Introduction
في مجال البروتينات، وقد اعتمدت على نطاق واسع مرشح بمساعدة إعداد العينات (FASP) لقدرته على تقليل كمية من المواد ابتداء، والحد من القطع الأثرية وإعداد العينات، وتحقيق أقصى قدر من الإنتاجية عينة 1. ومع ذلك، فإن مثل هذا الأسلوب حتى باتت وكسب الجر مجال glycomics. تطوير الإنتاجية العالية، وهناك حاجة سير العمل الكمية نظرا للدور لا يتجزأ من بالغليكوزيل في الدفاع البيولوجي وتعديل من قبل السرطان أو أمراض 2،3. في الثدييات، وتتكون -glycans N من تكرار وحدة السكريد (hexoses (عرافة)، hexosamines (HexNac)، والأحماض اللعابي (NeuAc)، وfucoses (الجبهة المتحدة))، التي تزين بنية الأساسية (عرافة 3 HexNac 2) 4 ملزمة تساهميا لالهليونين. على الرغم من أن glycospace هو كبير إلى حد كبير عندما تحسب أيزومرات (> 10 12)، أنها صغيرة جدا على أساس تكوين والأوزان الجزيئية تتراوح عادة من 1،000-8،000 دا 5 </ سوب>. التجانس التركيبي للطبقة وhydrophilicity من glycans تحديات فريدة لتنقية وفصل، ومطياف الكتلة (MS) سير العمل 6.
تقليديا، يتم هضمها N -glycans من البروتينات أو الببتيدات التي كتبها peptide- N -glycosidase F (PNGase F) ومن ثم إثراء كتين تقارب اللوني 7، استولت عليها الخرز هيدرازيد 8، أو تنقيته عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE) 9،10. في حين أن هذه الأساليب كلها فعالة للغاية، وتقديم خطوات إضافية لتحلية والحد من عدد من عينات معالجة في وقت واحد. على مدى العقد الماضي، وقد تم اقتراح عدد من منصات عالية الإنتاجية لglycomics. كيم وآخرون نشرت طريقة شبه الآلي باستخدام تعمل فراغ، لوحة SPE 96-جيدا 11. بدلا من ذلك، تم تطوير وسيلة تقارب فلتر (N--glyco FASP) من قبل مجموعة مان، الذي يتطلب اشتقاق الأولي للفايlter مع مزيج مركب من يكتينس 12. وأخيرا، اقترح الفريق توماس أوتس طريقة شبه الكمية، وتصفية بمساعدة N الفصل -Glycan (الأنياب)، التي استغلت حجم التكوين الضيق للglycospace 13. الاعتماد على الوزن الجزيئي قطع المرشحات، وجرفت المياه الملوثة صغيرة أولا أن تضيع ثم تم هضم -glycans N ومزال. تبقى البروتينات Deglycosylated على مرشح في هذا البروتوكول، ويمكن أن تخضع لFASP في الخط.
تحديد وتقدير من glycans بواسطة تأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) MS يتطلب خارج خط فصل للقرار (جزئي) من سداسي واشتقاق للكشف عن الأنواع المنخفضة للوفيرة. وضع العلامات في الفردانية عندما تطبيع مع استراتيجية علامات هيدرازيد غليكان يمنح التوافق مع اللوني العكسية مرحلة السائل (RPLC) 14،15. 4-phenethyl-benzohydrazide (P2PGN) العلامة مسعور تتوسط في hydrophilicity من glycans، ENHancing التأين التي، في المتوسط، أربعة أضعاف (16). على الرغم من التقنيات الأخرى، مثل permethylation 17 أو أمين رد الفعل كيمياء علامات 18، توفر مزايا مماثلة، في رد فعل هيدرازيد، وكان رد فعل glycans 1: 1 stoichiometrically في الظروف السهلة. ويتحقق الكمي النسبي عن طريق تحليل جنبا إلى جنب من عينات derivatized مع الأم (NAT) أو 13 C 6 تسميات مستقر النظائر (سيل).
الأسلوب التالي تطور الأنياب لتطبيقات البلازما والأزواج إلى العلامة P2GPN مسعور لتقدير نسبي دقيقة. وعلاوة على ذلك، تم تصميمه لأداء البروتينات طلقة بندقية، والتنميط نزع الأميد، وglycomics الكمية على قسامة واحدة من العينة، دون المساس بسلامة التحليلات.
