Summary
Her præsenteres en protokol til fremkaldelse af okulær hypertension i det murine øjet, der resulterer i tab af retinale ganglieceller som observeret i glaukom. Magnetiske mikroperler injiceres i forkammeret og tiltrukket af iridokorneal vinkel anvendelse af en magnet til at blokere udstrømningen af kammervæske.
Abstract
Anvendelsen af gnaver-modeller af glaukom har været vigtigt at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for patofysiologien af denne multifaktoriel neurodegenerativ sygdom. Med fremkomsten af talrige transgene muselinjer er der stigende interesse for inducerbare murine modeller af okulær hypertension. Her præsenterer vi en okklusion model af glaukom baseret på injektion af magnetiske mikroperler ind i det forreste kammer i øjet under anvendelse af en modificeret mikronål med en facetteret fasning. De magnetiske mikroperler er tiltrukket af iridokorneal vinkel ved anvendelse af en håndholdt magnet til at blokere dræning af kammervand fra det forreste kammer. Denne afbrydelse i vandige dynamics resulterer i en støt stigning af intraokulært tryk, som efterfølgende fører til tab af retinale ganglieceller, som observeret i humane glaukompatienter. Den mikroperle okklusion model præsenteres i dette manuskript er enkel i forhold til andre inducerbare modeller af glaukom og også megeteffektiv og reproducerbar. Vigtigt er det, de ændringer, der findes her minimere almindelige problemer, der ofte opstår i okklusion modeller. Først anvendelsen af en affaset glas mikronål forhindrer tilbagestrømning af mikroperler og sikrer, at minimal sker skade på hornhinden under injektionen, hvilket reducerer skaderelaterede effekter. For det andet er anvendelsen af magnetiske mikroperler sikrer evnen til at tiltrække de fleste perler til iridokorneal vinkel, effektivt at reducere antallet af perler flyder i forkammeret undgå kontakt med andre strukturer (f.eks., Iris, linse). Endelig er anvendelse af en håndholdt magnet giver mulighed for fleksibilitet ved håndtering af små mus øje til effektivt lede magnetiske mikroperler og sikre, at der er ringe tilbagesvaling af mikroperlerne fra øjet når mikrokanylen trækkes tilbage. Sammenfattende mikroperlen okklusion musemodel præsenteres her er et kraftfuldt undersøgende værktøj til at studere neurodegenerative forandringer, der sker i løbet af indtræden og progression af Glaukoma.
Introduction
Glaukom er en progressiv og irreversibel blændende tilstand, der vil påvirke en anslået 80 millioner mennesker verden over i 2020 en. I glaukom patienter, er synstab forårsaget af den selektive død af retinale ganglieceller (RGC'er), output neuroner, der overfører visuelle informationer fra nethinden til hjernen. Glaukom er en aldersrelateret neurodegenerativ sygdom med mange risikofaktorer, hvoraf den mest almindelige er forhøjet intraokulært tryk (IOP). Faktisk IOP er den eneste modificerbare risikofaktor i grøn stær og nuværende behandlinger fokuserer udelukkende på at styre trykket i øjet. Men flere genetiske, cellulære og miljømæssige faktorer påvirker debut og progression af denne sygdom. Derfor forstå de forskellige mekanismer, der i sidste ende bidrager til neuronal død er vigtigt at udvikle effektive behandlinger for glaukom.
Dyremodeller af grøn stær er afgørende for at studere sygdommen patofysiologi og identificere og testlovende lægemidler. Den øgede tilgængelighed af transgene mus linjer, herunder betingede knockout stammer og mus, der bærer genetisk kodet fluorescerende sporstoffer har drevet behov for inducerbare murine glaukom modeller. Adskillige gnaver modeller af glaukom er blevet udviklet i årenes løb (anmeldt i 2,3). I mange af disse modeller, er glaukom induceres ved at afbryde kammervæske dynamik, hvilket resulterer i forhøjelse af IOP. Okklusion modeller, i hvilke mikroperler eller andre stoffer injiceres ind i det forreste kammer af øjet for at blokere vandig dræning, har vundet popularitet i de senere år dels på grund af deres relative lethed til at øge IOP 4-14.
Mikroperlen okklusion model af glaukom, først udføres i primater 12, kaniner 8, og rotter 4,9,11, blev for nylig tilpasset til anvendelse i mus 5,6,10. I disse undersøgelser den intrakameral injektion af polystyren mikroperler, alene eller ikombination med et viskoelastisk materiale, resulterede i IOP elevation fører til efterfølgende RGC død 6,10. Men reflux når nålen trækkes tilbage fra øjet og løsner af mikroperler fra iridokorneal vinkel er fælles problemer, der opstår i løbet af proceduren. For at minimere disse ulemper, har magneter blevet anvendt til at tiltrække de magnetiske mikroperler til iridokorneal vinkel af øjet 4,9.
