Introduction
「セントロメア」は、古典的遺伝学の抑制減数分裂期組換えの領域として定義され、それ以降の有糸分裂の間に正確な染色体の分離において重要な役割を果たしている有糸分裂染色体の一次狭窄、として認識されました。 「動原体」は、電子顕微鏡によって明らかにされるように、動原体の表面に微小管に結合した多層構造として説明しました。 「動原体」は、後に、有糸分裂の染色体のセントロメアに局在高分子複合体として定義されていました。脊椎動物の中で動原体DNA配列の劇的な相違にもかかわらず、動原体の構造および組成は、高度に保存されています。スピンドル微小管と動原体の間の動的相互作用は、忠実な有糸分裂時の染色体の分離、および異数性およびそれによって癌にセントロメア動原体機能のリードの欠陥のために必要とされます。
ほとんどの真核生物におけるセントロメア何も定義されたDNA配列を持っていませんが、171-bpのαサテライトDNAからなる反復アルフォイドDNAの大規模な配列（0.3-5 MB）で構成されています。出芽酵母を除いて、セントロメアのアイデンティティはないDNA配列ではなく、ヒストンH3バリアントCenH3（ヒトにおけるセントロメアプロテインA [CENP-A]）を含む特別なヌクレオソームの存在によって達成される。5 CENP-Aヌクレオソームがに局在します171-bpのαサテライトDNAに対する哺乳動物動原体7と結合するのインナープレート。アクティブ動原体は、一緒に紡錘体チェックポイントを介して紡錘体とそれに続く周期の進行に染色体の付着を調節する構成的セントロメア関連するネットワーク（CCAN）の動員および動原体タンパク質を、指示するためにCENP-Aを含むヌクレオソームが必要です。
上記の証拠に照らして、CENP-Aはセントロメア8のエピジェネティックなマークであることが提案されています。しかしながら、CENP-Aが組み込まれたプロセスは、私NtoのセントロメアDNAと、この取り込みを担当する要因はまだ十分に特徴付けられていません。ショートセントロメア標的化ドメイン（CATD）は、CENP-Aの領域に折り畳むヒストンに常駐し、CATDとH3の対応する領域の交換が動原体への直接H3に十分なものである。9いくつかの研究は、翻訳後のための機能的役割を示唆しましたCENP-12-16の変更（PTM）。しかし、動原体への動員においてCENP-AのこれらのPTMの分子メカニズムはまだ解明されていません。我々は以前CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性が動原体にCENP-AのCENP-A K124のユビキチン化およびローカライズのために必要とされていることを報告した。17
動原体タンパク質の発見および特徴付けは、染色体分離に関する新たな知見をもたらしている。18 100以上の動原体の構成要素は様々なアプローチによって、脊椎動物細胞で同定されている。19,20の下で動原体が集合し、機能はまた、細胞内の各セントロメア-動原体タンパク質の細胞機能の特性評価およびタンパク質間ネットワークから来ている。19直接可視化し、蛍光顕微鏡での高度な画像処理方法が動原体動原体の構成要素の著しい分解能を提供し、許可する方法のスタンディングセントロメアと動原体の特定の分子成分の直接観察。また、特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）染色は、これらの観測に不可欠です。しかし、IIFプロトコルに関する多くの報告にもかかわらず、特定のセントロメア-動原体タンパク質の詳細な問題に議論少数。1-4はこのように、開発と特異的に各セントロメア動原体タンパク質を分析するIIF染色および定量IIFアッセイの方法を報告することは非常に重要です。 IIF染色では、一つの目的のタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきですかセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし、21および固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。したがって、異なる固定液法が動原体動原体タンパク質のIIF染色で重要です。
間接免疫蛍光（IIF）染色およびCENP-AおよびFLAGタグ外因性のCENP-A蛋白質、およびヒト細胞におけるこれらのタンパク質の定量を含む内因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化に対処するためのアッセイのここで最適化された方法が開発されています。これらの方法は、他の種におけるセントロメア、動原体タンパク質の分析に適用することができます。
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Protocol
1.細胞培養およびトランスフェクション
- 6ウェルのポリスチレンプレートにカバーガラス（22ミリメートル×22 mm）を入れてください。以下の手順でカバーガラス上の有糸分裂細胞を維持するための水に任意でコートポリ-L-リジンとカバーガラス、w / vの0.1％、（マテリアル/機器のリストを参照してください）：
注：最適な条件は、各細胞株および適用のために決定されなければなりません。- ポリ-L-リジンで無菌的にコート培養表面は、0.1％のV、水中で（0.6ミリリットル/ウェルを6ウェルポリスチレンプレート）/ wです。培養表面の均一なコーティングを確実にするために、穏やかに揺らし。
- 5分後、吸引により液を除去し、完全に無菌の組織培養グレードの水で表面をすすぎます。
- 細胞および培地を導入する前に少なくとも2時間を乾燥させます。
- 6ウェルのポリスチレンプレートに入れ、シードHeLa細胞17またはHeLa細胞のTet-オフカバーガラス上の細胞17,22（X 22ミリメートル22ミリメートル）。その細胞密度はウェル当たり5.4×10 5であることを確認してください。培養細胞10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを有する高グルコースDMEMです。
注：最適な結果を得るためには、経験的に播種に使用するための細胞密度を決定します。 - 18時間、5％CO 2の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
テトラサイクリン/ドキシサイクリンなしのHeLa Tetをオフ細胞の場合には、外来遺伝子の転写が誘導物質（ すなわち 、テトラサイクリン/ドキシサイクリン）の非存在下で活性である、したがって培養細胞とpTRM4過剰発現ベクターで一過性にトランスフェクト（ 表2：注意）、その転写がTREプロモーターによって調節される（下記参照）。 - 以下のように、トランスフェクト細胞を播種後18時間：
- （20μMアニール株式を、 表1）1.5μlのsiRNAオリゴを混合して溶液Aを作成し、および/ または2.0μgのプラスミド（ 表2）50μlの低血清培地中で（材料/機器のリストを参照してください）、そして室温で5分間インキュベート。
注：この分析では、CA-UTRのsiRNA（5の混合物'および3' UTRのsiRNA; 表1）は、プロトコル3および4で使用するために同時トランスフェクトした（説明を参照）。 - 私は血清培地を減少50μl中（マテリアル/機器のリストを参照してください）、そして室温で5分間インキュベート0.75μlのトランスフェクション試薬を混合して溶液Bを作成します。
注：オプションのステップは、（材料/機器のリストを参照してください）1.0μlのトランスフェクション試薬IIを添加することです。 - 一緒に溶液A及びBを混合し、室温で15分間インキュベートします。
- PBSで一度培養した細胞を洗浄し、その後、6ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに500μlの減少血清培地を追加します。個々のウェルのそれぞれに溶液AおよびB（ すなわち 、RNAおよび/ またはDNA -脂質複合体）を直接の混合物を追加します。
注：最終濃度は3.3μgの/ mlの（プラスミド）です。 50 nMの（のsiRNA）。 - 4.5時間、5％CO 2の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。高グルコースDMEMのウィットに培地を変更H、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン。