Protocol
1. البروتين والبروتين السكري تمسخ والألكلة
- للتحضير القياسية، تحميل 2.5 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام حل / ميكرولتر من بروتين سكري (على سبيل المثال فتوين أو ريبونوكلياز B) على 30 كيلو دالتون أو 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي (MW) قطع التصفية.
- لعينات البلازما البيولوجية، والتحقق من تركيز البروتين من الأحماض القياسية برادفورد 19 أو bicinchoninic 20 (BCA) بروتين الفحص. تمييع البلازما، وإذا لزم الأمر، مع 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) في H 2 O (PNGase دايجست الواق) في الرقم الهيدروجيني من ~ 7 لاحتواء بين 10-100 ملغ / مل البروتين الكلي. تحميل 2.5 ميكرولتر البلازما (25-250 البروتين ميكروغرام) على مرشح.
ملاحظة: فقط تم اختبار هذا البروتوكول على البلازما من عينات الدم التي تم جمعها في وجود ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
- لعينات البلازما البيولوجية، والتحقق من تركيز البروتين من الأحماض القياسية برادفورد 19 أو bicinchoninic 20 (BCA) بروتين الفحص. تمييع البلازما، وإذا لزم الأمر، مع 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) في H 2 O (PNGase دايجست الواق) في الرقم الهيدروجيني من ~ 7 لاحتواء بين 10-100 ملغ / مل البروتين الكلي. تحميل 2.5 ميكرولتر البلازما (25-250 البروتين ميكروغرام) على مرشح.
- إضافة 2 ميكرولتر من 1 M Dithiothreitol الحل (DTT) على كل عينة في التصفية.
- تمييع العينة مع 200 ميكرولتر PNGase هضم العازلة.
- غطاء الأنبوب فلتر عينة وبخفة دوامة، والحرص على عدم تعكير صفو مرشح من مقعدها. احتضان العينة على 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتفسد البروتينات وبروتينات سكرية.
- ليؤلكل العينات، إضافة 50 ميكرولتر 1 م Iodoacetamide، لإعطاء تركيز النهائي من ~ 200 ملم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
ملاحظة: إذا لم يتم المطلوب تحليل البروتينات، خطوة 1.5 قد يتم تخطي. - تركيز بروتين سكري التشويه والتحريف على مرشح من قبل الطرد المركزي العينات في 14000 x ج لمدة 40 دقيقة. تتدفق من خلال تجاهل.
2. N -linked غليكان الأنزيمية الهضم
- غسل العينة مع 100 ميكرولتر PNGase الهضم العازلة. تركيز بروتين سكري على مرشح في 14000 x ج لمدة 20 دقيقة، وتتدفق من خلال تجاهل.
- كرر الخطوة غسل والتركيز مرتين، ليصبح المجموع ثلاث مرات، مما أسفر عن التركيز في حجم القتلى مرشح (~ 5 ميكرولتر). تجاهل كلتتدفق من خلال.
- تجاهل قارورة جمع مرة يغسل كاملة. جمع كل eluents ويغسل في المستقبل في قارورة جمع جديدة.
ملاحظة: PNGase هضم عازلة في H 2 O 18 يمكن استخدامها أثناء الخطوة الهضم PNGase F لوضع العلامات النظائر المستقرة من مواقع الهليونين دي الغليكوزيلاتي، والتي أصبحت deamidated كيميائيا.
- إضافة 2 ميكرولتر خالية من الجلسرين PNGase F (75،000 وحدة س / مل) لتصفية بعد نقل إلى قارورة جمع جديدة. إضافة 98 ميكرولتر من PNGase هضم عازلة، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر، وبلطف ماصة صعودا وهبوطا على مرشح لخلط. إنزيمي هضم glycans في ظل الظروف خطوات 2.2.1، 2.2.2، 2.2.3 أو.