Protokollen beskrevet her er en modificeret procedure baseret på tidligere undersøgelser 9,10 der bruger magnetiske mikroperler og en håndholdt magnet tilpasset til muse øje (figur 1). Flere vigtige ændringer er blevet indført i vores protokol at sikre en effektiv og reproducerbar IOP stigning i mus. Først injektion af mikroperler med en og omhyggeligt forberedt glas mikronål med en facetteret fasning. De resulterende glatte overflader af mikronålen samt dens skarpe spids sikrer, at minimal skade erpåført som det punkterer hornhinden. Anvendelsen af dette glas mikronål resulterer også i øget kontrol når mikronål spids kommer ind i forkammeret, hvorved risikoen for at beskadige nærliggende strukturer såsom iris og linsen. Desuden den lille injektion læsion letter corneal selvreparerende og reducerer uønskede skaderelaterede effekter.
For det andet, injektion af magnetiske mikroperler og anvendelse af en håndholdt magnet tillade nøjagtig styring for at tiltrække perlerne til iridokorneal vinkel i små mus øjet. Magnetiske mikrokugler, der er 4,5 um i diameter blev brugt, fordi denne microbead størrelse ikke tilstoppe forberedt mikronålen åbning og vigtigere, når injiceres, disse mikrokugler effektivt blokeret dræning af vandig humor. Denne fremgangsmåde ikke kun reducerer tilbageløb af de injicerede mikroperler, men sikrer også, at et maksimalt antal mikroperler akkumuleres i målområdet til effektivt at blokere kammervandet dræning. Furthermore, denne strategi reducerer også antallet af perler flyder i forkammeret undgå kontakt med andre strukturer, såsom iris og linsen, og forhindrer passage til det posteriore kammer. Kollektivt, disse ændringer sikrer, at mikroperle injektion kirurgi udføres med relativ lethed og i rette tid resulterer i en meget reproducerbar, effektiv og vedvarende induktion af okulær hypertension hos mus.
Protocol
Følgende procedure blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske Rådet om Animal Care for brug af forsøgsdyr og erklæringen for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Visual Forskning fra Foreningen for Forskning i Vision og Ophthalmology (ARVO).
1. Forberedelse af mikrokanylen for Anterior intrakameral Injection
- Med en aftrækker, generere en mikronål fra en borsilikatglas kapillær
- Under et mikroskop, så brug en skarp kniv til forsigtigt at skabe en åbning i spidsen af mikronålen. Den resulterende åbning bør have en elliptisk form med en større og mindre akse diameter på ca. 190 um og 70 um, hhv. Måle arealet af den forbehandlede mikronål åbning af første optage billeder med en lineal anbragt under mikroskopet efterfulgt af kvantificering anvendelse af billedanalyse-software.
- I mikropipetten affasning systemet, placere mikrokanylen på en 20 Degree vinkel i forhold til affasning pladen, så mikronålen åbning rører pladen. Facet i ca. 10 minutter, indtil kanterne er flade og glatte. Tilsæt et par dråber destilleret vand til at støtte i processen.
- Drej mikronål at bevel de to kanter, der omgiver åbningen, indtil spidsen er skarp.
- Fjern alle rester og vand fra mikronål spids åbning ved anvendelse af en aerosol duster.
- Nøje undersøge det færdige mikronål under et mikroskop. Kassér mikronåle med frakturer at minimere risikoen for mikrokanylen brud under kirurgi.
- Sterilisere mikrokanylen ved skylning først med ethanol, derefter med steril balanceret saltopløsning (BSS).
2. Forberedelse af Magnetic mikroperler Solution
Bemærk: De magnetiske mikroperler anvendes i denne undersøgelse er coatet med epoxygrupper. For at undgå eventuelle negative effekter, såsom sammenklumpning af perlerne og uønskede molekylære interaktioner, skal disse epoxygrupperførst fjernes fra mikroperlerne før du fortsætter med injektion kirurgi.
- Fjernelse af epoxygrupper fra magnetiske perler
- Der fremstilles en opløsning af 0,02 M natriumhydroxid (NaOH, MW 39,997 g / mol) i 10 x Tris-puffer (MW 121,14 g / mol).
- Forsigtigt vortexes bestanden af magnetiske mikroperler (4.5 um diameter, 4 x 10 8 perler / ml), indtil perlerne er jævnt suspenderet i opløsning.