- トランスフェクション後48〜72時間、5％CO 2の雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
注：最適な結果を得るために、固定前に細胞成長のためのインキュベーション期間は、経験的に決定されなければならず、タンパク質の枯渇および/または発現は、ウェスタンブロット分析によって確認されなければならない（プロトコル6を参照）。 - 有糸分裂細胞分析に関心がある場合は、24時間固定する前に、培養細胞にパクリタキセル（10 nM）を追加し、または固定する前に、培養細胞を2.5時間にTN16（0.5μM）を追加します。
- （20μMアニール株式を、 表1）1.5μlのsiRNAオリゴを混合して溶液Aを作成し、および/ または2.0μgのプラスミド（ 表2）50μlの低血清培地中で（材料/機器のリストを参照してください）、そして室温で5分間インキュベート。
内因性セントロメア-動原体タンパク質を検出する2.細胞の固定と免疫染色（パラホルムアルデヒド固定）
- 固定剤、緩衝液、および試薬の調製。
- 新たにPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒド溶液50mlを調製します。
- 換気フード内で撹拌プレート上ガラスビーカーに1×PBSの40ミリリットルを追加します。ヒートながらstirrin約60°Cにグラム。加熱されたPBSにパラホルムアルデヒド粉末2gを追加します。
- 粉末はすぐに溶解しないので、合計で1 NのNaOHを1ml添加することにより徐々にpHを上昇させます。
注：解決策は、NaOHを添加した後にクリアされます。 - パラホルムアルデヒドは、クールで溶解し、溶液を濾過したら。
- pHが7.4から1 N HClでpH及び50ミリリットルの1×PBSでの溶液の量を調整します。
注：液のアリコートを凍結させるか、または限り1として週2〜8℃で保存することができます。それが使用されるまで溶液を氷冷または4℃で保存すべきです。
- 10mMトリス - 塩酸、pHを7.5から成るバッファKB1、50mlのを準備します。 150mMのNaCl; 0.5％BSA。 0.5％トリトンX-100。
注：BSAを新たに追加する必要があります。
注：バッファKBシリーズは、以前の報告に記載されバッファKBに基づいています1,2,4。 - 、10 mMトリス - 塩酸から成るバッファKB2、50mlのを準備pHが7.5; 150mMのNaCl;及び0.5％BSA。
注：BSAを新たに追加する必要があります。 - DAPI（50 ngの/ ml）を含むバッファKB3の1ミリリットルを準備します。
- 1mg / mlのp-フェニレンジアミンで構成さ封入剤の100ミリリットルを用意。 10％PBS、90％グリセロール。
- 、1 N NaOHで9.8から1×PBSのpHを調整して溶液中でパラフェニレンジアミンを溶解させ、その後、グリセロールを追加します。
- -80℃で保存1mlアリコートを。光から保護します。
- 新たにPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒド溶液50mlを調製します。
- 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 PBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にPBSを適用します。
注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。 - 4℃で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。十分に残留し、4％パラホルムアルデヒドを除去するために、バッファKB2で細胞を2回洗浄します。
- PermeabiRTで30分間緩衝KB1でサンプルを平安大町。バッファKB2で細胞を1回すすぎ、そして非特異的結合の追加のブロックサイトにRTで5分間のバッファKB2を追加します。
注：Buffer KB1も阻止に大きく貢献しています。 - ピンセットを用いて、6ウェルのポリスチレンプレートからカバーガラス（22ミリメートル×22 mm）を削除します。疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料周辺の疎水性バリアを形成するために、淡い緑色の正方形または円を描く、（マテリアル/機器のリストを参照してください）。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。新しい6ウェルポリスチレンプレートにカバーガラスを置きます。
- 一次セントロメアする抗体または動原体タンパク質を希釈（1の希釈率：1から100：200;また、マテリアル/機器のリストを参照）、抗CENP-B抗体（1の希釈率：400）のいずれかまたは抗セントロメア抗体（ACA）（1の希釈率：2000）は、バッファKB2におけるセントロメアの位置マーカーとして。
注：最適な結果を得るために、最終的なconcentraこの溶液中の一次抗体の化は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。バッファKB2で細胞を3回洗浄します。
- 各一次抗体に対する指定バッファーのKB2をUsing、フルオロフォア結合二次抗体（200：100 1から1の希釈率）を希釈します。
注：最適な結果を得るために、この溶液中の二次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（カバーガラス上で約 30μlと低下）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分（5、6分の洗浄）の期間中にバッファKB2で細胞を5回洗浄します。
注：最適な結果を得るために（ すなわち 、細胞の損失を最小限にするために）、最適な洗浄条件は、empiricaを決定しなければなりませんLLY。 - 細胞試料を浸漬するDAPI（50 ngの/ ml）を含むバッファKB3の十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。バッファKB2で細胞を1-2回すすいでください。
- マイクロスライド上に細胞試料が含まれているカバーガラスをマウントします。
- マイクロスライドの中央に取り付け培地のドロップを置きます。
- 細胞試料から液体を除去し、手やピンセットを用いて、マイクロスライドの中央にサンプルを置きます。気泡を避けてください。
- ペーパータオルで余分なマウンティング培地を除去します。
3.細胞固定およびC末端FlagタグCENP-A蛋白質（アセトン固定）の免疫染色
- 準備
- 氷冷75％アセトンを準備します。
- 新たに0.5％スキムミルクおよび0.5％BSAを含むPBS（pH7.4）で50mlのを準備します。
- 新たに0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含むPBS（pH7.4）で50mlのを準備します。
- （1mlのPBSを準備DAPI（50-100 ngの/ ml）を含むpH7.4の）。
- 2.1.5で説明したようにマウンティング培地の100ミリリットルを準備します。
- 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 PBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にPBSを適用します。
注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。 - 氷冷75％アセトン中で細胞を固定し、-20℃で10分間細胞をインキュベートします。 RTで30〜60分間ヒュームフードでカバーガラス上の乾電池。
注：最適な結果を得るために、固定および細胞乾燥に必要な時間の長さは、経験的に決定されなければなりません。 - 疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料周辺の疎水性バリアを形成するために、淡い緑色の正方形または円を描く、（マテリアル/機器のリストを参照してください）。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。