ملاحظة: يمكن استخدام ثلاثة أساليب لdeglycosylation من البروتينات. للتحليل فقط glycomics (لا البروتينات)، وأوصى حضانة طويلة في الخطوة 2.2.1. لglycomics والبروتينات البحوث، على بعد خطوات 2.2.2 و 2.2.3 سوف تنتج الببتيدات عالية الجودة مع الحد الأدنى من غير SP-نزع الأميد ecific.- Glycomics فقط بروتوكول الهضم (18hr): احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة ليلتصق إنزيمي كل -glycans N.
- ارتفاع في بروتوكول الهضم (SPI): احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. العمل بسرعة، وإزالة عينات وارتفاع في 2 ميكرولتر إضافية خالية من الجلسرين PNGase F (75،000 وحدة س / مل). بخفة دوامة العينات لمدة 1-2 ثانية إلى المزيج. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
- بروتوكول الميكروويف الهضم (MD): مكان العينات في رف أنبوب microcentrifuge العائمة. عينات تطفو في كوب 1 لتر مليئة 1 لتر من الماء (DI) منزوع الأيونات. ضع الكأس في وسط فرن الموجات الدقيقة (950 واط) مع لوحة الدورية. ميكروويف في 60٪ من الطاقة (570 W) لمدة 5 دقائق. لتبرد، وإزالة عينات وعقد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ثم الميكروويف لمدة 5 دقائق إضافية في السلطة 60٪.
سوف تحتاج إلى تعديل على أساس انتاج الطاقة القصوى من الميكروويف إعدادات الطاقة ميكروويف: ملاحظة.ينبغي أن تعقد متوسط القوة المستمر بين النماذج.
3. شطف ن -glycans
- أزل glycans بواسطة الطرد المركزي في العينة 14000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميكرولتر من PNGase هضم عازلة لمرشح وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. جمع الغسيل التي تحتوي على أي المتبقية N -linked غليكان، في نفس القارورة جمع كما شاطف. كرر مرتين. إزالة الفلتر ووضعه في قارورة جمع جديدة.
- احتضان عينات غليكان في الفريزر -80 درجة مئوية حتى المجمدة (30-60 دقيقة). الجاف على الانتهاء، في درجة حرارة الغرفة، في المكثف فراغ (4-6 ساعة).
ملاحظة: لا يمكن تخزين -glycans في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل اشتقاق.
4. البروتين FASP الهضم
ملاحظة: إذا لم يتم المطلوب البروتينات أو تحليل الموقع نزع الأميد، المادة 4 من البروتوكول قد يتم تخطي.
- شطف رانه تصفية، التي تحتوي على الببتيدات deamidated، مع 400 ميكرولتر من العازلة 8 M اليوريا. تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط. التركيز على مرشح في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. تجاهل كل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 4.1 مرتين إضافية، ليصبح المجموع ثلاثة يغسل العازلة اليوريا.
- شطف التصفية، التي تحتوي على الببتيدات deamidated، مع 400 ميكرولتر من 2 M اليوريا و 10 ملي CaCl 2 العازلة (التربسين هضم عازلة). تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط. التركيز على مرشح في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. تجاهل كل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 4.1 مرتين إضافية، ليصبح المجموع ثلاثة التربسين هضم يغسل العازلة.
- تجاهل قارورة جمع مرة يغسل كاملة. جمع كل eluents ويغسل في المستقبل في قارورة جمع جديدة.
- إضافة 50 ميكرولتر الخنازير التربسين تعديل في 1:50 أو 1: 5 التربسين: البروتين (ث / ث) نسبة لاكتشاف أو البروتينات الكمية التجارب، على التوالي.تتويج القارورة جمع وبخفة دوامة لخلط.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. العمل بسرعة، وإزالة عينات وارتفاع في 50 ميكرولتر إضافية من التربسين في 1:50 أو 1: نسبة البروتين: التربسين 5. بخفة دوامة العينات لمدة 1-2 ثانية إلى المزيج. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
- أزل الببتيدات التي تدور في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة.
- شطف الببتيدات المتبقية من تصفية مع حمض الفورميك 400 ميكرولتر 1٪ و 0.001٪ Zwittergent 3-16 (عازلة إخماد). أزل من مرشح من قبل الغزل في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة.
- قياس تركيز الببتيد في عينات من برادفورد 19 أو BCA مقايسة 20.
