimale toepassing van druk op de gevoelige oogoppervlak. De kleine hoornvlies punctie voorkomt terugstromen van microbolletjes. Bovendien, de fijne micronaald vermindert het risico op beschadiging van nabijgelegen structuren zoals de iris en de lens, wat kan leiden tot niet-ziekte gerelateerde ontsteking. Anderzijds, de toepassing van een handheld magneet strategische oculaire gebieden tijdens en na de injectie is een cruciaal aspect van deze techniek. Tijdens de injectie wordt de magneet gebruikt om het magnetische microkralen vestigen op de voorste kamer reflux voorkomen van de microkralen wanneer de micronaald wordt onttrokken. Na de injectie wordt de magneet vervolgens gebruikt om de microkralen de iridocorneale hoek direct aan waterige humor uitstroom blokkeren.
tent "> ander probleem vaak aangetroffen in microbead occlusie modellen is dat herhaald bead injecties vaak nodig voor het bereiken van aanhoudende IOP verhoging 10,11. Dit kan het gevolg zijn van microkralen loskomen uit de iridocorneale hoek tijd. De combinatie van een handheld magneet, zoals hierboven beschreven, en de positionering van de muis postoperatief verbetert het resultaat. het gebruik van injecteerbare anesthetica, waardoor flexibiliteit om de kop tijdens de procedure bewegen en vereisen een langere postoperatieve herstelperiode, de voorkeur. Plaatsing van de muis met het geopereerde oog naar boven een paar uur na de operatie bij aan de regeling van de microkralen iridocorneale hoek en vermindert het risico van het losmaken terug in de voorste kamer.Ervoor zorgen dat het aantal geïnjecteerde kralen is relatief consequent is een cruciale stap om inter-dier variaties te minimaliseren. Aangezien de microbolletjes vestigen op de bottom van de buis, moet de oplossing volledig microbead homogeniseren en het geschikte volume in de micronaald trekken tijdig. Injectie van minder korrels in de voorste kamer kan leiden tot onvolledige blokkering van de waterige humor drainage structuren, die waarschijnlijk resulteren in een slechte of variabele hoogte IOP. Van de nota, maar het uiteindelijke doel van de microbead injectie is te verheffen IOP, voorzichtigheid is geboden bij IOP metingen van wakker muizen zijn hoger dan de piekwaarden gemeld in deze studie (~ 25 mmHg). Extreem hoge IOP het risico van ischemische schade en kan ook leiden tot pijn aan het dier. De hoogte van IOP moet worden beschouwd als een van de vele factoren die het succes van de operatie te evalueren. Als zodanig moet het resultaat van de procedure worden gemeten gebaseerd op verscheidene parameters zoals IOP hoogte, RGC dood soma en axon verlies.
Hoewel de hier beschreven protocol levert succesvolste microkralenly gestabiliseerd op de hoek, een mogelijke beperking van dit model is dat de kralen die blijven zweven in de voorste kamer kan interfereren met levende retinale beeldvorming door de cornea, en elektrofysiologische en gedrags- testen die effectieve doorgang van licht vereisen. Een ander belangrijk aspect te overwegen bij het gebruik van deze microbead occlusie model is dat de omvang van IOP elevatie gevolgd RGC degeneratie varieert met de leeftijd en genetische achtergrond van de geopereerde muizen [4]. Daarom zal de omvang van de IOP verhoging en de tijdlijn van RGC degeneratie moeten worden bepaald voor elke specifieke transgene muis lijn en / of leeftijd.
Een kenmerk van dit model is dat verhoogde IOP leidt tot geleidelijk verlies van RGC dood tijdens de eerste drie weken na microbead injectie en significante RGC dood waargenomen bij 3 weken na de ingreep. Vandaar dit model maakt het onderzoek van de eerste en / of subtiele veranderingen die optreden in het disease, voorafgaand aan het RGC soma en axon verlies openlijke. Een significante toename van RGC dood werd niet waargenomen tussen 3 en 6 weken na inductie van oculaire hypertensie. In feite, RGC soma en axon verlies bleef stabiel op ~ 22-25% tussen 3 en 6 weken ondanks succesvolle en aanhoudende IOP elevatie deze tijdstippen. Een langere duur van aanhoudende IOP kan nodig zijn voor extra RGC verlies optreedt in C57BL / 6 muizen, die lijken beter bestand tegen RGC schade in vergelijking met andere muizenstammen. 5 aanvullende modificaties in het protocol hier gepresenteerde name wijziging van korrelafmeting en additionele injecties, nodig zijn om RGC verlies op latere tijdstippen bestuderen. Daarom ons protocol is geschikt voor studies gericht op vroegtijdige pathofysiologische veranderingen die correleren met bescheiden RGC neurodegeneratie om intrede en vroege progressie bij menselijke glaucoom relevant zijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