- Hurtigt pipette 1 ml magnetiske perler opløsning i 50 ml 0,02 M NaOH i 10 x Tris-buffer.
- Rotere i 24 timer ved stuetemperatur for at fjerne epoxygrupperne fra perlerne.
- Indsamle perlerne ved at fastgøre en magnet til bunden af røret. Orientere røret vandret for at sikre, at alle perlerne er tiltrukket af magneten. Rotere i yderligere 4 timer ved stuetemperatur.
- Med en mikropipette, forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre pellet af perler.
- Forsigtigt vortexes pellet i 50 ml 10x TRIS buffer indtil perlerne er godt suspenderet.
- Gentag trin 2.1.4 til 2.1.6.
- Koncentration og Resuspension af Magnetiske Microbeads i Steril Balanced Salt Solution
Bemærk: Det er nødvendigt at koncentrere bestanden af magnetiske perler opløsning i steril balanceret saltopløsning (BSS) for at nå en slutkoncentration på 1,6 x 10 6 perler / pl således at 2,4 x 10 6 perler kan injiceres ind i det forreste kammer i en slutvolumen på 1,5 pi, som er passende for de små mus øjet.
- Vask perlerne i 5 ml ultrarent laboratoriekvalitet vand ved forsigtigt hvirvelbehandling i 2 min.
- Indsamle perlerne ved at tiltrække dem til bunden af røret med en magnet.
- Med en mikropipette, forsigtigt fjerne vandet uden at forstyrre pellet af perler.
- Gentag trin flere 2.2.1 til 2.2.3 tre gange.
- I en laminær strømning, vaskes perlerne med 500 pi BSS efter pipetting op og ned. Udfør de resterende trin i dette afsnit under sterile forhold i en laminar flow hætte.
- Indsamle perlerne ved at tiltrække dem til bunden af røret med en magnet.
- Med en mikropipette, forsigtigt fjerne BSS uden at forstyrre pellet af perler.
- Gentag trin flere 2.2.5 til 2.2.7 tre gange.
- Resuspender ved pipettering perlerne op og ned i 250 pi BSS.
- Sørg for, at perlen løsning er godt homogeniseret. Derefter hurtigt udportionerer 25 pi af suspensionen i sterile 0,5 ml rør. Slutkoncentrationen af bestanden perleopløsning er 1,6 x 10 6 perler / pl.
- Opbevares ved 4 ° C.
3. Induktion af okulær hypertension
Bemærk: Afsnit 3 er en to-personers operation. I tilfælde af at en bestemt handling skal udføres af en bestemt person, er den rette person identificeret. Generelt Person 1 håndterer musen under mikroskop, mens Person 2 er responsible til manipulering mikrosproejten pumpe. Den samlede varighed af den kirurgiske procedure bør være mindre end 10 min (trin 3,9-3,17).
- Udfør procedurer i voksne C57BL / 6-mus. House mus i en standard miljø med adgang til foder og vand ad libitum. I dette papir, bruger kvindelige C57BL / 6-mus mellem 3 og 4,5 måneders alderen. Dog kan denne protokol tilpasses til hanner og mus af forskellige aldre, samt andre musestammer, herunder transgene og knockout-mus.
- Mål baseline IOP i vågen mus før anæstesi og mikroperle injektion under anvendelse af en kalibreret rebound tonometer. Påfør en dråbe proparacainhydrochlorid på hornhinden.
- begrænse forsigtigt musen ved at holde huden mellem ørerne. Placer musen på benchtop således at dyret er komfortable og øjnene er tilgængelige. Hold tonometer vinkelret på hornhindens overflade og tage mindst tre sæt af ti på hinanden følgende aflæsninger pr øje til opnåelse af enIOP gennemsnit. Målingen af IOP i vågen mus foretrækkes at omgå anæstesi-relaterede effekter på IOP. Alternativt kan IOP måles i bedøvede mus efter trin 3.4.
- Forbered en bestand mus cocktail anæstesi blanding sammensat af 20 mg / ml ketamin, 2 mg / ml xylazin, og 0,4 mg / ml acepromazin.
- Narkosen hos musen ved intraperitoneal administration af cocktail blanding (1 pl / g legemsvægt). Anvendelsen af et injicerbart anæstetikum cocktail foretrækkes frem gas anæstetika (f.eks isofluran), fordi det giver mulighed for fleksibilitet ved håndtering af muse hoved som dyret ikke er tilsluttet en indånding maske. Desuden, jo længere restitutionsperiode påkrævet med en injicerbar bedøvelsesmiddel sikrer, at mikroperler afvikle på iridokorneal vinkel uden løsner tilbage i forkammeret.