- احتضان عينات الببتيد في الفريزر -80 درجة مئوية حتى المجمدة (30-60 دقيقة). الجاف على الانتهاء، في درجة حرارة الغرفة، في المكثف فراغ (4-6 ساعة).
قد يتم تخزين المجفف الببتيدات في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر: ملاحظة. - و resuspend البروتينات زيتية قبيل LIQUIد اللوني الكتلة الطيفي (MS-LC) تحليل في 2٪ الأسيتونتريل، 98٪ H 2 O، وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪ (المرحلة المحمول أ) إلى التركيز المطلوب. تركيزات الببتيد زيتية من 2.5 ميكرولتر مجموعة البلازما 100-300 نانوغرام / ميكرولتر.
5. اشتقاق من N -linked Glycans مع مسعور هيدرازيد الكلمات
- إعادة المجففة الثقيلة (سيل) أو ضوء (NAT) الكواشف P2GPN في 1 مل من 75:25 MeOH: حمض الخليك (حل اشتقاق)، لتركيز النهائي من 0.25 ملغ / مل. والكواشف يستغرق فترة تصل الى 10 دقيقة لإذابة تماما. على نطاق واسع دوامة لضمان ذوبان كامل.
ملاحظة: في حال تم استخدام هذا البروتوكول اشتقاق مع -glycans N المعيار، مقابل glycans النقاء، ونسبة المولي من P2GPN: غليكان يجب أن يكون حوالي (ولا أقل) من 17: 1. - العلامة المجففة N -glycans مع 200 ميكرولتر (50 ميكروغرام) من سيل أو NAT P2GPN كاشف. ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend glycans المجففة. دوامة ساmples ثم تدور باستمرار عينات ل~ 5 ثانية على مقعد بين كبار الطرد المركزي.
- الرد على glycans مع كاشف لمدة 3 ساعة على 56 درجة مئوية.
- التحرك فورا glycans من الحاضنة إلى المكثف فراغ. الجاف على الانتهاء في 55 ° C (3-5 ساعة).
ملاحظة: هذه الخطوة يروي رد فعل اشتقاق. يجب أن يكون عينة يجف تماما لمنع انتقال التفاعل في الخطوات اللاحقة.
قد يتم تخزين العينات المجففة، الموسومة في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر: ملاحظة. - المعلمة و resuspend -glycans N في 25-50 ميكرولتر من H 2 O فقط قبل التحليل LC-MS. ماصة صعودا وهبوطا لضمان N -glycans هي بالفاعلات تماما.
ملاحظة: حجم لإعادة تعليق يعتمد على تركيز الانطلاق من بروتين سكري، الذي يمكن تقدير من تركيز البروتين البداية. ومع ذلك، فإن مجموعة تختلف حسب نوع العينة ويجب أن يكون الأمثل بشكل فردي. - عينات الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant، والحرص على عدم السماح لطرف ماصة لمس الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
ملاحظة: العلامة الزائدة قد لا تكون مرئية للعين، ولكن سيتم تخفيض بواسطة الطرد المركزي. - الجمع بين زوج من عينات NAT وسيل، إذا رغبت في ذلك لتقدير نسبي في نسبة 1: 1 لتحليل جنبا إلى جنب.
6. فائق الضغط اللوني السائل وتحليل الطيف الكتلي
ملاحظة: LC وMS الشروط الموضحة لسهلة NLC-1000 وحقل العليا س Exactive، على التوالي، والأمثل في المنزل لتحليل البروتينات وتحليل غليكان 21. يمكن تكييف هذه الظروف لأنظمة LC أخرى فائقة pressure- أو نانو وغيرها من الطيف كتلة حل السلطة عالية ولكنها قد تتطلب تعديلات طفيفة. استخدام عالية حل الطيفي السلطة ضروري لتحديد غليكان وتحليل نزع الأميد 22،23.
ملاحظة: خطوات 6،1-6،3 يمكن أن تكون الصورةkipped إذا تم استخدام أحد المناسب عكس المرحلة اللوني أو فخ التجاري التفاعل ماء والعمود.
- توليف فريت في شعري الرقم 100 ميكرومتر وفقا لميرينغ وآخرون. (24) لاستخدامها في فخ.