- ブロックnonspecIFIC 0.5％スキムミルク、室温で5分間、0.5％BSAを含むPBSを添加することによって、細胞上の結合部位。
- （1,000希釈率1）および抗CENP-B抗体（1の希釈率：200）のいずれか、またはACA（1：2,000希釈率PBS 0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有する使用、抗Flag抗体を希釈）セントロメア位置マーカーとして。
注：最適な結果を得るために、この溶液中の一次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分の期間中にブロッキングバッファーで細胞を5回洗浄します。
注：細胞をPBSでリンスすることができます。最適な結果（ すなわち 、細胞の損失を避けるために）のために、最適な洗浄条件は、経験的に決定されなければなりません。 - 向けフルオロフォア結合二次抗体（200：100 1：1の希釈比）希薄0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有するPBS中の各一次抗体。
注：最適な結果を得るために、この溶液中の二次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 PBS、0.1％スキムミルクおよび0.1％BSAを含有する細胞を2回リンス。
注：PBS単独はまた、細胞を洗浄するために使用することができます。 - 細胞試料を浸漬するDAPI（50-100 ngの/ ml）を含むPBSの十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。 PBSで細胞を1-2回すすいでください。
- 2.11に記載されているように、マイクロスライド上に細胞試料を含むカバーガラスをマウントします。
4.細胞の固定およびN末端FlagタグCENP-A蛋白質の免疫染色（メタノール固定）
- 準備
- 氷冷メタノールを準備します。
- 4％ヤギ血清を含むTBS（pH7.4）に準備します。
- TBS DAPI（50-100 ngの/ ml）を含む液（pH7.4）の1ミリリットルを準備します。
- 2.1.5で説明したようにマウンティング培地の100ミリリットルを準備します。
- 細胞固定用の48〜72時間後、トランスフェクション（プロトコル1を参照）で吸引により培地を除去します。 TBSで細胞を1回すすいでください。細胞の表面を乱すことを避けるために培養ウェルの側にTBSを適用します。
注：細胞固定のための最適な時点は経験的に決定されなければなりません。 - 氷冷メタノールで細胞を固定し、-20℃で6分間、細胞をインキュベートします。十分に残留メタノールを除去するために、TBSで細胞を2回洗浄します。
- （マテリアル/機器のリストを参照してください）疎水性バリアペンを使用して、各カバーガラス試料の周りに疎水性の障壁を作成するために、淡い緑色の正方形または円を描きます。触れたり、疎水性バリアペンで細胞に近づきすぎないようにしてください。
- セル上の非特異的結合部位をブロック4％ヤギ血清を含むTBSを添加することにより、LS。室温で10分間インキュベートします。
- （1,000倍希釈）、および抗CENP-B抗体（希釈比1：200）のいずれか：4％ヤギ血清を含むTBS中で動原体位置マーカーとして（2,000希釈率1）またはACA抗Flag抗体を希釈。
注：最適な結果を得るために、この溶液中の一次抗体の最終濃度は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した一次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。 30分の期間中にブロッキングバッファーで細胞を5回洗浄します。最適な結果（ すなわち 、細胞の最小限の損失）については、最適な洗浄条件は、経験的に決定されなければなりません。
- 4％ヤギ血清を含むTBS中で、各一次抗体に対するフルオロフォア結合二次抗体（200：100 1：1の希釈比）を希釈します。
注：最適な結果を得るために、FINAこの溶液中の二次抗体のリットル濃度は、経験的に決定されなければなりません。 - 細胞試料を浸漬する希釈した二次抗体のに十分な量（ 約 30μl）を適用します。 37℃で1時間細胞サンプルをインキュベートします。ブロッキング緩衝液で細胞を3回洗浄します。
- 細胞試料を浸漬するDAPI（50-100 ngの/ ml）を含むTBSの十分な量を適用します。室温で5分間、細胞試料をインキュベートします。 TBSで細胞を1-2回すすいでください。
- 2.11に記載されているように、マイクロスライド上に細胞試料が含まれているカバーガラスをマウントします。
5.免疫蛍光像観察、取得、定量、および分析
- 63Xおよび100X油浸レンズ、外部コンパクト光源、およびデジタルCCDカメラを搭載した電動式蛍光顕微鏡で細胞試料を観察します。
- ソフトウェアを使用して、デコンボリューションを含む画像取得処理を行います、またはソフトB1とB2（マテリアル/機器のリストを参照してください）。ソフトB1とB2で使用されるすべてのコマンドについては、ソフトウェアAで使用されるすべてのコマンドのために補足コードファイル（5.2.1）を参照してください、補足Codeファイルに（5.2.2）を参照してください。
- 以下の軽微な変更でセントロメア動原体タンパク質（セントロメアでのCENP-Aの例えば 、残りの信号）の信号を定量化するために前述の方法23-25 を使用します。
- 次のようにセントロメア-動原体タンパク質の領域を選択し、背景のこと：
- 有糸分裂細胞：DAPIで染色した染色体と重なる（セントロメア動原体領域）を選択エリア。 （背景領域）と面積染色体外が同一で、単一細胞（ すなわち 、細胞質ゾル領域）の内側。
- 間期細胞：DAPIで染色したクロマチンと重なる（セントロメア動原体領域）を選択エリア。 （クロマチンの外側が、同一の単一細胞内で（バックグラウンド領域）と面積<em>のすなわち、細胞質ゾル領域）。
注：それぞれ、ソフトウェアAまたはソフトウェアB2と領域選択のためにも補足コードファイル（5.2.1.4.3）または（5.2.2.6.4）を参照してください。
- このタスクのソフトウェアAまたはBを使用することにより、動原体に残りの信号の割合を定量化するには、次の式を使用します。
セントロメア動原体でのセントロメア動原体タンパク質の残りの信号
bはバックグラウンドシグナル輝度であり; sは ACAまたはCENP-B染色によって確認される選択された領域の信号の明るさである場合、R サンプルは、siRNA（S）処理細胞に対する基準ACAまたはCENP-Bの信号です。 そしてR CTRLはリュックsiRNAをトランスフェクトされた細胞のための基準ACAまたはCENP-Bの信号です。
注：以前の報告に記載されているように、この分析では、CENP-B信号は、CUL4Aための基準信号として使用し、RBX1ました。- コピーした後、この計算のためのExcelファイルを使用し、上記の信号の定量ソフトウェアからの生データを貼り付けます。詳細については、（5.2.1.4）及び（5.2.2.6）：補足コードファイルをも参照してください。計算の一例は、 表3に示されています。
- 次のようにセントロメア-動原体タンパク質の領域を選択し、背景のこと：
- 各測定レベルのための染色および画像取得の変動を排除するために、少なくとも20の細胞を分析します。各セルを分析するために必要に応じて異なるセントロメア動原体タンパク質の間でこれらの値を比較するために、セントロメア-動原体信号を残りの「平均値」を使用します。
総タンパクの6.ウェスタンブロット分析
- 緩衝変性に細胞を再懸濁（20mMのトリス-HCl、pH7.4の、50mMのNaCl、0.5％ノニデットP-40; 0.5％デオキシコレート、0.5％SDS、1mMのEDTA、および完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル） 26件名超音波処理および凍結融解プロセス、および測定するためにサスペンションタンパク質濃度を次のように
- 超音波処理プロセスでは、48〜72時間後、トランスフェクションの6ウェルのポリスチレンプレートの2つのウェルから回収した細胞に緩衝液Aの50μlを添加する（プロトコル1を参照）。ディスラプターホーンとマイクロチップを搭載した超音波処理装置を操作して1サンプルあたり合計15秒間欠パルス持続時間（デューティサイクル50％）のために（材料/機器のリストを参照してください）。
