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Biology

内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白

Published: March 3, 2016 doi: 10.3791/53732

Introduction

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“着丝粒”被经典定义为遗传学抑制减数分裂重组的区域和以后确认为有丝分裂染色体的主收缩,其中有丝分裂期间起着准确的染色体分离中起重要作用。 “着丝粒”被描述为结合到微管在着丝粒的表面上,所揭示的电子显微镜的多层结构; “着丝粒”后来被定义为在本地化有丝分裂的着丝粒的大分子复合物。尽管脊椎动物中的着丝粒DNA序列的戏剧性发散,动粒的结构和组成是高度保守的。需要有丝分裂过程中染色体分离友们纺锤体微管和动粒之间的动态互动,在着丝粒动粒功能导致非整倍体,从而癌症的缺陷。

在大多数真核生物着丝粒没有定义的DNA序列,而是由包括171 bp的α卫星DNA分子的重复DNA白斑样的大阵列(0.3-5兆)的。除了 ​​在芽殖酵母,着丝粒的身份不是由DNA序列,但由包含组蛋白H3变体CENH3特殊核小体存在下实现(着丝粒蛋白A [CENP-A〕在人类中)。5 CENP-A的核小体定位于哺乳动物着丝粒7并绑定到171 bp的α卫星DNA分子的内板。主动要求着丝粒CENP-含A-核直接组成着丝粒​​相关网络(CCAN)和动粒蛋白的募集,它们共同规范染色体通过纺锤体检查点的有丝分裂纺锤体和随后的周期进程的附件。

另外,在上述证据的光,CENP-A已被提出是着丝粒8的后生标记;然而,这个过程由CENP-A结合我n要着丝粒DNA并负责此掺入的因素尚未充分表征。短丝粒靶向域(CATD)驻留在组蛋白折叠CENP-A的区域和替换H3与CATD相应区域的是足以直接H3到着丝粒。9几项研究建议的翻译后的功能角色修改CENP-A 12-16(PTM);然而,CENP-A的招募这些翻译后修饰的至着丝粒的分子机制尚未阐明。我们以前报道,CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶的活性需要CENP-A到着丝粒CENP-A K124泛素化和本地化。17

着丝粒蛋白的发现和鉴定,导致对染色体分离的新见解。18 100多名动粒的成分已通过各种途径在脊椎动物细胞中鉴定。19,20的下在荧光显微镜的着丝点是如何组装和功能也来自各着丝粒动粒蛋白和蛋白质网络的细胞功能的细胞内的表征地位。19直接可视化和先进的成像方法提供着丝粒着丝粒组件非凡分辨率及允许直接观察着丝粒和着丝粒的特定的分子组件。此外,使用特异性抗体间接免疫荧光的方法(IIF)染色对这些观察结果是至关重要的。然而,尽管关于IIF协议,很少在着丝粒特异性着丝粒蛋白质的细节问题的讨论的许多报告。1-4。因此,显影和报告IIF染色和定量IIF测定方法具体分析每个着丝粒动粒蛋白是极其重要的。在IIF染色,应该与染色方案进行,以避免所感兴趣的蛋白的损失或单元的其余部分。然而,定影破坏抗原位点偶尔,以及不同的抗体-抗原组合与一种固定剂不佳工作,但很好地与另一种,21和固定剂的选择在很大程度上取决于所感兴趣的蛋白(多个)。因此,不同的固定剂的方法是在着丝粒动粒蛋白IIF染色至关重要。

间接免疫荧光(IIF)染色和测定以解​​决内源性着丝粒动粒蛋白质,包括CENP-A和Flag标记的外源性​​CENP-A蛋白,以及在人类细胞中这些蛋白质的定量本地化这里优化方法已被开发出来。这些方法可以应用到在其它物种的着丝粒,动粒蛋白质的分析。

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Protocol

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1.细胞培养和转染

  1. 放的盖玻璃(22毫米×22毫米)在6孔聚苯乙烯板。可选的外套盖玻璃,聚L-赖氨酸,0.1%w / v的,水(见材料/设备清单),以保证有丝分裂细胞上按照以下步骤玻璃盖:
    注意:最佳条件,必须对每个细胞系和应用来确定。
    1. 用聚-L-赖氨酸,0.1%重量/体积,在无菌条件下涂层培养表面在水(0.4mL毫升/孔的6孔聚苯乙烯板)。轻轻摇动,以确保即使在培养表面涂层。
    2. 5分钟后,吸删除解决方案,并彻底冲洗用无菌组织培养级别的水面。
    3. 引入细胞和中干前至少2小时。
  2. 种子HeLa细胞17或HeLa细胞的Tet-Off细胞上放置在6孔聚苯乙烯板的盖玻璃(22毫米×22毫米)17,22。检查细胞密度为5.4×10 5每孔。培养细胞在具有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素的高葡萄糖DMEM中。
    注意:为了达到最佳效果,凭经验确定播种用的细胞密度。
  3. 孵育在37℃下将细胞在5%的CO 2的气氛中18小时。
    注意:在HeLa细胞的Tet-Off细胞的情况下,外源基因的转录是在不存在诱导剂( ,四环素/多西环素),因此培养细胞无四环素/多西环素的活性,并与pTRM4表达载体( 表2瞬时转),其转录由TRE启动子调控(见下文)。
  4. 播种,转染细胞18小时后,如下所示:
    1. 通过混合1.5微升的siRNA寡使溶液A(20μM的退火的库存; 表1)和/或2.0微克质粒( 表2)在50微升减少血清的培养基(参见材料/设备的列表),并在室温孵育5分钟。
      注意:在此分析中,CA-UTR的siRNA(5'3和'非编码区的siRNA的混合物; 表1)共转染在协议3和4(见讨论)一起使用。
    2. 通过混合0.75微升转染试剂I(参见材料/设备的列表)在50μl降低血清培养基,并在室温孵育5分钟使B液。
      注:可选的步骤是增加了1.0微升转染试剂II(见材料/设备的列表)。
    3. 混合溶液A和B一起,并在室温孵育15分钟。
    4. 用PBS洗涤培养细胞一次,然后加入500μl血清培养基减少到6孔聚苯乙烯板的各孔中。添加溶液A和B( ,RNA和/或DNA -脂质复合物)的混合物中直接向每个单独的井的。
      注意:终浓度为3.3微克/毫升(质粒); 50纳米(siRNA)的。
    5. 孵育在37℃下将细胞在5%的CO 2的气氛中4.5小时。介质更改为高糖DMEM机智H 10%FBS和1%青霉素 - 链霉素。
    6. 孵育在37℃下将细胞在5%的CO 2的气氛中对转染后48-72小时。
      注意:对于最佳的结果,固定之前的潜伏期为细胞生长,必须根据经验来确定,和蛋白质消耗和/或表达,必须通过Western印迹分析来确认(参见协议6)。
    7. 如果有丝分裂细胞分析很感兴趣,固定前添加紫杉醇(10纳米),以培养细胞24小时,或固定前添加TN16(0.5μM)到培养细胞2.5小时。