- Administrere 0,05 mg pr kg legemsvægt af buprenorphin subkutant.
- Behandl øjet med en tropicamid eye drop at inducere elev dilatation. På grund af den lille størrelse af den murine forreste kammer, skal eleven dilateres til nemt visualisere positionering og fremføring af mikrokanylen under indsprøjtning.
- Påfør aktuelle salve på den kontralaterale øje (un-drevne) for at undgå udtørring af hornhinden under proceduren.
- Vedhæft en ren mikronål til injektion samling af mikrosproejten pumpen. Udskift mikronålen efter hver operation for at undgå forurening på tværs af dyr.
- Person 1: Overfør bedøvet musen til operativsystemet platform. Under mikroskopet, at eleven er fuldt dilateret, og at de okulære muskler er afslappede, så der er ingen øjenbevægelser. Fraværet af øjenbevægelser sikrer stabilitet under injektionen. Tør forsigtigt tropicamid øjendråber fra øjet ved hjælp af absorberende servietter.
- Person 2: Bland den magnetiske mikroperle opløsning ved pipettering op og ned.
- Brug mikrosproejten pumpe, straks indlæse microneedle (udarbejdet i afsnit 1) med 1,5 pi af den homogeniserede magnetiske microbead løsning (2,4 x 10 6 kugler). Sørg for, at luftbobler er fraværende på spidsen af mikronålen. Efter mikronålen er indlæst, udfører trin 3.12 til 3.13 hurtigst muligt, således at den magnetiske mikroperle opløsningen forbliver i en homogen suspension.
- Placer læsset mikronål i en 45 ° vinkel, placeret fortil i forhold til limbus. Person 1: støtte øjet ved hjælp af plast pincet. Sikre, at vinklen mellem mikronålen og plast pincet er ca. 90 °.
- Person 2: med den fyldte mikronål, forsigtigt punktere hornhinden, således at spidsen af mikronål kommer ind i forkammeret. Sørg for, at læsset mikronål forbliver på et 45 ° vinkel i forhold til limbus under punktering. Undgå enhver kontakt med objektivet eller iris. Sikre, at mikronålen ikke kommer ind i bagkammeret. Person 1: fortsætte med at støtte øjetved hjælp af plast pincet.
- Person 1: Uden flytte musen hoved, placere magneten ved siden af øjet, modsat mikronål spids, for at tiltrække de magnetiske perler i forkammeret og minimere kontakt af perlerne med den indre overflade af hornhinden. Person 2: Brug mikrosproejten pumpe, injicere 1,5 ul af magnetisk perle opløsningen i det forreste kammer. Mikroperlen injiceres over en periode på 15 til 30 sek. Person 1: Fortsæt med at holde magneten modsat mikronålen spidsen under hele varigheden af injektionen.
- Person 2: Når den fulde mængde af perler er blevet injiceret, langsomt trække mikronål fra øjet. Person 1: For at undgå tilbageløb af mikroperlerne, fortsætte med at tiltrække de magnetiske perler mod forreste kammer ved at holde magneten siden af øjet i yderligere 30 til 60 sek.
- Person 1: Ved hjælp af magnet, tiltrække perlerne til iridokorneal vinkel. Sørg for, at perlerne danner en jævnt fordelt ringrundt om omkredsen af det forreste kammer. Under dette trin undgå at tiltrække perler til hornhinden som de har en tendens til at klæbe til den indre overflade af hornhinden ved kontakt.
- Behandl det opererede øje med et antibiotikum øjendråber for at minimere risikoen for infektion.
- Tillad musen til at genvinde på en varmepude, indtil helt vågen (~ 3 til 4 timer). Placer musen så det opererede øje vender opad. Denne positionering vil forhindre akkumulering af de injicerede perler til den indre overflade af hornhinden ved tyngdepåvirkning. Derudover vil denne position mindske potentialet for infektion, da det opererede øje ikke vil være i kontakt med nogen strøelse og / eller andre materialer, der kan være til stede i buret. I tilfælde af at et dyr udviser nogen tegn på nød, administrere yderligere doser af buprenorphin efter behov.
- Tillad mus at komme sig fra proceduren i mindst 2 dage, før du tager IOP målinger. Mål IOP som beskrevet i 3.2. Monitor IOP mindst en gang om ugen eller oftere, efter behov, og på samme tidspunkt af dagen for at minimere døgnrytmen-udsving.
- For IOP målinger, bruge den kontralaterale øje fra det opererede mus som en intern kontrol. Alternativt kan du bruge målinger fra intakte, ikke-drevne eller skinopererede mus som naive kontroller.