- 凍結融解プロセスのために、液体窒素で細胞を凍結し、RTで細胞を解凍します。
- （マテリアル/機器のリストを参照してください）市販のタンパク質アッセイ試薬IまたはIIを使用してタンパク質濃度を測定します。
注：溶解液は、試薬IまたはIIのいずれかでタンパク質濃度の測定で1:10の割合で希釈します。この希釈で、緩衝液A中にSDSが存在するが、この測定ではほとんどまたは全く干渉を示しています。
- 2×または4×SDS-PAGEローディングバッファーで総タンパク質の20〜30μgのを含む溶解液を混ぜる。27ボイルのサンプルについて5分間、その後電気泳動用SDSポリアクリルアミドゲルを変性12.0パーセント-15.0％でそれらをロードします。
- 先に述べたウエスタンブロッティング法を用いてPVDF膜にSDS-PAGEによって分離されたタンパク質を転送します。17,24,27-31
- 1×PBS中の5％無脂肪乳で膜上の非特異的結合部位をブロックし、その後、室温で1時間希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートします。各一次抗体の詳細な情報（ 例えば、希釈率）のための材料/機器の一覧を参照してください。
- PBS-T緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20）で（振盪しながら各3〜5分間のインキュベーション）膜を3〜4回洗浄した後、近赤外（IR）の混合物中で膜をインキュベート蛍光色素結合二次抗体（1の希釈率：20,000）、DyLightコンジュゲート二次抗体（1の希釈率：20,000）、及び/又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）をPBS-Tで希釈した二次抗体（抱合; dilutiを1の比率で：10,000）を室温で1時間。各二次抗体の詳細な情報（ 例えば、希釈率）のための材料/機器の一覧を参照してください。
- 膜を3回洗浄してから、赤外線イメージングシステムおよび/または免疫ブロット検出のための化学発光イメージャを有するタンパク質を分析するために、膜をスキャン（材料/機器のリストを参照してください）。
- 赤外線イメージングシステムを使用するため、補足Codeファイルに（6.4.1）を参照してください。
- 化学発光イメージャーを使用するため、補足Codeファイルに（6.4.2）を参照してください。超高感度強化化学発光（ECL）基板を使用して、このシステムの（マテリアル/機器のリストを参照してください）。
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Representative Results
内因性のCENP-Aの免疫蛍光分析は、CUL4A-E3リガーゼは、セントロメアにCENP-Aの局在に必要とされるという仮説を支持します
我々の最近の研究では、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性がCENP-Aおよび動原体へのCENP-Aの局在化に対するリジン124（K124）のユビキチン化のために必要とされることを示した。17最初に、相間-動原体複合体（ICENが）によって単離しました抗CENP-A：ネイティブクロマチン免疫沈降、32-34、ICENタンパク質のいくつかはセントロメアにCENP-Aをローカライズする役割を果たしていると仮定されています。したがって、siRNAノックダウン実験は、その不在発現の動原体17にCENP-Aの非局在化を誘導したタンパク質をスクリーニングするために実施した（データは示していない）：非同期的に成長したHeLa細胞を、回カリン4A（CUL4A）siRNAまたはRBX1のsiRNAをトランスフェクトしました。最適なタンパク質の枯渇（48時間必要CUL4AためのrとRBX1 72時間）。 CUL4A siRNAでトランスフェクトした細胞はセントロメア（ 図1A-C）でCENP-Aの重要な非局在化を示しました。 図2Gに示すように、CUL4A siRNAをトランスフェクトした細胞の全細胞溶解物中のCENP-Aのタンパク質レベルは、同じ培養条件下でルシフェラーゼ（リュック）siRNAをトランスフェクトした細胞からの溶解物中のCENP-Aレベルと同様でした。 CUL4A siRNAは3 'UTR（ 図2A-C）を標的とするときCUL4Aフラッグの異所性発現は、セントロメアでCENP-Aの削減を救出するのでCUL4A siRNAのオフターゲット効果の可能性は、除外されました。全細胞溶解物中のCENP-Aのタンパク質レベルに関係なく、細胞周期の段階（ 図1B、2G）の同一の培養条件下でのLuc siRNAをトランスフェクトした細胞からの溶解物中のCENP-Aのレベルに類似していることが確認されました。このように、CUL4Aの枯渇は、CENP-A蛋白質の分解が排除された原因となっている可能性が。
35リガーゼであり、3つの主要な要素が含まれています。カリン足場、RINGフィンガータンパク質（RBX1またはRBX2）、およびRBX1またはRBX2によって補充されるユビキチン荷電E2酵素、36 A RINGフィンガータンパク質はまた、ユビキチン転送を容易にするために、E2酵素に近接して基板を配置する基板アダプターを動員36 RBX1のsiRNAは、有意な減少を誘導しRBX1のsiRNAをトランスフェクト細胞の全細胞溶解物中のCENP-Aのタンパク質レベルは、リュックのsiRNAトランスフェクト細胞からの溶解物中のCENP-Aレベルと同様であったする条件下でセントロメア（ 図1D-F）でのCENP-A（ 図2G）。 RBX1の枯渇によって、または同じ培養条件下でCUL4Aの組み合わせとRBX1枯渇のいずれかによってCENP-A蛋白質の分解は（ 図2G）は観察されませんでした。オフターゲット効果の可能性RBX1 siRNAは3 'UTR（ 図2D-F）を標的とするときフラッグRBX1の異所性発現は、セントロメアでCENP-Aの削減を救出するのでRBX1 siRNAのSは、除外されました。これらの知見は、CUL4A-RBX1-E3リガーゼは、具体的に動原体にCENP-Aの局在に必要であることを示唆しました。
外因性のCENP-Aの免疫蛍光分析 - 旗タンパク質は、CENP-A K124のユビキチン化は、セントロメアにCENP-Aの局在に必須であることを示しています
サイトはあるものの、以前、私たちの免疫沈降質量分析法は、CENP-A-旗のリジン124（K124）をHeLa細胞にユビキチン化されることを示した。CENP-ヌクレオソームの結晶構造では17、K124は、α3ヘリックスに存在しますCATD領域内に加えて。17、K124は哺乳類、鳥類、トカゲ、植物、および真菌の基（ 例えば 、芽の間で保存されていません鼎酵母）。17 CENP-リジン変異体（ 図3A）を構築し、セントロメアに局在化する能力を試験しました。有糸分裂と相間両方HeLa細胞中での拡散信号と外因性のCENP-K124R変異体のセントロメア局在化の実質的な廃止は、（ 図3B、C）が観察されました。セントロメア局在を大幅に（ 図3B、C）（K77がCATDでユニークなリジン部位である）どちらもK9A変異（K9はH3 K9メチル化ヒストンに相当）も、K77R変異によって影響されませんでした。
これらの結果に基づいて、二つの仮説はK124でCENP-ユビキチン化のin vivoでの機能に関する提案されています。まず、K124のユビキチン化の役割は、ユークロマチンに過剰発現され、および/またはmislocalized CENP-Aを除去するためにユビキチンを介したタンパク質分解のためです。第二に、K124上のCENP-ユビキチン化の役割は、動原体にCENP-Aをロードするためです。 FをテストするにはIRST可能性は、CENP-A-旗野生型およびシクロヘキシミド（CHX）の後K124R変異体と同様に、内因性のCENP-A治療CUL4A-のかRBX1枯渇細胞の安定性に対処しました。これらのデータは、K124のユビキチン化は、おそらく（データは示していない）の過剰発現および/ またはmislocalized CENP-Aを除去するために、ユビキチン媒介タンパク質分解に関与していないことが示唆された。17。さらに、それは、K124R変異は、in vivoでおよびin vitroユビキチン化アッセイの両方において 、推定monoubiquitylationとdiubiquitylationバンドを抑止することが確認された（データは示さず）。 図17は、集合的に、これらのデータは、CUL4A-RBX1複合体が「シグナル伝達」ユビキチン化に寄与することを示唆しています、これはセントロメアでCENP-局在化のために必要とされます。