- حزمة فخ تحت الضغط مع 2.6 ميكرومتر، 100 أ، ج 18 مواد التعبئة والتغليف وقطع لطول 5 سم.
- حزمة 75 ميكرومتر العمود باعث معرف تحت الضغط مع 2.6 ميكرومتر، 100 أ، ج 18 مواد التعبئة والتغليف وقطع لطول 30 سم.
- إعداد طريقتين مختلفتين LC-MS لالبروتينات (6.4.1) وglycomics (6.4.2) سير العمل.
ملاحظة: يمكن تشغيل البروتين وعينات غليكان على نفس الإعداد فخ / عمود في أي أمر.- لتحليل البروتين، وضخ ~ 400 نانوغرام من البروتين على العمود في مرحلة الأجهزة المحمولة (MPA). تشغيل العينة على 300 نيكولا لانغ / دقيقة، وفقا للجدول 1، مع 1 ميكرولتر قبل العمود موازنة (500 بار) و 5 ميكرولتر العمود التحليلي موازنة(500 بار). تأين البروتينات وفقا للشروط MS الواردة في الجدول 2.
- لتحليل غليكان، حقن 5 ميكرولتر من معلق، الموسومة P2GPN NAT / سيل عينات متساوي المولية على العمود. تشغيل العينة على 300 نيكولا لانغ / دقيقة، وفقا للجدول 3، مع 2 ميكرولتر قبل العمود موازنة (500 بار) و 5 ميكرولتر تحليلية موازنة عمود (500 بار). تأيين glycans في ظل الظروف MS الواردة في الجدول (4).
| مرة | ٪ MPA | ٪ MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
تم تنفيذ الجدول 1. شروط LC للتحليل البروتين. وشطف التدرج مع الطور المتحرك ب (ام. بي، 98٪ الأسيتونتريل، 2٪ H 2 O، 0.1٪ حمض الفورميك) إلى أزل الببتيدات لالبروتينات طلقة بندقية، التي تعتمد على الاستحواذ البيانات والتجارب MS.
| MS 1 معلمات | |
| المدى كتلة (ث) | 375-1500 |
| قرار | 120000 |
| AGC | 1 × 10 6 |
| ماكس التأين الوقت | 30 |
| S-عدسة FR مستوى | 55 |
| الشعرية تيمالكمبيوتر) | 300 |
| رذاذ الجهد | 1.75 |
| MS 2 معلمات | |
| اكتساب نوع | TOP20 |
| قرار | 15000 |
| AGC | 1 × 10 5 |
| ماكس التأين الوقت | 30 |
| نسبة Underfill | 2٪ |
| العزلة النافذة (ث) | 1.4 |
| استبعاد تهمة الدولة | +1 |
| تطبيع اصطدام الطاقة | 27 |
| الوقت الاستبعاد (ق) | 20 |
الجدول 2: شروط MS لتحليل البروتين المعلمات من أجل تأين بالإرذاذ الإلكتروني، MS 1 الاستحواذ، وMS 2 الاستحواذ في صك orbitrap باستخدام dissociatio للطاقة أعلى.يتم إعطاء ن (HCD).
| مرة | ٪ MPA | ٪ MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
الجدول 3: شروط LC للتحليل غليكان أجري شطف الانحدار إلى أزل هيدرازيد الموسومة N -glycans لتحليل MS.
| MS 1 معلمات | |
| المدى كتلة (ث) | 600-1900 |
| قرار | 60000 |
| AGC | 5 × 10 5 |
| ماكس التأين الوقت | 64 |
| S-عدسة FR مستوى | 65 |
| شعري درجة الحرارة (° C) | 325 |
| رذاذ الجهد | 1.75 |
| MS 2 معلمات | |
| اكتساب نوع | Top12 |
| قرار | 15000 |
| AGC | 5 × 10 4 |
| ماكس التأين الوقت | 100 |
| نسبة Underfill | 1٪ |
| العزلة النافذة (ث) | 1.4 |
| ثابت قداس الأولى 125 | |
| صعدت تطبيع اصطدام الطاقة | 10/20/30 |
| استبعاد الوقت (ثانية) | 15 |
الجدول 4: شروط MS لهيدرازيد الموسومة N تحليل -glycan المعلمات من أجل تأين بالإرذاذ الإلكتروني، الذي يتم إعطاء MS 1 الاستحواذ، وMS 2 الاستحواذ في صك orbitrap باستخدام التفكك للطاقة أعلى (HCD).