4. Vurdering af retinal Ganglion Cell Soma og Axon overlevelse
- Perfundere mus udsat for okulær hypertension ved intracardial injektion af 0,1 M phosphatbufferopløsning (PBS) umiddelbart efterfulgt af iskold 4% paraformaldehyd (PFA).
- Perfundere intakte, ikke-opererede mus som beskrevet i 4.1 og bruge dem som uskadte kontroller. Brugen af kontralaterale øjne fra betjente mus anbefales ikke at vurdere RGC overlevelse, fordi ændringer i kontralaterale øjne efter skaden er blevet rapporteret 15,16 og kan forvirre data fortolkning. Alternativt kan du bruge skinopererede øjne injiceres med en.5 Ul BSS som kontroller.
- Brug microscissors, skar forsigtigt bindevæv omkring øjet at isolere det fra øjenhulen. Adskil synsnerven fra øjet ved at skære det på niveau med det optiske nervehoved.
- Anvendelse af en 30 G nål, lave et hul i hornhinden for at tillade indtrængning af fiksativ opløsning i øjet. Placer øjet i 4% PFA og inkuberes i 1 time ved 4 ° C i yderligere fiksering.
- Placer synsnerven i en opløsning indeholdende 2% PFA og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylat (MW: 214 g / mol) og inkuber O / N ved 4 ° C i yderligere fiksering.
5. Kvantificering af RGC Soma Density på Flat-monterede nethinder
Bemærk: Følgende procedure er tilpasset fra en protokol af Nadal-Nicolas et al 17 og skitserer kvantificering af RGC'er bruger et antistof mod hjernen-specifikke homeobox / POU domænenavn protein 3A (Brn3a) på retinale flat-mounts.. Alternativ methods til mærkning af RGC'er kan også anvendes, herunder immunhistokemi med et antistof mod RNA-bindende protein med multiple splejsning (RBPMS) eller retrograd mærkning med Fluorogold eller Dil.
- Under et dissektionsmikroskop, fjerne den forreste del af øjet ved at gøre et indsnit langs hele limbus indtil hornhinden løsnes let. Fjern hornhinden og linsen. frigøre forsigtigt nethinden fra øjet ved at gøre nedskæringer langs ora serrata og synsnerven.
- Forbered en retinal flad-mount ved at lave fire små ækvidistante indsnit fra periferien af nethinden mod synsnerven til klart at afgrænse de fire retinale kvadranter. Ved hjælp af en lille pensel, forsigtigt fjerne eventuelt resterende glaslegemet fra nethinden. Fjernelsen af så meget glaslegemet som muligt er afgørende for at opnå en ren og stærk immunohistokemisk signal.
- overføre omhyggeligt nethinden til en 48-brønds fladbundet kulturplade indeholdende 0,5% Triton X-100 i PBS, således at nethinden erfrit svævende. Sørg for, at ganglion cellelag vender opad.
- Placer dyrkningsplade ved -70 ° C i 15 min. Efter optøning nethinder, yderligere permeabilisere af vask to gange i frisk 2% Triton X-100 i PBS.
- Fortynd Brn3a antistof til 0,3 - 0,5 ug / ml med PBS indeholdende 2% Triton X-100 og 2% normalt æsel serum. Inkubér nethinden i Brn3a primære antistof opløsning ved forsigtigt at ryste O / N ved 4 ° C. Nethinder bør fuldt nedsænket i 150 til 200 pi opløsning på alle tidspunkter.
- Fortynd æsel-anti-gede-IgG sekundært antistof til 2 ug / ml med PBS indeholdende 2% Triton X-100 og inkuberes nethinden i denne opløsning i 2 timer ved stuetemperatur under forsigtig rystning. Nethinden bør fuldt nedsænket i antistofopløsningen på alle tidspunkter. Dæk kultur plade med alufolie for de resterende skridt til at forhindre fotoblegning.
- Med en børste, omhyggeligt overføre nethinden til et objektglas, således at vævet ligger så flade som posligt. Lufttørre i 10 min. Monter hjælp af anti-fade montering medium.
- Undersøg de retinale flade-mounts under en fluorescerende mikroskop. Kvantificer antallet af Brn3a positive RGC'er i tre ikke-overlappende områder pr retinal kvadrant som beskrevet. 18
6. Kvantificering af RGC Axoner på synsnerven tværsnit
- Saml synsnerven fra trin 4.5 og inkuberes i 2% osmiumtetroxid (OsO4, MW 254,23 g / mol) i 2 timer.