外因性の旗の免疫蛍光分析 - CENP-Aタンパク質がモノユビキチン融合がロードするのに十分であることを示していますセントロメアでCENP-K124R
以上の結果に基づいて、共有結合したモノユビキチンが動原体へのCENP-ロード用の信号として働くという仮説が立てられました。この仮説を試験するために、N末端FLAGタグおよびC末端ユビキチン融合した野生型CENP-A、およびK124R変異CENP-Aは（ 図4A）を構築しました。ポリユビキチン化37-39のための主要部位を欠いているモノユビキチン変異体のUb（K48R）は、また、潜在的なポリユビキチン化からユビキチン融合CENP-A蛋白質を防ぐために使用されました。抗Flag免疫蛍光信号を捕捉することによって、これらの構築物によってコードされるタンパク質のセントロメア局在を試験しました。 CENP-A（ 図4Bおよび4C、列[6]）、両方の旗-CENP-A（WT）とフラグ-CENP-A（WT）-ub（の旗-CENP-A（K124）、実質的に排除セントロメア局在一方WT）は、それらのセントロメア局在（ 図4Bおよび4Cを維持し 、カラム[1]および[2]）。ザ旗-CENP-A（K124R）-ub（K48R）タンパク質はおそらく、このタンパク質が、実質的にセントロメアへの局在化を回復したように、CENP-Aをmonoubiquitylated模倣（ 図4C、列を比較する[5]、[6]）より効率的にCENP-Aがやったよりも（K124R）-ub（WT）（ 図4Cは 、列を比較[4] - [6]）。これらのデータは、monoubiquitylationが動原体にCENP-Aの募集のために十分であることを実証しました。
図1.内因性のCENP-Aの免疫蛍光分析は、CUL4A-E3リガーゼは（数値は新倉ら 17 から適応させた ） セントロメアにCENP-Aの局在に必要とされるという仮説をサポートしています 。 （A）CUL4A siRNAはセントロメアでCENP-Aの非局在化を誘導しました。 HeLa細胞（CUL4Aまたはルシフェラーゼ（Lucの）siRNAをトランスフェクトし、48時間インキュベートしました。表1）。スケールバーは10μmを表す。（B）（A）と同じ培養条件を用いたHeLa全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。細胞は、CUL4A siRNAまたはLucのsiRNAを（ 表1）を用いたトランスフェクション後48時間に採取しました。 GAPDHはローディングコントロールとして役立った。（C）（A）に示すセントロメアで定量内因性CENP-A信号。シグナルの正規化は、リュックsiRNAをトランスフェクトした細胞を用いて行い、平均（±SD）のパーセンテージを示します。 **** P <リュックのsiRNAをトランスフェクトした細胞（スチューデントのt検定）対0.0001。（D）RBX1のsiRNAのセントロメアからCENP-Aの非局在化を誘導しました。 HeLa細胞をRBX1またはLucのsiRNAを（S）でトランスフェクトし、72時間（ 表1）インキュベートしました。スケールバーは10ミクロンである。（E）（D）と同じ培養条件を用いたHeLa全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。細胞はRBX1 oを用いたトランスフェクション後72時間に回収しましたR LucのsiRNAを、（S）（ 表1）。 GAPDHをローディング対照として役立った。（F）（D）に示すセントロメアで内因性のCENP-A信号を定量化しました。シグナルの正規化は、リュックsiRNAをトランスフェクトした細胞を用いて行い、平均（±SD）のパーセンテージを示します。 **** P <リュックのsiRNAをトランスフェクトした細胞（スチューデントのt検定）対0.0001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1セントロメア（図は新倉ら 17 から適合させた）を図に関連し、図2の補足情報 。CUL4A siRNAは3 'UTRを標的とするとき（A）外因性CUL4Aフラッグは、CENP-Aの非局在化を救出。 HeLa細胞のTet-オフセル画lsコマンドは、siRNAとコトランスフェクション後48時間で固定した（CUL4A＃2：3 'UTRターゲットまたはリュック; 表1）を加えたプラスミド構築物（pTRM4-CUL4Aフラッグまたはベクター; 表2）。 4色の免疫染色：DAPI（青）についての染色;旗;内因性のCENP-B（赤）;内因性CENP-A（緑色）、実行されたとフラグ陽性細胞を選別したが、フラグ画像を簡単にするために省略されています。注：CUL4A＃2は、図1A-Cに示したものと同一の標的です。スケールバーは10μmを表す。（B）（A）に示すように、同一の培養条件以下のHeLa Tetをオフ全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。 GAPDHをローディング対照として使用した。（A）に示したセントロメアにおける（C）CENP-A信号は抗Flag抗体によって結合されるものを単離するために細胞を選別した後、顕微鏡により定量しました。シグナルの正規化は、リュックsiRNAを加えたベクターでトランスフェクトした細胞を用いて実施し、そして平均（±SD）のパーセンテージが示されています。RBX1 siRNAは3 'UTRを標的とするとき**** P <リュックのsiRNAプラスベクトル（左列、スチューデントのt検定）でトランスフェクトした細胞対0.0001。（D）外因性フラッグRBX1はセントロメアでCENP-Aの非局在化を救出しました。プラスプラスミド構築物（のpcDNA3-FLAG-RBX1またはベクター; 表2）;：（ 表1 3 'UTRの目標やリュックRBX1＃2）HeLa細胞をsiRNAで同時トランスフェクション後72時間で固定しました。 4色の免疫染色：DAPI（青）についての染色;旗;内因性のCENP-B（赤）;内因性CENP-A（緑色）、実行されたとフラグ陽性細胞を選別したが、フラグ画像を簡単にするために省略されています。スケールバーは10ミクロンである。（E）（D）と同じ培養条件以下のHeLa全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。 GAPDHをローディング対照として使用した。（F）（D）に示すセントロメアにおけるCENP-A信号は、によって結合されるものを単離する細胞を選別した後、顕微鏡により定量しました nは抗Flag抗体。シグナルの正規化は、リュックsiRNAを加えたベクターでトランスフェクトした細胞を用いて実施し、そして平均（±SD）のパーセンテージが示されています。 **** P <リュックのsiRNAプラスベクトル（左の列、スチューデントのt検定）でトランスフェクトした細胞対0.0001。CUL4AとRBX1の（G）枯渇は、内因性のCENP-A蛋白質のレベルに影響を及ぼしませんでした。内因性のCENP-A蛋白質のレベルは、HeLa細胞の全細胞溶解物中で測定したがCUL4A、RBX1、CUL4AプラスRBX1、またはリュックsiRNAでトランスフェクション後72時間を収穫しました。トランスフェクションの48時間後に、細胞は、有糸分裂において停止を誘導するために、未処理（ASYN）またはパクリタキセル（+税）で処理したいずれかであり、そしてそれらは24時間培養しました。 GAPDHをローディング対照として役立った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
32 / 53732fig3highres.jpg "幅=" 700 "/> 本研究で用いた表1 siRNA配列。 本研究で用いた表2プラスミドベクター。 。 表3 セントロメア（％）で、残りのCENP-A信号の計算の 一例は 、 図2FでのPro /前中期の一例が示されている：サンプルは、 図2FでRBX1＃2（3'UTR）+ Vecを（中央の列であります）と制御はリュック+ Vecと（ 図2Fで列を左）です。その結果、でCENP-Aの信号を残りセントロメア（％）=（0.255 / 2.987）×100 = 8.5％が得られた（または[5.347 / 62.725]同じ総細胞数[ すなわち 、21セル]は二つのサンプルの間に分析して100 = 8.5％X）です。 b値は、Sの値以上である場合（減算値が負の場合、すなわち 、）、補正された比の値が0.00に設定されています。