2.细胞固定和免疫荧光染色检测内源性着丝粒着丝粒蛋白(多聚甲醛固定)

  1. 固定剂,缓冲液和试剂的制备。
    1. 新鲜制备50毫升的在PBS,pH 7.4的4%低聚甲醛溶液中。
      1. 加40毫升1-×PBS中至玻璃烧杯中在搅拌板在通风橱。热而stirring至约60℃。 2克低聚甲醛粉末添加到加热的PBS中。
      2. 通过在总加入1ml的1N NaOH提高缓慢的pH值,因为粉末不会立即溶解。
        注:加入NaOH后的溶液清除。
      3. 一旦多聚甲醛溶解,冷却,滤出液。
      4. 调节pH值用1N HCl至pH 7.4,并将该溶液用1×PBS的体积至50ml。
        注意:溶液的等分试样可以冷冻或贮存在2-8℃下,只要1周。溶液应冰冷或储存在4℃下直到它被使用。
    2. 制备50ml的缓冲液KB1,它由10毫摩尔Tris盐酸,pH为7.5的; 150毫摩尔NaCl; 0.5%BSA;和0.5%的Triton X-100。
      注:BSA应新鲜添加。
      注:该缓冲区KB系列是基于以前的报告中描述的缓冲KB 1,2,4。
    3. 制备50ml的缓冲液KB2,它由10毫摩尔Tris-HCl中的,pH为7.5; 150毫摩尔NaCl;和0.5%的BSA。
      注:BSA应新鲜添加。
    4. 制备1ml含有DAPI(50毫微克/毫升)缓冲KB3的。
    5. 制备100毫升的安装平台,它由1毫克/毫升对苯二胺的; 10%的PBS,90%甘油。
      1. 调整为1×PBS中,以9.8的pH值用1N NaOH,在溶液中溶解对苯二胺,然后添加甘油。
      2. 商店在-80℃1ml等份。避光。
  2. 在48-72小时后转染(见方案1),进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次,用PBS。应用PBS到培养孔的侧面,以避免干扰所述细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点,必须根据经验来确定。
  3. 固定在PBS中的4%多聚甲醛将细胞在4℃下30分钟。冲洗细胞两次用缓冲液KB2充分地除去残留的4%多聚甲醛。
  4. Permeabi丽泽在缓冲器KB1样品在室温30分钟。用缓冲液KB2冲洗细胞一次,并在室温添加缓冲KB2 5分钟以非特异性结合的附加块的站点。
    注:缓冲KB1也显著有助于阻止。
  5. 从使用镊子6孔聚苯乙烯板卸下的盖玻璃(22毫米×22毫米)。使用疏水屏障笔(见材料/设备清单),画一个浅绿色的方形或圆形周围形成每个盖玻璃样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。安装了新的6孔聚苯乙烯板玻璃盖。
  6. 稀释的初级抗体对丝粒或动粒蛋白(第1稀释比:100到1:200;也参见材料/设备的列表)和任一抗CENP-B抗体(第1稀释比:400)或抗着丝点抗体(ACA)(1稀释比例:2,000)作为缓冲KB2着丝粒的位置标记。
    注意:为了获得最佳效果,最终concentra在该溶液中的一级抗体的灰必须凭经验确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积( 30微升)沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞用缓冲KB2 3次。
  8. 用缓冲KB2,稀荧光团缀合的第二抗体(第1稀释比:200:100:1)针对每个第一抗体。
    注意:为了获得最佳效果,二次抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  9. 施加足够的体积将稀释的次级抗体( 30微升在盖玻璃的下降)到浸入细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次缓冲KB2期间的30分钟(次6分钟洗涤)。
    注意:为了达到最佳效果( 对细胞的损失最小),最佳的洗涤条件必须确定empiricaLLY。
  10. 应用含有DAPI(50毫微克/毫升),以浸没细胞样品缓冲KB3的足够体积。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞用缓冲KB2 1-2次。
  11. 装入包含细胞样品到微滑动玻璃盖。
    1. 放置在微滑动的中心安装介质的压降。
    2. 从细胞样品中移除液体,并使用手或镊子,在微滑动的中心样本位置。避免气泡产生。
    3. 用纸巾去除多余的封固剂。

3.细胞C端的固定和免疫荧光染色标志标记CENP-A蛋白(丙酮固定)

  1. 制备
    1. 准备冰冷的75%丙酮。
    2. 新鲜制备50ml含0.5%脱脂乳和0.5%BSA的PBS(pH 7.4)中的。
    3. 新鲜制备50ml含0.1%脱脂乳和0.1%BSA的PBS(pH 7.4)中的。
    4. 制备1ml的PBS(pH 7.4)中含有DAPI(50-100纳克/毫升)。
    5. 在2.1.5中描述制备100ml的安装介质。
  2. 在48-72小时后转染(见方案1),进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次,用PBS。应用PBS到培养井的侧面,以避免干扰所述细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点,必须根据经验来确定。
  3. 固定在冰冷的75%丙酮的细胞,并孵育细胞在-20℃下10分钟。干细胞在通风橱中在室温下30-60分钟的护罩玻璃。
    注意:为了达到最佳效果,需要为固定和细胞干燥的时间长度,必须根据经验来确定。
  4. 使用疏水屏障笔(见材料/设备清单),画一个浅绿色的方形或圆形周围形成每个盖玻璃样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。
  5. 块nonspecIFIC加入含有的PBS 0.5%脱脂乳和0.5%的BSA在室温下5分钟的结合在细胞上的网站。
  6. 使用含有0.1%脱脂乳和0.1%BSA的PBS稀释的抗Flag抗体(1:1000稀释比),或者抗CENP-B抗体(第1稀释比:200)或ACA(1:2,000稀释比),为着丝粒的位置标记。
    注意:为了获得最佳效果,第一抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积( 30微升)沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次用封闭缓冲期间的30分钟。
    注:细胞可以用PBS漂洗。对于最佳结果( ,为了避免细胞的损失),最佳的洗涤条件,必须根据经验来确定。
  8. 稀释荧光团缀合的第二抗体(第1稀释比:200:100:1)针对在含有0.1%脱脂乳和0.1%BSA的PBS中的每个主抗体。
    注意:为了获得最佳效果,二次抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  9. 应用稀释的二级抗体的足量( 30微升)沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞2次,用含有0.1%脱脂乳和0.1%BSA的PBS。
    注意:单独的PBS也可用于洗涤细胞。
  10. 适用的PBS足够体积含有DAPI(50-100纳克/毫升),以浸没细胞样本。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞1-2次,用PBS。
  11. 安装在2.11中所述含细胞样品到微滑动玻璃盖。