Advarsel: På grund af sin høje toksicitet, osmiumtetraoxid skal håndteres i et stinkskab med passende laboratorium påklædning. - Dehydrere synsnerven ved nedsænkning i stigende koncentrationer af ethanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100%) i 15 min hver.
- Forbered epoxyharpiksen under anvendelse af følgende opskrift: 15,72 ml Indlejring-812, 6,45 ml dodecenyl ravsyreanhydrid, 7,83 ml nadic methyl anhydrid, 0,45 ml DMP-30.
- Sekventielt inkubere synsnerven i opløsninger sammensataf følgende forhold mellem epoxyharpiks til propylenoxid (MW 58.08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 og 1: 0. Synsnerven inkuberes i hver opløsning ved stuetemperatur i en O / N periode.
- Inkuber optiske nerver indlejret i 100% epoxyharpiks (sidste trin fra 6,4) ved 60 ° C i yderligere 48 timer.
- Generere semi-tynde synsnerven tværsnit (0,75 um) under anvendelse af en mikrotom.
- Farv optiske nerve tværsnit med 1% toluidinblåt.
- Kvantificere RGC axoner i fem ikke-overlappende områder af hver synsnerven sektion som beskrevet 19.
Representative Results
Injektionen af magnetiske mikroperler i forkammeret af voksne mus som beskrevet i denne protokol resulterede i en robust og reproducerbar forøgelse af IOP. En uge efter indgrebet, IOP steg fra 10 ± 0,6 mm Hg (gennemsnit ± SEM), den gennemsnitlige baseline IOP i kontralaterale øjne, til 19 ± 0,5 mm Hg hos hypertensive øjne (Students t-test; *** p <0,001, n = 12, tabel 1, figur 2). IOP stabiliseret derefter og forblev forhøjet på et gennemsnit på 20 mm Hg i mindst 6 uger, den længste tid-point undersøgt i dette studie. Den gennemsnitlige maksimale IOP i mikroperle-injicerede øjne på 2, 3, og 6 uger efter operationen var 25 mm Hg. Langt størstedelen af behandlede mus udviklede vedvarende høj IOP, hvorfor denne protokol kræver ikke en anden injektion af mikroperler.
For at vurdere tidsforløbet for RGC tab i denne model, RGC soma varførst kvantificeres ved immunfarvning med Brn3a, en RGC-markør 17. Antallet af Brn3a-positive celler blev kvantificeret på flade monterede nethinder ved 1, 2, 3 og 6 uger efter induktion af okulær hypertension. Selv om en betydelig IOP elevation blev opdaget så tidligt som 1 uge efter mikroperle injektion, blev ingen signifikant tab af RGC soma observeret inden for de første 2 uger af proceduren (figur 3). Betydelig RGC død (22%), var imidlertid tydelig ved 3 uger (2.430 ± 67 RGC'er / mm2, middelværdi ± SEM, n = 12) og 6 uger (2.350 ± 74 RGC'er / mm2, n = 10) post- induktion af okulær hypertension, sammenlignet med intakte kontrol- øjne fra un-opererede mus (3.141 ± 49 RGC'er / mm2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).
Dysfunktion og degeneration af RGC axoner er en kardinal funktion af glaukom. Derfor blev axonal tab undersøgt ved 3 og 6 uger efter mikroperle injektion afkvantificering af RGC axoner i synsnerveceller tværsnit farvet med toluidinblåt (figur 4). En væsentligt tab af RGC axoner (25%) blev observeret efter 3 uger (28,401 ± 702 axoner / nerve, middelværdi ± SEM, n = 5) og 6 uger (29,426 ± 948 axoner / nerve, n = 6) efter injektion af mikroperler sammenlignet med intakte synsnerver fra un-opererede øjne (39,467 ± 137 axoner / nerve, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Tilsammen viser disse data, at injektion af magnetiske mikroperler i musen forkammeret fører til reproducerbar og vedvarende IOP elevation, der resulterer i RGC soma og Axon degeneration.
| Time efter OHT kirurgi | N | Mean IOP (mmHg) ± SEM | Peak IOP (mmHg) | ||||
| kontralateral | Glaukom | Difference | kontralateral | Glaukom | |||
| En uge | 12 | 10 ± 0,4 | 19 ± 0,5 | 9 ± 0,6 | 12 ± 0,4 | 22 ± 0,6 | |
| 2 uger | 13 | 11 ± 0,5 | 20 ± 0,8 | 9 ± 0,5 | 12 ± 0,9 | 25 ± 0,7 | |
| 3 uger | 10 | 11 ± 0,8 | 20 ± 0,7 | 10 ± 0,9 | 13 ± 0,2 | 25 ± 0,9 | |
| 6 uger | 12 | 12 ± 0,5 | 20 ± 0,6 | 9 ± 0,7 | 13 ± 0,5 | 24 ± 0,6 | |
Tabel 1. Elevation af det intraokulære tryk i murine Magnetic mikroperler Occlusipå Model. I vågen kvindelige C57 BL / 6 mus, IOP blev målt ved hjælp af en kalibreret rebound tonometer. Betjente øjne viste en stigning i IOP detekteret på én uge efter kirurgi, der forblev forhøjet i mindst seks uger efter indgrebet.