外因性のCENP-A-旗タンパク質の図3.免疫蛍光分析は、CENP-A K124のユビキチン化は、（数値は新倉らから適応させた。17）セントロメアでCENP-局在化のために必要とされていることが示された 。CENP-A-の（A）の過剰発現フラグ構築物（WTおよびKR変異体）は、HeLa細胞のTetオフ全細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって確認しました。細胞はpTRM4-CENP-A-旗WT、KR変異体、またはpTRM4ベクトル（ 表2）を用いたトランスフェクション48時間後に回収しました。 CENP-A-フラグの過剰発現を、抗Flag抗体で検出しました。 GAPDHをローディング対照として役立ちました。推定されるCENP-A-旗二量体（##）とCENP-A-フラグモノマー（＃）が示されています。注：SDS耐性CENP-Aの二量体は、以前に報告されている40,41（B）CENP-K124R変異体が動原体から拡散非局在化を示しました。 DAPI（青）、フラグ（GREEからの信号n）は、内因性CENP-B（赤、セントロメアの位置制御）が示されています。注：CUL4AまたはRBX1 siRNAでトランスフェクトした細胞中の内因性CENP-Aとは異なり、拡散信号は、その発現レベルは約10であるためと思われる、セントロメアを標的とすることができないことの表現型として外因性のCENP-K124R-旗を過剰発現する細胞に登場- （データは示していない）、内因性CENP-Aのそれよりも25倍、17スケールバーは10μmで表す（B）に示す局在パターン（C）ヒストグラム。 50以上のプロ/前中期および中期細胞や実験あたり200以上の間期細胞は、（N≥3の実験）を計数しました。平均（±SD）のパーセンテージを示します。 「その他（非セントロメア）は「おそらくトランスフェクション、または他の治療のほとんどが損傷を受けた細胞、死細胞、または（のみ間期における）核小体局在を持つ細胞を、示しています。 *** P <CENP-A WT-フラグ（スチューデントのt検定）対0.001。 
外因性の旗-CENP-A蛋白質の図4.免疫蛍光分析は、CENP-動 原体からCENP-K124R変異体のモノユビキチン融合救出非局在化は、（数値は新倉ら 17 から適応させた ） ことを示しました 。 （A）本研究で用いた各構築物の概略漫画（ 表2参照 ）。モノユビキチン（青）のCENP-A（赤色）にK124R変異部位およびK48R変異部位が示されています。 （1）WT：旗-CENP-WT、（2）WT-のUb（WT）：フラグ-CENP-WT-のUb（WT）、（3）WT-のUb（K48R）：フラグ-CENP-WT -ub（K48R）、（4）K124R-のUb（WT）：フラグ-CENP-K124R-のUb（WT）、（5）K124R-のUb（K48R）：フラグ-CENP-K124R-のUb（K48R）、（6）K124R：旗-CENP-K124R（B）動原体からCENP-K124R変異体の非局在化を救出外因性CENP-モノユビキチン融合。 DAPI（青）、フラグ（緑）、および内因性のCENP-B（赤、セントロメアの位置制御）が示されています。スケールバーは10μmである。（C）に示す局在パターン（C）ヒストグラムを表します。 50以上のプロ/前中期および中期細胞や実験あたり200以上の間期細胞は、（N≥3の実験）を計数しました。平均（±SD）のパーセンテージを示します。 **** P <0.0001および*** P <0.001非融合フラッグ-CENP-K124R（列[6]）（スチューデントのt検定）VS。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 siRNA標的 本研究で表示 ターゲット・タイプ siRNAのデータベース番号 フォワード配列（単数または複数） ソース/リファレンス ルシフェラーゼ（GL3） - 1ターゲット RKK9 CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT Elbashir等、（2001） CENP-A CA-UTR siRNAのプール（2のターゲット混合物） RKK375 / 5 'UTRさt1 CGAGCGGCGCGGACUUCUGCCdTdT 新倉ら 、（2015） RKK383 / 3 'UTRさt1 UCCUGCACCCAGUGUUUCUGUdGdT 新倉ら 、（2015） CUL4A ＃1 1ターゲット CRKK178 / RKK309 / T1 AGCGAUCGUAAUCAAUCCUGA 新倉ら 、（2015） ＃2（3'UTR） 1ターゲット CRKK181 / RKK331 / T4 AUGCGGGUUUGAAAUAUGACA 新倉ら 、（2015） RBX1 / ROC1 ＃1 siRNAのプール（4標的の混合物） CRKK198 / RKK411 / T1 GAAGCGCUUUGAAGUGAAA 新倉ら 、（2015） CRKK198 / RKK413 / T2 GCAUAGAAUGUCAAGCUAA 新倉ら 、（2015） CRKK198 / RKK415 / T3 GCAAGAAGCGCUUUGAAGU 新倉ら 、（2015） CRKK198 / RKK417 / T4 CAACAGAGAGUGGGAAUUC 新倉ら 、（2015） ＃2（3 'UTR） 1ターゲット CRKK206 / RKK425 / T8 UUCCCUGCUGUUACCUAAUUA 新倉ら 、（2015） Bナンバー 関連する特性（複数可） ソース/リファレンス B288 pTRM4 新倉ら 、（2006） B2067 pTRM4ヒトCENP-A-旗 新倉ら 、（2015） B2281 pTRM4ヒトCENP-A K9Aフラッグ 新倉ら 、（2015） B2387 pTRM4ヒトCENP-K77R-旗 新倉ら 、（2015） B2388 pTRM4-フーマーnはCENP-K124R-旗 新倉ら 、（2015） B2512 pTRM4フラッグヒトCENP-A 新倉ら 、（2015） B2579 pTRM4フラッグヒトCENP-K124R 新倉ら 、（2015） B2513 pTRM4フラッグヒトCENP-A-のUb（WT） 新倉ら 、（2015） B2559 pTRM4フラッグヒトCENP-K124R-のUb（WT） 新倉ら 、（2015） B2515 pTRM4フラッグヒトCENP-A-のUb（K48R） 新倉ら 、（2015） B2560 pTRM4フラッグヒトCENP-K124R-のUb（K48R） 新倉ら 、（2015） B2759 pTRM4ヒトCUL4Aフラッグ 新倉ら 、（2015） B2624 pcDNA3-FLAG-人間RBX1 新倉ら、（2015） B1491 pcDNA3-旗 新倉ら 、（2015） R（抗CENP-B）のサンプル B（抗CENP-B） R試料（減算） 比（Sサンプル：Rサンプル） 補正後の比（Sサンプル：Rサンプル） 520 514 6 -4.167 0.000 535 445 90 -1.033 0.000 515 431 84 0.274 0.274 562 483 79 0.506 0.506 902 562 340 0.509 0.509 1203 703 500 -0.560 0.000 1014 589 425 -0.819 0.000 768 510 258 -1.345 0.000 555 458 97 -1.845 0.000 781 576 205 -1.146 0.000 556 436 120 0.758 0.758 534 493 41 -1.634 0.000 702 543 159 0.667 0.667 482 429 53 -1.000 0.000 654 531 123 0.740 0.740 1190 607 583 0.384 0.384 552 454 98 0.969 0.969 489 413 76 0.539 0.539 511 452 59 -3.186 0.000 485 475 10 -2.700 0.000 481 441 40 -1.475 0.000 和 5.347 平均 0.255 R（抗CENP-B）CTRL B（抗CENP-B） 比（SのCTRL：R CTRL） 補正後の比（SのCTRL：R CTRL） 543 483 60 3.017 3.017 526 466 60 2.667 2.667 532 460 72 1.792 1.792 507 457 50 3.520 3.520 491 458 33 4.273 4.273 545 464 81 2.160 2.160 518 484 34 3.559 3.559 461 404 57 2.404 2.404 487 447 40 3.550 3.550 534 477 57 3.965 3.965 528 456 72 3.097 3.097 707 601 106 1.868 1.868 615 528 87 2.828 2.828 660 481 179 1.620 1.620 565 476 89 1.607 1.607 527 455 72 3.583 3.583 560 474 86 2.930 2.930 510 451 59 4.017 4.017 729 586 143 2.678 2.678 634 576 58 3.655 3.655 507 476 31 3.935 3.935 和 62.725 平均 2.987 セントロメアでの残りのCENP-A信号（％） 8.5