4.细胞N端的固定和免疫荧光染色标志标记CENP-A蛋白(甲醇固定)

  1. 制备
    1. 准备冰冷的甲醇。
    2. 制备的TBS含有4%山羊血清(pH 7.4)中。
    3. 制备1毫升含TBS DAPI(50-100毫微克/毫升)(pH值7.4)。
    4. 在2.1.5中描述制备100ml的安装介质。
  2. 在48-72小时后转染(见方案1),进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次用TBS。适用的TBS到培养孔的一侧,以避免扰乱细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点,必须根据经验来确定。
  3. 固定在冰冷的甲醇中的细胞,并孵育细胞在-20℃下6分钟。冲洗细胞两次,用TBS充分除去残留的甲醇。
  4. 使用疏水屏障笔(见材料/设备清单),画一个浅绿色的方形或圆形创建一个围绕每个玻璃罩样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。
  5. 块上的CEL非特异性结合位点用含4%山羊血清加入TBS LS。在室温下孵育10分钟。
  6. 稀释的抗Flag抗体(1:1000稀释)和任一抗CENP-B抗体(第1稀释比:200):在含有4%山羊血清的TBS(2,000稀释比1)作为着丝粒的位置标记或ACA 。
    注意:为了获得最佳效果,第一抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积( 30微升)沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次用封闭缓冲期间的30分钟。对于最佳结果( ,细胞的损失最小),最佳的洗涤条件,必须根据经验来确定。
  8. 稀释荧光团缀合的第二抗体(第1稀释比:200:100:1)在含有4%山羊血清的TBS针对每个初级抗体。
    注意:为了达到最佳效果,国际泳联在该溶液中的二级抗体l的浓度必须根据经验来确定。
  9. 应用稀释的二级抗体的足量( 30微升)沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞3次,用封闭缓冲液。
  10. 应用含有DAPI(50-100纳克/毫升)浸入细胞样品的TBS的足够体积。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞1-2次用TBS。
  11. 装入包含在2.11中所述的细胞样品到所述微滑动玻璃盖。

5.免疫荧光图像观察,采集,定量和分析

  1. 通过配有一个63X和100X油浸镜头,外部紧凑的光源,和一个数字CCD照相机的机动荧光显微镜观察细胞的样品。
  2. 进行图像采集和处理,包括反褶积,使用软件A,或软件B1和B2(见材料/设备的列表)。请参阅补充编码文件(5.2.1)中的软件A.对于软件B1和B2使用的所有命令使用的所有命令,请参阅(5.2.2)的补充代码文件。
  3. 用前述方法23-25 ​​量化着丝粒动粒蛋白的信号( 例如 ,基本维持在着丝粒CENP-A的信号)具有以下稍作修改:
    1. 在着丝粒动粒蛋白的选择区域内,以及背景如下:
      1. 有丝分裂细胞:(着丝粒着丝粒区)选择区域与用DAPI染色体重叠;染色体外,但在相同的单细胞内( 细胞质区)(背景区域)和面积。
      2. 相间细胞:(着丝粒着丝粒区)选择区域与染色用DAPI重叠; (背景区)和区外的染色质,但相同的单细胞内(<EM>即细胞内区域)。
        注:另见补充编码文件(5.2.1.4.3)或(5.2.2.6.4)的区域选择与软件A或软件B2分别。
    2. 使用软件A或B.对于此任务,使用下面的公式量化的着丝粒剩余信号的百分比:
      在着丝粒动粒剩余着丝粒动粒蛋白的信号
      公式1
      其中s是所选择的区域,这是由ACA或CENP-B染色证实的信号亮度; b是背景信号的亮度; R 样品是用于siRNA(S)处理的细胞的参照ACA或CENP-B信号;和 Ctrl是参考ACA或CENP-B信号为吕克的siRNA转染的细胞。
      注意:在此分析,以前的报告中描述CENP-B信号被用作参考CUL4A信号和RBX1。
    3. 使用这种计算Excel文件复制后从上述信号定量软件粘贴的原始数据。另见补充编码文件:(5.2.1.4)和(5.2.2.6)了解详细信息。计算的一个例子示于表3中
  4. 分析至少20个细胞,以消除在染色和图像采集每个测量电平变化。可以选择使用剩余的着丝粒着丝粒信号的“平均值”为每一个分析单元,以这些价值观不同的着丝粒着丝粒蛋白中进行比较。