7. البروتيوميات وتحليل نزع الأميد
- تحديد البروتينات / الببتيدات استخدام أدوات البحث المعلوماتية الحيوية القياسية.
ملاحظة: تم تصميم بروتوكول التحليل التالي باستخدام قواعد البيانات السويسري بروت / TrEMBL في UniprotKB والبحث عبر SEQUEST في بروتيوم مكتشف 1.4 البرنامج، ومع ذلك، فإن البروتوكول يمكن ترجمتها مباشرة إلى أي محرك بحث البروتين والتسجيل باستخدام برنامج واجهة المستخدم الرسومية. جميع الأوامر الواردة أدناه يمكن الوصول إليها في واجهات البرامج من خلال القوائم المنسدلة.- <li> أنشئ أو تحميل كائن حي المناسب تسلسل البروتين قاعدة البيانات من بيانات الجينوم أو قواعد البيانات بروتيوم المتاحة كما وصفها Apweiler وآخرون. 25
ملاحظة: تشمل قواعد البيانات بروتيوم المشتركة السويسري بروت، TrEMBL، وNCBI، ولكن قد تكون بنيت من البيانات في المنزل أيضا. - في داخل البرنامج، واختيار محرك البحث في قاعدة البيانات والمعلمات مختارة وفقا لنوعية البيانات التي حصل عليها وrigorousness للبحث المطلوب، كما وصفها بيركنز وآخرون. لالتميمة 26 أو المهندس وآخرون لSEQUEST 27.
- للحصول على بيانات عالية الدقة الشامل، تعيين المعلمات للبحث في البرنامج على النحو التالي: ماكس 2 غاب عن الانشقاقات، 5 جزء في المليون السلائف التسامح الشامل، و0.02 دا جزء التسامح الشامل (لالأمثل كشف دقيق نزع الأميد 22) وتشمل التعديلات الببتيد زيتية التالية : "carbamidomethyl (C)" تعديل ثابت و"نزع الأميد (N / Q)" و "ثورidation (M) "التعديلات الديناميكية. إذا كنت تستخدم 18 يا الهضم وضع العلامات، وتشمل" نزع الأميد 18 O (1) "باعتبارها تعديل ديناميكية إضافية.
- البحث باستخدام محرك المختارة، البيانات الببتيد الخام مقابل قاعدة بيانات البروتين (7.1.1).
ملاحظة: يجب التحمل الجماعي يكون مناسبا لالأداة المستخدمة ويست منخفضة بشكل تعسفي.
ملاحظة: اكتمال وظيفة البحث تلقائيا من قبل البرنامج باستخدام محرك البحث مختلف خوارزميات محددة. ويعمل الخوارزمية راووق (التميمة)، SEQUEST، أو مجموعات أخرى من خوارزميات لتحديد البروتينات من الببتيدات وليسجل صحة الضربات. وتغطي مزيد من المعلومات حول الأدوات المتاحة في مراجعة من غونزاليس Galarza آخرون 28،29. اعتمادا على البرنامج، قد تحتاج إلى اختيارها وفقا للسلطة التقديرية للمستخدم المعلمات بحث إضافية.
- تصدير الببتيدات التي تم تحديدها لكرأيشن اليدوي وفورثتحليل إيه.
8. الكميات النسبية غليكان
ملاحظة: تم الانتهاء من تحديد وتقدير التالية باستخدام برنامج XCalibur. ومع ذلك، أي البرنامج الذي يحلل البيانات الخام وتلقائيا يدمج قد تكون بديلا قمم الكروماتوغرافي.
- إنشاء قائمة النظرية من المؤلفات غليكان من التوليفات الممكنة بيولوجيا hexoses، ديوكسي-hexoses، hexosamines والأحماض اللعابي، وغيرها من ساccharides. لهذا الغرض، وقد تم نشر قاعدة بيانات غليكان الإنسان ووكر وآخرون. 15، ويمكن استخدامه كما هو. لقواعد البيانات النظرية، يجب فرض قيود البيولوجية أنواع محددة على مساحة اندماجي، ويتم وصف هذه القواعد Kronewitter وآخرون. 31.