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Discussion
近年では多くの研究が固定された細胞のための異なる定量的な顕微鏡アッセイを開発した。42セントロメア動原体の生物学の進歩は、多くの場合、細胞内の空間的・時間的規制はの変更機能を反映するのタンパク質のセントロメア特異的または動原体特異的な機能を理解する必要があります細胞周期の間に、これらのタンパク質。そこで、ここではIIF染色、具体的に異なって処理されたサンプルで適用することができる内因性および外因性のCENP-A蛋白質の相対レベルを、分析するための定量的IIFアッセイの方法を開発しました。現在、我々はこの研究でプロトコル2を使用して、内因性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1、およびSka1の成功IIF染色を達成した（新倉ら 24と示されていないデータを参照してください;抗体の情報のための材料/機器のリスト） 。将来的には、1は、（異なるセントロメア動原体タンパク質のレベルを定量化するために、両方のendogを同じ方法を適用することができます特異的な抗体を選択）enousおよびFLAGタグ外因性タンパク質は、しかし、私たちのIIFの方法は、生細胞内または細胞全体のサイクル中に、特定の単一の細胞におけるこれらのタンパク質の検出をカバーしていません。これらの手順は、別個のカバーガラス上に固定し、処理対象の細胞を必要とするため、我々はかなり異なる試料間の信号を比較し、分析の精度を高めるために正規化の目的のための基準信号（ 例えば 、ACAまたはCENP-B）を導入しました。 ACAは、内因性および/または外因性のCENP-A信号を伴うため、正規化の目的のための基準信号としてCENP-Bは、ACAは、CENP-A信号の定量分析の精度の点でするよりも比較のために、より適切であろう。 CENP-Bのアミノ末端領域は、アルフォイドDNA中のCENP-Bボックス配列の17-bpのモチーフに結合し、CENP-Bのカルボキシ末端領域は、ホモ二量体を形成している。43,44 CENP-Bは完全に共局在していませんCENP-Aおよび/または他のCENTRとomere-動原体タンパク質は、しかし、密接にそれらに関連している。45抗CENP-C抗体を用いた免疫蛍光法は、典型的には、2つの別個のスポットを与える一方で、抗CENP-Bでの染色は、多くの場合、両方の姉妹動原体を接続する単一の明るいバーとして表示されます。46しかし、我々のマクロスケールの顕微鏡観察では、いくつかのCENP-B信号は、明らかに観察角度及び使用固定液の種類に応じて、また部分的に、特に以前の有糸分裂期（後期中期より前期・中期）で、CENP-A信号と重なります（データは示さず）。セントロメア-動原体タンパク質のほとんどの局在が依存するが、これとは対照的に、CENP-A信号の定量的IIFアッセイにおいて、基準信号のタンパク質の局在は、枯渇および/または公正な分析のためのCENP-Aの機能不全によって影響されるべきではありませんセントロメアでCENP-ローカライズ。47,48 CENP-A-独立した動原体アセンブリは、CENPのDNA結合領域を置換することによって確立されます異所性の遺伝子座にこれらのタンパク質を募集代替染色体ターゲティングドメインを有する-CおよびCENP-T。また49,50は 、最近の研究では、内側動原体成分CENP-Cと並列にCENP-Tの行為はにKMNネットワークを募集することが示されました動原体。51-54また、西野らは、標準的なヌクレオソームタンパク質を越えて「ヒストンコード」を拡張する、DNAとの接触を生成するために、CENP-TWSX複雑なフォームことをユニークなヌクレオソーム様構造を示唆した。55 CENP-のセントロメア局在ので、 Cは、CENP-Aのセントロメア局在に依存している47,48 CENP-TWSXまたは特にCENP-Tは、CENP-Aの定量IIFアッセイで基準信号を提供するために、別のタンパク質候補（複数可）である可能性があります。しかし、リファレンスシグナルの候補を慎重にセントロメアに局在はCENP-Aの枯渇および/または機能不全によって影響されるかどうかを決定するためのアッセイの前にテストする必要があります。類似の考慮他のセントロメア-動原体タンパク質の定量IIFアッセイのために取られるべきである：基準信号のタンパク質の局在が枯渇および/または公正な分析のための標的タンパク質の機能不全によって影響されるべきではありません。以前の研究では、他の中央外側動原体タンパク質の定量IIFアッセイのための基準信号としてACAを使用する。ACA場合24 ACAは、位置制御としてだけでなく、基準信号の単一CENP-Bよりも適切なオプションかもしれません上記のように信号がCENP-Bを有する標的タンパク質の枯渇および/または標的タンパク質の機能不全が、共局在化に影響されないことは悪いです。
Bodorのら 。動原体CENP-Aレベルは、動原体CENP-Aの量は、細胞内含有量に直接比例して変化する、すなわち質量作用によって調節されていることを報告した。56彼らはまた、CENP-expressionの過渡誘導がでプロンプト増加につながることを示しました動原体CENP-レベル。逆に、我々はCA-UTRのsiRNA（UTRのsiRNAの5 'および3'の混合物; 表1）とpTRM4発現ベクターの同時トランスフェクション後にセントロメア局在、Flagタグ付きCENP-WTを持つ大規模な細胞集団を観察した（データではありません示されています）;この集団は、pTRM4発現ベクターでのトランスフェクション後に見られるものよりも大きかったです。その発現pTRM4によって駆動された外因性Flag標識CENP-Aタンパク質のレベルは、内因性のCENP-Aよりも高い大きさ（10〜25倍）の約1.0〜1.4のオーダーであった（データは示さず）。特定のしきい値以上の外因性のCENP-WTの発現に悪影響をその適切な動原体局在化に影響を与える可能性があると推測されます。
現在のプロトコルでは、固定は、天然の状態にできるだけ近位の状況として細胞構造や環境を維持するための重要なステップです。細胞が固定されると、一方がINTEのタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきです休息やセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし。21このため変動により、固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。固定の時間長を大幅に免疫染色することによりタンパク質の検出に影響を与えることができ、短い固定は、抗原性を保持するために、一般的に良好である。57したがって、他のセントロメア、動原体タンパク質の新しい標的についての染色手順を決定する際に、特に不明の新しい抗体とローカリゼーション、または作業する場合、1が最適条件を見つけるために、固定およびバッファのいくつかの方法をテストする必要があります。現在のプロトコルでは、人気の固定剤の二つのクラスを選択した：アルデヒド固定液（プロトコル2）と有機溶剤（プロトコル3および4）。固定剤の純度も非常に重要です。プロトコル4で、4％ヤギ血清をespecia使用されLLY非特異的バックグラウンドを低減するために、細胞表面上のIgG受容体をブロックするために57の一般的に、血清を一次抗体とは無関係の、好ましくは二次抗体と同じ種から種であるべきであるのIgG受容体を遮断する。57