总蛋白的6印迹分析

  1. 悬浮细胞在变性缓冲液A(20mM的Tris-盐酸,pH为7.4; 50毫摩尔NaCl; 0.5%的Nonidet P-40的0.5%脱氧胆酸盐; 0.5%SDS; 1mM EDTA中;以及完整无EDTA蛋白酶抑制剂混合物), 26受该悬浮液以声波处理和冻融过程,并测量蛋白质浓度如下:
    1. 对于超声处理过程中,加50微升缓冲液A从在48-72小时后转染6孔聚苯乙烯板的两井采集的细胞(参见方案1)。操作装有干扰物喇叭和微尖端超声波仪(参见材料/设备的列表),每一个样品合计15秒的间歇脉冲持续时间(占空比50%)。
    2. 对于冻融过程中,冷冻用液氮细胞,并在室温解冻细胞。
    3. 使用商业蛋白质检测试剂I或II测量蛋白浓度(见材料/设备的列表)。
      注意:裂解物在与任一试剂I或II的蛋白质浓度的测定1:10的比例稀释。在该稀释中,存在于缓冲液A中的SDS示出了在该测定很少或没有干扰。
  2. 混合含有20-30微克总蛋白的裂解物与2×或4×SDS-PAGE上样缓冲液。27煮沸的样品5分钟,然后加载它们在12.0%-15.0%变性电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
  3. 通过使用先前描述的Western印迹方法转移通过SDS-PAGE分离到PVDF膜上的蛋白质。17,24,27-31
    1. 方框用5%无脂奶在膜上的非特异性结合位点在1×PBS中,然后孵育稀释的初级抗体的溶液的膜在RT 1小时。请参阅各主要抗体的详细信息( 例如,稀释比例)材料/设备清单。
    2. 用PBS-T缓冲液洗涤该膜3-4次(每3到5分钟孵育振荡)后(1×PBS和0.1%吐温-20),孵育在近红外(IR)的混合物,该膜荧光染料缀合的二级抗体(第1稀释比:20,000),DyLight缀合的第二抗体(1稀释比:20,000),和/或辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体(在PBS-T稀释; diluti上的比例为1:在RT 1小时10,000)。请参阅各二级抗体的详细信息( 例如,稀释比例)材料/设备清单。
  4. 洗膜3次,然后扫描该膜,以分析与红外成像系统和/或用于免疫印迹检测的化学发光成像的蛋白质(参见材料/设备的列表)。
    1. 对于使用红外成像系统,请参阅(6.4.1)的补充代码文件。
    2. 对于使用化学发光成像仪,见(6.4.2)的补充代码文件。使用超灵敏化学发光增强(ECL)底物(见材料/设备清单)这个系统。

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Representative Results

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内源性CENP-A的免疫荧光分析支持CUL4A-E3连接酶需要CENP-A的本地化着丝粒的假说
我们最近的研究表明,CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶的活性需要在CENP-A和CENP-A至着丝粒的本地化赖氨酸124(K124)的泛素化17最初,相间着丝复合体(ICEN)被隔离抗CENP-A:原生染色质免疫沉淀,32-34,它一直推测,一些ICEN蛋白质可能在定位CENP-A至着丝粒的作用。因此,进行siRNA敲除实验以筛选诱导CENP-A的离域在着丝粒17,其不存在表达的蛋白质(数据未显示):异步生长HeLa细胞与滞蛋白4A(CUL4A)siRNA或RBX1的siRNA转染的倍所需的最佳蛋白质消耗(48小时r代表CUL4A和72小时的RBX1)。与CUL4A的siRNA转染的细胞显示CENP-A的在着丝粒一个显著离域( 图1A-C)。如在图2G所示,在CUL4A的siRNA转染细胞的总细胞裂解物CENP-A的蛋白质水平从萤光素酶类似于在裂解物CENP-A水平相同的培养条件下(吕克)的siRNA转染的细胞。的CUL4A的siRNA脱靶效应的可能性被排除在外,因为CUL4A标志的异位表达救出CENP-A在着丝粒的减少时CUL4A的siRNA靶向3'UTR( 图2A-C)。 CENP-A的总细胞裂解物的蛋白质水平证实是类似于在无论细胞周期阶段( 图1B,2G)的相同的培养条件下从吕克的siRNA转染的细胞裂解物CENP-A水平;因此,可能性CUL4A消耗所致CENP-A蛋白降解被淘汰出局。

35和包含3个主要因素:滞支架,一环指蛋白(RBX1或RBX2),和由RBX1或RBX2招募了泛素带电E2酶,36所述的环指蛋白还招募了放置基板在接近E2酶,以促进泛素转移衬底适配器36 RBX1的siRNA诱导的显著减少CENP-A在其中CENP-A在RBX1的siRNA转染细胞的总细胞裂解物的蛋白水平类似于在从吕克的siRNA转染的细胞裂解物CENP-A水平的条件下,着丝粒( 图1D-F)( 图2G)。或者通过RBX1耗尽或CUL4A的相同的培养条件下的结合和RBX1耗尽CENP-A蛋白的降解,没有观察到( 图2G)。的脱靶效应的可能性RBX1的siRNA第被排除在外,因为旗RBX1的异位表达救出CENP-A在着丝粒的减少时,RBX1的siRNA靶向3'UTR( 图2D-F)。这些结果表明,CUL4A-RBX1-E3连接酶是专门针对需要CENP-A的本地化着丝粒。

外源性CENP-A的免疫荧光分析 - 标志蛋白质表明CENP-A K124泛素化是CENP-A的本地化至关重要的着丝粒
先前,我们免疫沉淀-质谱分析表明,赖氨酸124 CENP-A-标示的(K124)在HeLa细胞中被泛素17在CENP-A的核小体的晶体结构,K124驻留在α3螺旋,虽然该网站是不是CATD区域17内。此外,K124是哺乳动物,鸟类,蜥蜴,植物,和一组真菌( 例如 ,芽中保守鼎酵母)17 CENP-A赖氨酸突变体( 图3A)构建和测试他们的本地化着丝粒的能力。观察外源性CENP-A K124R突变体在有丝分裂和间期HeLa细胞扩散信号的着丝粒定位的实质废除( 图3B,C)。着丝粒的定位并没有显著影响既不由K9A突变(K9对应于组蛋白H3 K9甲基化),也不K77R突变(K77是CATD一个独特的赖氨酸位点)( 图3B,C)。

基于这些结果,两个假设提出关于在K124 CENP-A泛素的体内功能。首先,K124泛素的作用是对泛素介导的蛋白质,以消除过表达和/或错误定位CENP-A至常染色质。其次,CENP-A泛素对K124的作用是加载CENP-A着丝粒上。为了测试在FIRST可能性,CUL4A-的CENP-A-标示野生型和K124R突变体以及后酮(CHX)的内源性CENP-A处理或RBX1耗尽细胞的稳定性进行了处理。这些数据表明,K124的泛素化是可能不参与泛素介导的蛋白质,以消除过表达和/或错误定位CENP-A(未示出数据)。17。此外,有人证实,K124R突变废除推定monoubiquitylation和diubiquitylation频带,无论是在体内 和体外泛素化测定(数据未显示)。17总的来说,这些数据表明,CUL4A-RBX1复杂有助于“信令”泛素化,这是需要在着丝粒CENP-A定位。