- حساب الجماهير monoisotopic غليكان (M) من الكتل الذرية للكل تكوين للدول تهمة بروتون + 1-3. تعديل الجماهير monoisotopic لتشمل إضافة NAT (254،14191 غ / مول) أو سيل (260.162042 غ / مول) العلامة P2GPN.
- فتح برنامج "الإعداد تجهيز" من وجهة النظر خارطة الطريق في XCalibur. إنشاء طريقة معالجة كما هو موضح بالضبط في المواد التكميلية من ووكر وآخرون. 15 استخدام قائمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.2 يحتوي على الجماهير monoisotopic النظرية ل[M + H] 1+، [M + 2H] 2+، و [ M + 3H] 3+ الأنواع.
ملاحظة: لتأكيد هوية غليكان أبعد دقيقةكتلة، لNAT / سيل duplexed أشواط، فتأكد NAT وسيل N أزواج -glycan المشارك أزل مع الوقت الاحتفاظ نفسه. نوعيا، عبر التحقق من صحة تحديد الهوية مع أطياف MS 2، والذي يجب أن يحتوي على قمم تابعة لأوكسونيوم أيون سلسلة 32. - تصدير، استخراج اللوني ايون متكامل (XIC) المناطق إلى Excel للحصول على الكميات المتوفرة من سيل وNAT كما هو موضح بالضبط في المواد التكميلية من ووكر وآخرون. 15
- في Excel، برنامج الخلايا في عمود جديد لحساب تصحيح الوزن الجزيئي التداخل عن طريق تعديل وفرة سيل وفقا للمعادلة التي نشرتها ووكر وآخرون 1 5:
،
حيث A هو ذروة monoisotopic والتداخل النظائر النظري،
قد يكون حساب مستقل في تكوينها. - في العمود الثاني، برنامج الخلايا لتطبيع القنوات NAT وسيل باستخدام معادلة لمجموع عامل غليكان تطبيع (TGNF)، في الطيف، كما وصفها ووكر وآخرون 1 5:
،
حيث N هو عدد N -glycans فوق الحد الكمي. - في عمود جديد، برنامج الخلايا لتأخذ نسبة من سيل: glycans NAT (أو العكس بالعكس) لحساب التغير أضعاف في تركيز بين العينتين.
، 
قد يكون حساب مستقل في تكوينها. 
، Representative Results
الشكل 1: يتم إعطاء مخطط طريقة الأنياب-P2GPN علامات مسعور جانب (الطريقة أ) لالبروتينات وglycomics جنبا إلى جنب تحليل الخطوات التي تختلف بين تجهيز وجنبا إلى جنب glycomics glycomics فقط وتحليل البروتينات، مع تحديد المواقع بالغليكوزيل، وتسليط الضوء عليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وفي خط البروتينات وglycomics، تم التحقق القائم على تصفية P2GPN مسعور طريقة وضع علامات (الطريقة أ) لتحديد الهوية، والكميات، والوزن الجزيئي التحيز باستخدام الدجاجة المجمعة عينات البلازما (الشكل 1). لمجرد تجارب glycomics، بين المقارنات في وفرة N -glycans المستخرجة من طريقةأ إلى carbograph SPE (الذهب القياسية، الطريقة ب) قدمت (الشكل 2). لم تكن هناك اختلافات كبيرة في وفرة glycans بين الطريقتين. وجرى تقييم للالتباين داخل أيضا عن طريق قياس سيل: NAT نسبة glycans استخراج بنفس الطريقة. كان سجل 2 -distributions كل أساليب التمويه، تركزت على الصفر، ولا تختلف كثيرا (الشكل 3A-B). ويتراوح الوزن الجزيئي بين اثنين من بروتوكولات المتراكبة تماما، مما يشير إلى أن المرشح لا تميز N -glycans على أساس النطاق الوزن الجزيئي وhydrophilicity (الشكل 4).