Figur 1. Arbejdsgang for trin i murine Magnetic mikroperle Okklusion Model of glaukom. Trin-for-trin oversigt over alle de procedurer, der udføres før, under og efter operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Stigning i intraokulært tryk i murine Magnetic microbead Okklusion Model. I vågenkvindelige C57 BL / 6-mus, IOP blev målt ved anvendelse af en kalibreret rebound tonometer. De IOPs af mikroperle-injicerede øjne var signifikant forhøjet ved én uge efter kirurgi (ANOVA, p <0,001). De IOPs forblev signifikant forhøjet i forhold til den kontralaterale øje injicerede mus i mindst 6 uger (ANOVA, p <0,001). (Intakt: n = 12; 1 uge: n = 12, 2 uger: n = 13, 3 uger: n = 10, 6 uger: n = 12). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Retinal Ganglion celledød i de murine Magnetiske microbead Okklusion Model. RGC'er blev visualiseret ved immunfarvning af flade monteret nethinder hjælp Brn3a i intakte kontrol nethinder (A) og glaucomatøse nethinder ved 3 og 6 uger efter mikroperle injektion for at inducereokulær hypertension (OHT) (B, C). Scale bars: 20 uM. (D) Kvantitativ analyse bekræftede, at mikroperle injektion resulterede i betydelige RGC soma tab ved 3 og 6 uger efter indgrebet sammenlignet med kontrol øjnene. Tætheden af RGC soma i intakt, ikke-glaukomatøs C57 / BL6-mus er vist som reference (hvide søjler, 100% overlevelse). Værdier er udtrykt som middelværdien ± SEM (Intakt: n = 23; 1 uge: n = 6, 2 uger: n = 6, 3 uger: n = 12, 6 uger: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. axonal degeneration i Murine Magnetic mikroperle Okklusion Model. RGC axoner blev visualiseret ved farvning af synsnerven tværsnit med toluidinblåt iintakt kontrol (A) og glaucomatøse nethinder ved 3 og 6 uger efter mikroperle injektion for at inducere okulær hypertension (OHT) (B, C). Scale bars: 10 um. (D) Kvantitativ analyse bekræftede, at mikroperle injektion resulterede i betydelige RGC axon tab ved 3 og 6 uger efter indgrebet sammenlignet med kontrol øjnene. Tætheden af RGC axoner i intakt, ikke-glaukomatøs C57 / BL6-mus er vist som reference (hvide søjler, 100% overlevelse). Værdierne er udtrykt som gennemsnit ± SEM (Intakt: n = 4; 3 uger: n = 5, 6 uger: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal .
Discussion
Videoen teknik præsenteres her indeholder detaljerede trin for trin instruktioner om, hvordan man udfører intrakameral injektion af magnetiske mikrokugler til effektivt og reproducerbart fremkalde IOP elevation i mus. Denne procedure resulterer i vedvarende IOP stigning, der ikke kræver yderligere injektioner og fremmer påviselig RGC soma og Axon tab inden for de første 3 uger af okulær hypertension induction.Elevated IOP er en stor risikofaktor for at udvikle grøn stær hos mennesker. Derfor er dette en værdifuld murint okulær hypertension-afhængig glaukom model, der har potentiale til en lang række applikationer.