外源性标志的免疫荧光分析 - CENP-A蛋白表示单遍融合足以载入CENP-A在着丝粒K124R
根据以上的结果,可以推测,共价连接的单遍在蛋白用作CENP-A装载到着丝粒的信号。为了检验这一假设,N-末端Flag标记和C-末端泛素融合野生型CENP-A和K124R突变体构建CENP-A( 图4A)。该单遍在蛋白突变体泛素(K48R),其缺少多泛素37-39的主要部位也被用来防止泛素融合CENP-A蛋白从潜在多泛素化。通过捕捉抗Flag免疫荧光信号,由这些构建体编码的蛋白质的着丝粒的定位进行了测试。而旗CENP-A(K124)CENP-A的大幅废止着丝点定位( 图4B4C,列[6]),这两个旗CENP-A(WT)和旗CENP-A(WT)-UB( WT)保持着丝粒的定位( 图4B4C所示 ,列[1]和[2])。该旗CENP-A(K124R)-UB(K48R)的蛋白质大概是模仿monoubiquitylated CENP-A,因为这样的蛋白质基本恢复本地化着丝粒( 图4C,比较柱[5] [6])更有效地比没有CENP-A (K124R)-UB(WT)( 图4C,比较列[4] - [6])。这些数据表明,monoubiquitylation足以CENP-A的招募着丝粒。

图1
图1.内源性CENP-A的免疫荧光分析支持CUL4A-E3连接酶需要CENP-A的本地化着丝粒(图从Niikura 17 改编 的假说 在着丝粒CENP-A的(A)CUL4A的siRNA引起的离域。 HeLa细胞与CUL4A或荧光素酶(吕克)的siRNA转染,并48小时培养(表1)。比例尺条为10μm以下。(B)中使用相同的培养条件下的HeLa全细胞裂解物的Western印迹分析如在(A)中。收获细胞用CUL4A siRNA或吕克的siRNA( 表1)在转染后48小时。 GAPDH担任过负荷控制(C)在(A)所示的着丝粒量化内源性CENP-A的信号。通过使用吕克的siRNA转染的细胞进行的信号归一化,和平均百分比(±SD)被示出。 **** P <0.0001 VS吕克的siRNA转染的细胞(学生t检验)。(D)RBX1的siRNA诱导CENP-A的着丝粒从离域。 HeLa细胞用RBX1或吕克的siRNA(多个)转染,并培养72小时( 表1)。比例尺条为10μm以下。(E),使用相同的培养条件下的HeLa全细胞裂解物的Western印迹分析如(D)中。收获细胞,72小时与RBX1Ø转染后ř吕克的siRNA(多个)( 表1)。 GAPDH担任过负荷控制。(F)在(d)所示的着丝粒量化内源性CENP-A的信号。通过使用吕克的siRNA转染的细胞进行的信号归一化,和平均百分比(±SD)被示出。 **** P <0.0001 VS吕克的siRNA转染的细胞(学生t检验)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.与图1的着丝粒参考信息(图改编自Niikura 17)。(A)外源性CUL4A标志救出CENP-A的离域时CUL4A的siRNA靶向3'UTR。海拉TET-CEL关闭LS进行共转染之后固定在48小时用siRNA(CUL4A#2:3'UTR目标或吕克; 表1)加质粒构建体(pTRM4-CUL4A-标志或向量; 表2)。 4色免疫染色:染色为DAPI(蓝色);旗;内源性CENP-B(红色);和内源性CENP-A(绿色),进行和标志阳性细胞分选,但标志图像为了简化而省略。注意:CUL4A#2是相同的目标作为图1A-C中所示。比例尺条为10μm以下。(B)中 ,按照如在(A)中所示的相同的培养条件下的HeLa四环素-关全细胞裂解物的Western印迹分析。 GAPDH充当上样对照。在(A)所示的着丝粒(C)的 CENP-A信号分别通过显微镜的细胞以分离那些通过抗Flag抗体结合的排序后定量。的信号归一化,用与吕克的siRNA加载体转染的细胞进行,且平均百分比(±SD)被示出。**** P <0.0001 VS与吕克的siRNA加矢量(左列,学生t检验)转染的细胞。(D)外源性旗RBX1救出CENP-A的离域的着丝点时,RBX1的siRNA靶向3'UTR 。 HeLa细胞分别固定在共转染后72小时用siRNA(RBX1#2:3'UTR目标或吕克; 表1)加质粒构建体(的pcDNA3-旗RBX1或向量; 表2)。 4色免疫染色:染色为DAPI(蓝色);旗;内源性CENP-B(红色);和内源性CENP-A(绿色),进行和标志阳性细胞分选,但标志图像为了简化而省略。比例尺条为10μm的(E)之后的相同的培养条件如(D)中的HeLa全细胞裂解物的Western印迹分析。 GAPDH担任过负荷控制。(F)在(d)所示的着丝粒CENP-A信号用显微镜细胞分选分离那些由一个约束量化后 N抗Flag抗体。的信号归一化,用与吕克的siRNA加载体转染的细胞进行,且平均百分比(±SD)被示出。 **** P <0.0001 VS与吕克的siRNA加载体(左列,学生t检验)转染的细胞。(G),CUL4A和RBX1耗竭没有影响内源性CENP-A蛋白的水平。在HeLa全细胞裂解液进行测定的内源性CENP-A蛋白的水平收获与CUL4A,RBX1,CUL4A加RBX1,或吕克siRNA转染后72小时。转染后48小时,细胞未处理(ASYN)或紫杉醇(+含税)以诱导有丝分裂停止,并且它们培养24小时进行处理。 GAPDH担任过负荷控制。 请点击此处查看该图的放大版本。

32 / 53732fig3highres.jpg“WIDTH =”700“/>
外源性CENP-A-标志蛋白图3.免疫荧光分析显示,CENP-A K124泛素化需要在着丝粒CENP-A定位(图改编自Niikura 17)。(A)CENP-A的表达标志构建体(WT和KR突变体)用的HeLa四环素 - 关全细胞裂解液的蛋白质印迹分析证实。收获细胞用pTRM4-CENP-A-标示WT,KR的突变体,或pTRM4载体( 表2)在转染后48小时。 CENP-A-标示的过表达用抗Flag抗体检测。 GAPDH担任过负荷控制。假定CENP-A-标志二聚体(##)和CENP-A-标志单体(#)所示。注:耐SDS CENP-A二聚体已有报道40,41(B)的CENP-A K124R突变体从着丝粒扩散离域。从DAPI(蓝色),旗(格力信号n)和内源性CENP-B(红色;着丝粒的位置控制)被示出。注:与同CUL4A或RBX1的siRNA转染的细胞内源性CENP-A,弥漫性信号出现过表达外源性CENP-A K124R标志作为无力的表型的细胞有针对性地着丝点,大概是因为其表达水平约为10 -到25倍,比内源性CENP-A的更高(数据未示出)17比例尺表示10μm的(C)的 (B)中示出的本地化模式的直方图。 50多名PRO /前中期和中期细胞,每个实验200余间期细胞计数(N≥3实验)。的平均百分比(±SD)被示出。 “其他人(非着丝点)”表示大部分受损细胞,死细胞,或者与核仁定位(仅在相间)细胞,大概是因为转染或其他治疗的。 *** P <0.001对CENP-A WT-标志(学生t检验)。