الشكل 2: مزيج متساوي المولية من NAT وسيل N -glycans المستخرجة من الطريقة أ أو الطريقة ب أعد من 2.5 ميكرولتر من البلازما الدجاجة (N = 4) وكانت عينات الشرج.yzed التي كتبها UPLC-MS وفقا لمعايير أوصى المقترح في القسم 6. والكميات المتوفرة لكل غليكان، في كل قناة NAT / سيل، وحسبت من خلال دمج المنطقة تحت اللوني ايون المستخرج (MMA = 3 جزء في المليون)، وتصحيح لالجزيئية الوزن التداخل، وضبط من قبل TGNF. وتظهر هذه النسب مع أخطائهم القياسية. وكانت الطريقة للتطبيق غير -glycans لا تختلف كثيرا (P> 0.05): وفرة من الطريقة ب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: داخل التغير في (أ) الطريقة أ (N = 133) أو (ب) الطريقة ب (N = 123) ومقارنة الاستراتيجيات. NAT وسيل خليط متساوي المولية من -glycans N، من نفس نظام استخراج ، وقد تم تحليل أكثر من ثلاثة مكررات التقنية. تركزت سجل 2 -distributions على الصفر، وكانت لا تختلف كثيرا بين سير العمل اثنين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتمت مقارنة يتراوح الوزن الجزيئي للglycans من كل استراتيجية: الرقم 4. أسفرت سير العمل اثنين من glycans تمتد على نفس النطاق الوزن الجزيئي. N -glycans الكشف في بروتوكول واحد مقابل سقط الآخر فقط أعلى من الحد من الكشف (1 × 10 5 فرة) ولا تعكس تحيز منهجي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
ضمن الصفحات = "1"> الإبقاء على البروتينات deglycosylated بواسطة عامل تصفية الوزن الجزيئي تمكين في خط بروتيوم واسعة التحليل والموقع بالغليكوزيل تحديد الهوية. وتمت مقارنة بروتوكولات متعددة لتنقية جنبا إلى جنب من glycans والبروتينات لإعداد FASP التقليدي دون deglycosylation (الجدول 5). أدى لدينا نموذجي 18 ساعة مرشح القائمة على PNGase F الهضم، تليها FASP التربسين هضم (بروتوكول الأمراض المنقولة جنسيا) في مستويات عالية من نزع الأميد غير محددة، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد glycosites. لذلك، تم استكشاف طريقة الاستفادة من فترة حضانة أقصر عند درجة حرارة مرتفعة (50 درجة مئوية)، وخطوة ارتفاع في PNGase F (بروتوكول SPI) كبديل، جنبا إلى جنب مع بروتوكول الميكروويف الهضم (بروتوكول MD)، للحد من عدم نزع الأميد محددة. كانت glycans لوحظت في أساليب الهضم الجديدة لا تختلف كثيرا في التراكيب أو الكميات المتوفرة من القياسية 18 ساعة، 37 ° C مرشح PNGase F هضم (
| البروتينات | الببتيدات | الببتيدات Deamidated | Glycosites | بروتينات سكرية | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18hr | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
الجدول 5: المقارنة بين البيانات البروتين من التربسين القياسية هضم مقابل قدمت طريقة وضع علامات في خط الأنياب-P2GPN أجريت الاستعدادات مع (+) وبدون (-) PNGase F لتحديد معدلات خلفية نزع الأميد وتقدير غير محدد glycosite معدلات إيجابية كاذبة. وقد تم تحديد البروتينات مع 1٪ معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت)؛ تم تصفيتها الببتيدات على أساس "عالية" الثقة الببتيد في بروتيوم مكتشف 1.4 (ف <0.01)؛ تم identifi glycositesإد على أساس تسلسل فريدة من نوعها تحتوي على نزع الأميد من بالغليكوزيل عزر محفوظ (NXS / T)؛ وحددت بروتينات سكرية كما تحتوي على البروتينات التي تم تحديدها واحد على الأقل glycosite التي تم تحديدها.
وقد وضعت تقصير بروتوكولات لglycans للحد من نزع الأمين في العينات ومقارنة مع 18hr الأنياب PNGase F هضم: الرقم 5. كان متوسط الفروق في الكميات المتوفرة 10٪ و 5٪ للMD (2.2.3) وSPI (2.2.2) البروتوكولات، على التوالي. من 48 glycans التي تم تحديدها، عرض 90٪ أقل من التباين 1.5 أضعاف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