En fælles ulempe forbundet med injektionen af mikroperler i forkammeret angår bead tilbagesvaling gennem injektionsstedet når nålen trækkes tilbage, hvilket ofte resulterer i kun delvis obstruktion af vandig udstrømning og øget variabilitet. For at løse dette problem, blev der flere vigtige ændringer gennemføres. Firs t, omhyggelig fremstilling af en ren, skarp glas mikronål med en facetteret affasning er afgørende for en vellykket injektion af mikroperlerne. En korrekt fremstillet mikronål muliggør kontrollerede og god penetration af hornhinden med minimal påføring af tryk på den følsomme øjenoverfladen. Den lille corneal punktering forhindrer tilbagestrømning af mikroperler. Hertil kommer, at fine mikronål reducerer risikoen for skadelige nærliggende strukturer såsom iris og linsen, hvilket kan resultere i ikke-sygdom relateret inflammation. For det andet er anvendelsen af en håndholdt magnet til strategiske okulære områder under og efter injektionen er et andet kritisk aspekt af denne teknik. Under injektionen, er magneten bruges til at trække de magnetiske mikroperler til det forreste kammer forhindrer tilbageløb af mikroperlerne når mikrokanylen trækkes tilbage. Efter injektionen, er magneten derefter anvendes til at dirigere mikroperlerne til iridokorneal vinkel at blokere vandig humor outflow.
telt "> Et andet problem ofte stødt på mikroperle okklusion modeller er, at gentagne perle indsprøjtninger er ofte nødvendigt at opnå vedvarende IOP elevation 10,11. Dette kan være resultatet af mikroperler omplacere fra iridokorneal vinkel med tiden. Kombinationen af en håndholdt magnet, som beskrevet ovenfor, og placeringen af muse postoperativt i høj grad forbedrer resultatet. anvendelsen af injicerbare anæstetika, som tillader fleksibilitet til at bevæge hovedet under proceduren og kræve en længere postoperative rekonvalescensperiode, begunstiges. placering af mus med det opererede øje opad for et par timer efter operationen bidrager til løsning af mikroperler på iridokorneal vinkel og nedsætter risikoen for at løsne tilbage i forkammeret.Sikring af, at antallet af injicerede perler er relativt konsistent er endnu et kritisk trin for at minimere inter-dyr variationer. Da mikroperlerne bosætte på bottom af røret, er det nødvendigt fuldt ud homogenisere mikroperle opløsningen og trække det passende volumen ind i mikrokanylen i tide. Injektion af færre perler ind i det forreste kammer kan resultere i ufuldstændig blokering af vandige humor dræning strukturer, hvilket sandsynligvis vil resultere i dårlig eller variabel IOP elevation. Notatet selvom det endelige formål med mikroperlen injektion er at ophøje IOP, bør der udvises forsigtighed, når IOP målinger fra vågen mus er højere end de spidsværdier rapporteret i denne undersøgelse (~ 25 mmHg). Ekstremt høje IOPs øge risikoen for iskæmisk skade og kan også forårsage smerte for dyret. Højden af IOP bør betragtes som en af mange faktorer at vurdere succes operationen. Som sådan bør resultatet af proceduren måles baseret på flere parametre, herunder IOP elevation, RGC soma død, og Axon tab.
Selv om den her beskrevne protokol resulterer i de fleste mikroperler succesfuldely afregning ved den vinkel, en potentiel begrænsning af denne model er, at disse perler, der forbliver flydende i forkammeret kan interferere med levende retinal imaging gennem hornhinden, såvel som elektrofysiologiske eller adfærdsmæssige assays, der kræver effektiv passage af lys. Et andet vigtigt aspekt at overveje, når man bruger denne mikroperle okklusion model er, at omfanget af IOP elevation og efterfølgende RGC degeneration varierer med alder og genetiske baggrund af den opererede mus [4]. Derfor vil omfanget af IOP elevation og tidslinjen af RGC degeneration skal bestemmes for hver specifik transgene mus linje og / eller aldersgruppe.
Et træk ved denne model er, at forhøjet IOP resulterer i gradvise tab af RGC død i de første tre uger efter mikroperle injektion, og betydelig RGC død opdages ved 3 uger efter indgrebet. Derfor har dette model muliggør undersøgelse af tidlige og / eller subtile forandringer, der sker i denne disease, før åbenlys RGC soma og Axon tab. En betydelig stigning i RGC død blev ikke observeret mellem 3 og 6 uger efter induktion af okulær hypertension. Faktisk RGC soma og Axon tab stabilt på ~ 22-25% mellem 3 og 6 uger på trods af succes og vedvarende IOP elevation på disse tidspunkter. Der kan kræves en længere varighed af vedvarende IOP for yderligere RGC tab at forekomme i C57BL / 6 mus, som synes at være mere modstandsdygtige over for RGC skade i forhold til andre musestammer. 5 Supplerende ændringer til protokollen præsenteres her, herunder justering af perle størrelse og yderligere injektioner, kan være påkrævet for at studere RGC tab på senere tidspunkter. Derfor er vores protokol er ideel til undersøgelser fokuserede på tidlige patofysiologiske forandringer, der korrelerer med beskedne RGC neurodegeneration som er relevante for debut og tidlig progression i menneskelig glaukom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