图4
外源性旗CENP-A蛋白图4.免疫荧光分析显示,CENP-A着丝粒从CENP的-A K124R突变的单遍融合救离域(图从Niikura 17 改编 )。 (A)在本研究中使用的每个构建体的示意图卡通(也见表2)。上CENP-A(红)和单遍在蛋白(蓝色)的K48R突变位点的K124R突变位点被示出。 (1)WT:旗CENP-A WT,(2)WT-UB(WT):旗CENP-A WT-UB(WT),(3)WT-UB(K48R):旗CENP-A WT -UB(K48R),(4)K124R-UB(WT):旗CENP-A K124R-UB(WT),(5)K124R-UB(K48R):旗CENP-A K124R-UB(K48R),(6)K124R:旗CENP-A K124R(B)外源性CENP-A着丝粒从CENP的-A K124R突变的单遍融合救离域。 DAPI(蓝色),标志(绿色),和内源性CENP-B(红色;着丝粒的位置控制)被示出。比例尺条为(C)中示出的本地化模式的10微米。(C)的柱状图。 50多名PRO /前中期和中期细胞,每个实验200余间期细胞计数(N≥3实验)。的平均百分比(±SD)被示出。 **** P <0.0001和*** P <0.001对非融合旗CENP-A K124R(列[6])(学生t检验)。 请点击此处查看该图的放大版本。

siRNA靶 在指示本研究 目标类型 siRNA的数据库数量 正向序列(S) 来源/参考
荧光素酶(GL3) - 1目标 RKK9 CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT Elbashir 等人 ,(2001)
CENP-A CA-UTR siRNA的游泳池(2目标混合物) RKK375 / 5'UTR T1 CGAGCGGCGCGGACUUCUGCCdTdT Niikura 等人 ,(2015)
RKK383 / 3'UTR T1 UCCUGCACCCAGUGUUUCUGUdGdT Niikura 等人 ,(2015)
CUL4A #1 1目标 CRKK178 / RKK309 / T1 AGCGAUCGUAAUCAAUCCUGA Niikura 等人 ,(2015)
#2(3'UTR) 1目标 CRKK181 / RKK331 / T4 AUGCGGGUUUGAAAUAUGACA Niikura 等人 ,(2015)
RBX1 / ROC1 #1 siRNA的游泳池(4个目标混合物) CRKK198 / RKK411 / T1 GAAGCGCUUUGAAGUGAAA Niikura 等人 ,(2015)
CRKK198 / RKK413 / T2 GCAUAGAAUGUCAAGCUAA Niikura 等人 ,(2015)
CRKK198 / RKK415 / T3 GCAAGAAGCGCUUUGAAGU Niikura 等人 ,(2015)
CRKK198 / RKK417 / T4 CAACAGAGAGUGGGAAUUC Niikura 等人 ,(2015)
#2(3'UTR) 1目标 CRKK206 / RKK425 / T8 UUCCCUGCUGUUACCUAAUUA Niikura 等人 ,(2015)

在这项研究中使用表1中的siRNA序列。

数量为B 相关特性(多个) 来源/参考
B288 pTRM4 Niikura 等人 ,(2006)
B2067 pTRM4人CENP-A-标志 Niikura 等人 ,(2015)
B2281 pTRM4人CENP-A K9A标志 Niikura 等人 ,(2015)
B2387 pTRM4人CENP-A K77R标志 Niikura 等人 ,(2015)
B2388 pTRM4,呼玛ñCENP-A K124R标志 Niikura 等人 ,(2015)
B2512 pTRM4标志人类CENP-A Niikura 等人 ,(2015)
B2579 pTRM4标志人类CENP-A K124R Niikura 等人 ,(2015)
B2513 pTRM4标志人类CENP-A-UB(WT) Niikura 等人 ,(2015)
B2559 pTRM4标志人类CENP-A K124R-UB(WT) Niikura 等人 ,(2015)
B2515 pTRM4标志人类CENP-A-UB(K48R) Niikura 等人 ,(2015)
B2560 pTRM4标志人类CENP-A K124R-UB(K48R) Niikura 等人 ,(2015)
B2759 pTRM4人CUL4A标志 Niikura 等人 ,(2015)
B2624 的pcDNA3-FLAG人RBX1 Niikura等人,(2015)
B1491 的pcDNA3标志 Niikura 等人 ,(2015)

表2.本研究中使用的质粒载体。

R(抗CENP-B)样品 B(抗CENP-B)的 - [R样品(减去) 比(S样品,R样品) 更正比(S样品,R样品)
520 514 6 -4.167 0.000
535 445 90 -1.033 0.000
515 431 84 0.274 0.274
562 483 79 0.506 0.506
902 562 340 0.509 0.509
1203 703 500 -0.560 0.000
1014 589 425 -0.819 0.000
768 510 258 -1.345 0.000
555 458 97 -1.845 0.000
781 576 205 -1.146 0.000
556 436 120 0.758 0.758
534 493 41 -1.634 0.000
702 543 159 0.667 0.667
482 429 53 -1.000 0.000 654 531 123 0.740 0.740
1190 607 583 0.384 0.384
552 454 98 0.969 0.969
489 413 76 0.539 0.539
511 452 59 -3.186 0.000
485 475 10 -2.700 0.000
481 441 40 -1.475 0.000
5.347
平均 0.255
R(抗CENP-B)CTRL B(抗CENP-B)的 比(S CTRL:右Ctrl) 更正比(S CTRL:右Ctrl)
543 483 60 3.017 3.017
526 466 60 2.667 2.667
532 460 72 1.792 1.792
507 457 50 3.520 3.520
491 458 33 4.273 4.273
545 464 81 2.160 2.160
518 484 34 3.559 3.559
461 404 57 2.404 2.404
487 447 40 3.550 3.550
534 477 57 3.965 3.965
528 456 72 3.097 3.097
707 601 106 1.868 1.868
615 528 87 2.828 2.828
660 481 179 1.620 1.620
565 476 89 1.607 1.607
527 455 72 3.583 3.583
560 474 86 2.930 2.930
510 451 59 4.017 4.017
729 586 143 2.678 2.678
634 576 58 3.655 3.655
507 476 31 3.935 3.935
62.725
平均 2.987
在着丝粒CENP剩余-A信号(%) 8.5