現在の各プロトコルでは、一次抗体の選択は成功した免疫染色を達成する上で最も重要なステップです。最大の特異性、純度、親和性、および結合活性を有する抗体が望ましいです。モノクローナル抗体のための良い出発濃度は、通常1-5 / mlのです。ポリクローナル抗体の原料調製の典型的な希釈は1時20分から1までの範囲：500 57 One経験的に一次抗体の適切な濃度と各サンプルの希釈剤を決定する必要があります。サンプルは穏やかに揺り動かしたが、均一な染色のためのインキュベーション中に乾燥しないようにする必要があります。一次抗体および二次αのインキュベーションの間に大規模な洗浄ntibodyは、他の種由来の免疫グロブリンとの交差反応を回避するために必要とされ得ます。しかし、最適な洗浄条件は、振とうしたときに丸めると切り離し特に有糸分裂細胞（ すなわち 、有糸分裂シェイクオフ）、細胞の喪失を回避するために、経験的に決定されなければならない。成功のための58、二次抗体は、に結合するように選択されなければなりません高い親和性を有する一次抗体。例えば、IgGのFc受容体への二次抗体のFc部分の非特異的結合を回避するために、FB（ab '）2断片は抗体全体の代わりに使用することができる。多くの二次抗体、インキュベーション時間57は 30分に最小化することができます室温で非特異的バックグラウンドを減少させます。
プロトコル5に加えて、レーザー走査共焦点顕微鏡は、検出及び局在および蛍光特性を有するセントロメア、動原体タンパク質の機能を分析するのに有利であり得ます。材料/ Equipmeの一覧に示すように、NT、アレクサフルオロ488およびAlexaフルーア594は、おそらく現在のプロトコルの中で最も頻繁に使用される蛍光色素です。サンプルで2および/ または複数の異なるセントロメア-動原体タンパク質を検出するために、1は、一つのタンパク質を検出するために使用される抗体は、第二のタンパク質の検出を妨げないようにする必要があります。現在のプロトコルでは57を 、2次抗体を混合して適用されます同時に。しかし、一つは一次または二次抗体を一緒に適用する前に、別々に各タンパク質についての免疫染色条件を最適化すべきである：二つのタンパク質は、2つのセントロメア、動原体成分の場合のように近接している場合、一次抗体は、構造の結合を防止することができます二次抗体。別のスペクトルチャネルに1色素」漏れ」からの信号を防止することが困難：複数の信号検出のもう一つの懸念は、スペクトルの重複の問題です。この問題は、大会のために、より困難になりますアル干渉フィルタは、染料の数が増加するとして、またはサンプルが自家蛍光の干渉を含むoverenhanced信号（ 例えば 、ACAまたは本研究における抗Flag信号）を、含まれている場合、解決するために設定します。自己蛍光のトラブルシューティング他の研究で行われてきた。本研究では57,59,60、各チャネルの単一ラベルコントロールと蛍光フィルターセットを最適化する（下記参照）、これらの問題を回避するために、ほとんどの場合十分です。
現在の各プロトコルで、適切なコントロールが不可欠です。免疫染色を開始する前に、すべての新しい一次抗体を特徴付けする必要があります。該当する場合、抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析によって確認されるべきです。また、染色が細胞表面に非特異的結合によって引き起こされていないことの確認が得られるべきであり、特定の一次抗体の最適な作業用濃度は、連続希釈の使用を介して決定されるべきです（ すなわち 、結合曲線が開発されるべきです）。ネガティブコントロール（ すなわち 、染色プロセスからの一次抗体の非存在下）が含まれるべきです。ネガティブコントロールの別のオプションは、一次抗体のための同じ種からの正常IgGの置換です。上記のように複数のラベルの検出のために」、漏れ」、1は、スペクトル重複アーティファクト（ すなわち 、ブリードスルー、クロスオーバー、クロストークを回避するために、二次抗体（バックグラウンドコントロール）と同様に単一ラベルのコントロールなしでコントロールを準備する必要があります、または染料）。一つは「漏出」と実際の分布および/ または蛍光標識の共局在を計算する計算すべて除去するために、これらの比率を使用して、正しい信号が「間違った」フィルタを介して信号を比較することにより、「漏洩」の割合を定量化することができる。60バックグラウンドコントロールは、信号利得の制限を設定するには、各チャンネルに独立して調査し、ADAであることをオフセットする必要があります最終的なイメージングのためにPTED。各チャネルの自己蛍光のレベルが実質的に変化するため、複数のラベルサンプルの画像を取得するために使用されるすべてのチャンネルは、独立したバックグラウンド補正されなければなりません。上記のように制御を「漏洩」は、隣接チャネルへの「漏出」を検出することなく、各チャネルの可能な信号利得の量を決定するために必要とされる。60
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金GM68418によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
| Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
| Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
| TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
| BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
| Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
| Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
| Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
| Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
| Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
| Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
| Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
| Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
| Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
| Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
| Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
| Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
| Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
| Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
| ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
| Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
| Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
| Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
| Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
References
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