3. 在着丝粒(%)剩余CENP-A的信号的计算的 一个例子示出的Pro /前中期在图2F的一个例子:样品是在图2F RBX1#2(3'UTR)+ VEC(中心柱),并控制是吕克+ VEC(在图2F左列)。这样一来,剩下的CENP-A的信号着丝粒(%)=(0.255 / 2.987)×得到100 = 8.5%(或[5.347 / 62.725]×100 = 8.5%具有相同的总细胞数目[ ,21细胞]两种样品之间分析的)。请注意,如果b值为大于S值以上( ,如果减去值为负),校正比率值被设置为0.00。

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Discussion

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近年来,许多研究已经在着丝粒动粒生物学为固定细胞开发了不同的定量显微镜测定。42进展通常需要的蛋白质的着丝粒特异性或特异性着丝点功能的理解,其中亚细胞时空调控反映不断变化的功能在细胞周期的这些蛋白质。因此,这里我们开发IIF染色和定量的IIF分析特异性分析内源性和外源性CENP-A蛋白的相对水平,这可以适用不同处理的样品中的方法。目前,我们实现了内源性CENP-I,CENP-H,KNL1,Hec1和Ska1在这项研究中采用方案2的成功IIF染色(见Niikura 等人 24和 ​​数据未显示;材料/设备清单抗体的信息) 。在将来,可以应用同样的方法来量化不同着丝粒动粒蛋白的水平(均endog源性和Flag标记的外源蛋白)选择特异性抗体,但是,我们的IIF方法不包括在活细胞中或在期间整个细胞周期的特定单电池这些蛋白质的检测。因为这些过程需要细胞被固定并在单独的盖玻片处理,我们引入以相当比较不同样品之间的信号和提高了测定的准确度为正常化的目的的参考信号( 例如 ,ACA或CENP-B)。因为ACA涉及内源性和/或外源CENP-A的信号,CENP-B作为用于标准化的目的,一个参考信号将大于将ACA中CENP-A的信号的定量测定的精度方面进行比较更为适当。 CENP-B的氨基末端区域结合在白斑样DNA中的CENP-B框序列的17-bp的基序,和CENP-B的羧基末端区域形成同二聚体。43,44 CENP-B不完全共定位与CENP-A和/或其他CENTRomere-动粒蛋白,但是,与他们密切相关的。45虽然免疫抗CENP-C抗体通常给出了两个分立的点,具有抗CENP-B常表现为一个明亮的酒吧连接两个姐姐的着丝粒。46然而染色在我们的宏观显微镜观察,一些CENP-B信号显然与CENP-A的信号,部分取决于观察的角度和使用的固定液的类型重叠,特别是在早期的有丝分裂阶段(前期,前中期比晚期中期),也(数据未显示)。与此相反,在CENP-A的信号的定量IIF测定中,参考信号蛋白质定位不应被消耗和/或CENP-一种公平分析的功能障碍的影响,虽然大多数着丝粒动粒蛋白的定位是依赖于在着丝粒CENP-A定位。47,48 CENP-A-独立动粒组件更换CENP的DNA结合区成立-C和CENP-T与招募这些蛋白异位的位点的替代目标染色体域。49,50此外,最近的工作表明,内着丝点组件CENP-C和并行CENP-T行为招募KMN网络着丝粒51-54此外,西野等人建议,CENP-TWSX复杂的形式独特的核状结构,产生与DNA的接触,延长“组蛋白密码”超越规范的核小体蛋白。55由于CENP-的着丝粒定位C是依赖于CENP-A的着丝粒定位,47,48 CENP-TWSX或特别CENP-T可能是另一种蛋白候选(S)提供的参考信号CENP-A的定量测定IIF。然而,对于参考信号的候选人应认真测定前测试,以确定在本地化的着丝粒是否由CENP-A的消耗和/或功能障碍的影响。类似的考虑应采取其它着丝粒动粒蛋白的定量IIF分析:参考信号蛋白质定位不应被公平分析目标蛋白的耗尽和/或功能障碍的影响。在以前的研究中,我们使用ACA作为其他中央外着丝粒蛋白质的定量IIF测定的参考信号。24 ACA可能比单CENP-B,为位置控制的更合适的选择,以及一个基准信号,如果ACA信号不会受到与CENP-B中的靶蛋白的耗尽和/或靶蛋白的功能异常,但共定位如上所述较差。

博多尔 。报道称,着丝粒CENP-A水平受大规模行动, 着丝粒CENP-A的量成正比细胞含量变化的调控。56他们还发现CENP-A表达的瞬时感应导致了迅速增长着丝粒CENP-A级。相反地,我们与CA-UTR的siRNA(5'和3'非编码区的siRNA的混合物; 表1)pTRM4表达载体的共转染后观察到的与着丝粒本地化,Flag标记CENP-A的WT大细胞群体(数据未示出);这一人群比仅用pTRM4表达载体转染后看到大。外源性Flag标记CENP-A蛋白的水平,其表达被pTRM4驱动时,是大小(10至25倍)比内源性CENP-A的较高的约1.0至1.4的订单(未示出数据)。据推测,高于特定阈值外源性CENP-A WT的表达可以其应有的着丝粒的定位产生不利影响。

在本协议,固定是维持细胞结构和环境状况近端尽可能天然状态的关键一步。一旦细胞被固定,应该与染色方案进行,以避免INTE的蛋白质的损失休息或细胞的其余部分。然而,定影破坏抗原位点偶尔,以及不同的抗体-抗原组合与一种固定剂不佳工作,但很好地与另一个21由于这种变化,固定剂的选择在很大程度上取决于所感兴趣的蛋白(多个)。固定的时间长度可以通过免疫染色显著影响蛋白质(多个)的检测,以及更短的固定通常是更好地保留抗原性。57因此,在确定染色程序时用于其它着丝粒动粒蛋白的一个新的目标,尤其是不确定定位,或用新的抗体时,应该测试固定和缓冲液的几种方法来找到最佳条件。在本协议,选择流行的固定剂的两个类:醛固定剂(方案2)和有机溶剂(协议3和4)。所述固定剂的纯度也是极为重要的。在协议4,4%山羊血清用于especiaLLY阻断细胞表面上的抗体受体,以减少非特异性背景。57通常,血清阻断IgG的受体应是从无关的初级抗体和优选来自相同物种作为二次抗体的物种。57

在每一本的协议,第一抗体的选择是在实现成功的免疫染色的最关键的一步。以最大的特异性,纯度,亲和力和亲合力的抗体是期望的。单克隆抗体的一个良好开始浓度通常为1-5微克/毫升。备料多克隆抗体的典型的稀释范围为1:20至1:500 57一个需要确定凭经验第一抗体的适当的浓度,并为每个样品稀释剂。样品应轻轻摇晃,但培养均匀染色过程中不干燥。初级抗体和次级一个的孵育之间充分洗涤ntibody可能需要避免与来自其它物种的免疫球蛋白交叉反应。然而,最佳的洗涤条件,必须根据经验来确定,以避免细胞,尤其是有丝分裂的细胞,其四舍五入并摇动( ,有丝分裂摇断)时58对于成功分离。的损失,二次抗体必须选择结合一级抗体以高亲和力。例如,为了避免与IgG的Fc受体的第二抗体的Fc部分的非特异性结合中,Fb(AB')2片段可以使用而不是整个抗体。57对于许多二次抗体,孵育时间可被最小化,以30分钟在RT以减少非特异性背景。

除了协议5,激光扫描共焦显微镜可以是在检测和分析的局部化并与荧光性质着丝粒动粒蛋白质的功能是有利的。如图材料/ Equipme的列表核苷酸,的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594可能是在本协议中最常用的荧光染料。为了检测样品中的二和/或多个不同的着丝粒动粒蛋白,必须确保用于检测一种蛋白质的抗体不阻止第二蛋白的检测。57在本协议,两个主要的抗体混合并施加与此同时。然而,人们应该分别施加一次或二次抗体一起之前优化每个蛋白的免疫染色条件:如果两种蛋白质都在靠近作为两个丝粒动粒组分的情况下,一个初级抗体可在结构上防止的结合第二初级抗体。多个信号检测的另一个问题是光谱重叠的问题:在防止从一种染料“泄漏”的信号到另一个的光谱通道的难度。这个问题将成为惯例更加困难人干涉滤光器设置为解决作为染料的数量增加,或者如果样品含有overenhanced信号( 例如 ,在目前的研究ACA或抗Flag信号),包括自体荧光的干扰。自体荧光的故障诊断已在其它研究中被进行。57,59,60在本研究中,在每个信道使用单标签控制优化荧光过滤器集是在大多数情况下,以避免这些问题(见下文)就足够了。

在每一本的协议,适当的控制是必不可少的。免疫开始前,每一个新的主要抗体应定性。该抗体的特异性应通过Western印迹分析,证实如果适用。此外,应取得确认该染色不被非特异性结合到细胞表面引起的,并应通过使用连续稀释来确定一个特定的初级抗体的最佳工作浓度( 结合曲线应制定)。阴性对照( 没有来自染色过程中的第一抗体的)应被包括在内。阴性对照的另一种选择是正常的IgG从第一抗体同种的置换。为了检测多个标签的,必须准备控制无二次抗体(背景对照),以及单标签控制,以避免光谱重叠的工件( ,渗透,交叉,串扰,或如上述染料“泄露” )。一个可以通过使用正确的信号的“错误”的过滤器进行比较的信号,使用这些比例来计算除去所有的“泄漏”,并且计算实际分布和/或荧光标记的共定位量化“泄漏”的分数。60背景控制应独立与每个通道设置信号增益的限制进行检查和偏移量是ADAPTED为最终成像。将用于获得多标签样本的图像的所有信道必须进行独立的背景校正,因为自体荧光的每个通道中的水平差异很大。的“泄漏”控件如上所述,需要确定每个信道信号的增益可能的量而没有检测“泄漏”到相邻通道60

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院资助GM68418的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamin 2000 Life Technologies/Invitrogen 11668 transfection reagent I
Lipofectamin RNAiMAX Life Technologies/Invitrogen 13778 transfection reagent II
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water 
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)  Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm) 
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well polystyrene plate 
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
PAP PEN  Binding Site AD100.1 Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining)
Paclitaxel (Taxol) SIGMA-SLDRICH T7402 Taxol for mitotic cell analysis
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) Enzo Life Sciences BML-T120 TN16 for mitotic cell analysis
BSA (bovine serum albumin) SIGMA-SLDRICH A7906 Blocking reagent
Triton X-100 SIGMA-SLDRICH T8787 Detergent for permeabilization
Paraformaldehyde SIGMA-SLDRICH P6148 Fixation reagant
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides 
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-CENP-B antibody  abcam ab25734 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-centromere antibody (ACA) Fitzgerald Industries International, Inc. 90C-CS1058 Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antibody Bethyl Laboratories BL1112 (A400-007A) Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antibody BD 612142 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I antibody N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 antibody Novus Biologicals NBP1-89223 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody Novus Biologicals / GeneTex NB 100-338 / GTX70268 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody GeneTex GTX110735 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 antibody abcam ab46826 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F3165 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F7425 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A antibody N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody Cell Signaling 4397 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody Chemicon MAB374 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11001 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11012 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Skim milk
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope  Leica motorized fluorescence microscope 
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X oil immersion lens
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X oil immersion lens
Leica EL6000 compact light source Leica External compact light source for fluorescent excitation
ORCA-R2 Digital CCD camera  Hamamatsu C10600-10B digital CCD camera 
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001/11836170001 Protease inhibitor cocktail tablets
PlusOne 2-D Quant Kit Amersham Biosciences 80-6483-56 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS)
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Immobilon-FL EMD Millipore IPFL00010 PVDF membrane for transferring
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG LI-COR Biosciences 926-32210 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-32221 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 Fisher Scientific PI35507 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649 Fisher Scientific PI35565 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz SC-2005 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz SC-2004 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software  Improvision/PerkinElmer Software A
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer Software B2
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33996-185 Microtip for sonication
Odyssey CLx Infrared imaging System  LI-COR Biosciences Infrared imaging system for immunoblot detection
Image Studio Analysis Software Ver 4.0  LI-COR Biosciences Software C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System  Bio-Rad Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Quantity One 1-D analysis software  Bio-Rad Software D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate

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References

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内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白
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Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. J. Vis. Exp. (109), e53732, doi:10.3791/53732 (2016).More

Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. J. Vis. Exp. (109), e53732, doi:10.3791/53732 (2016).

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