Introduction
Op het gebied van proteomica, filter geholpen monstervoorbereiding (FASP) is wijd op zijn vermogen om de hoeveelheid uitgangsmateriaal minimaliseren monstervoorbereiding artefacten te verminderen en te maximaliseren monsterdoorvoer 1 aangenomen. Echter dergelijke werkwijze nog ontstaan en grip te krijgen op het gebied van glycomics. Ontwikkeling van high-throughput, zijn kwantitatieve workflows nodig vanwege de integrale rol van glycosylering in biologische verdediging en de modulatie door kanker of ziekten 2,3. Bij zoogdieren worden N-glycanen samengesteld uit zich herhalende saccharide eenheden (hexosen (Hex), hexosamines (HexNAc) siaalzuren (NeuAc) en fucoses (Fuc)), die een kernstructuur versieren (Hex 3 HexNAc 2) 4 covalent gebonden asparagine. Hoewel de glycospace aanzienlijk groot als isomeren worden geteld (> 10 12), is vrij klein op een samenstelling basis en molecuulgewichten gewoonlijk variëren van 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. De samenstelling homogeniteit van de klasse en de hydrofiliciteit van glycanen vormen unieke uitdagingen voor zuivering, scheiding en massaspectrometrie (MS) werkstromen 6.
Traditioneel worden N-glycanen geknipt van eiwitten of peptiden met peptide N -glycosidase F (PNGase F) en vervolgens verrijkt door lectine-affiniteitschromatografie 7, gefotografeerd door hydrazide kralen 8 of gezuiverd door vastefase-extractie (SPE) 9,10. Hoewel deze methoden zijn zeer effectief, ze introduceren extra stappen voor ontzouting en beperken het aantal monsters tegelijkertijd verwerkt. In de afgelopen tien jaar hebben een aantal high-throughput platform voor glycomics voorgesteld. Kim et al. Publiceerde een semi-automatische methode waarbij een vacuümgestuurde, SPE 96-well plaat 11. Als alternatief kan een methode affiniteit-filter (N -glyco-FASP) werd ontwikkeld door de Mann-groep, die de oorspronkelijke derivatisering van de fi vereistefilter met een samenstelling van 12 lectinen. Tenslotte stelt het Thomas-Oates groep een semi-kwantitatieve methode, het filter Geholpen N-glycan Separation (HOEKTANDEN), waarbij de samenstelling smalle afmeting van de glycospace 13 benut. Zich baserend op moleculair gewicht cut-off filters, werden kleine verontreinigingen eerst gewassen te verliezen en daarna werden de N-glycanen verteerd en uitgewassen. Gedeglycosyleerde eiwitten blijven op de filter in dit protocol en kan worden onderworpen aan in-line FASP.
Identificatie en kwantificering van glycanen door electrospray ionisatie (ESI) MS vereist off-line scheidingen voor (gedeeltelijke) oplossing van isomeren en derivatisering voor detectie van lage-voorkomende soort. Etikettering in de individualiteit wanneer normaliseren met glycan hydrazide labels strategie verleent compatibiliteit met reverse-fase-vloeistofchromatografie (RPLC) 14,15. Het 4-fenethyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrofobe tag bemiddelt de hydrofiliciteit van de glycanen, enhancing ionisatie van gemiddeld vier keer 16. Hoewel andere technieken, zoals permethylation 17 of amine-reactieve tagging chemie 18, bieden soortgelijke voordelen, in het hydrazide reactie glycanen omgezet 1: 1 stoichiometrisch in gemakkelijke omstandigheden. Relatieve kwantificering bereikt door tandem analyse van monsters gederivatiseerd met natief (NAT) of 13 C 6 stabiele isotooplabels (SIL).
De volgende methode evolueert HOEKTANDEN voor plasma-toepassingen en koppels naar de P2GPN hydrofobe tag voor nauwkeurige relatieve kwantificering. Bovendien werd ontworpen om jachtgeweer proteomics, deamidering profielen en kwantitatieve glycomics voeren op een enkele portie van het monster, zonder de integriteit van de analyses.
Protocol
1. Eiwit en glycoproteïne Denaturation en Alkylering
- Voor standaard preparaten, belasting 2,5 ui van een 0,1 ug / ul oplossing van glycoproteïne (bijv Fetuin of RNase B) op een 30 kDa of 10 kDa moleculair gewicht (MW) cut-off filter.
- Voor biologische plasma monsters, controleer dan de eiwitconcentratie door een standaard Bradford 19 of bicinchoninezuur 20 (BCA) proteïne test. Verdun het plasma, indien nodig, met 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) in H2O (PNGase Digest Buffer) bij een pH van ~ 7 dat tussen 10-100 mg / ml totaal eiwit. Load 2,5 gl plasma (25-250 ug eiwit) op een filter.
Opmerking: Dit protocol is alleen plasma van bloedmonsters verzameld in aanwezigheid van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) getest.
- Voor biologische plasma monsters, controleer dan de eiwitconcentratie door een standaard Bradford 19 of bicinchoninezuur 20 (BCA) proteïne test. Verdun het plasma, indien nodig, met 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) in H2O (PNGase Digest Buffer) bij een pH van ~ 7 dat tussen 10-100 mg / ml totaal eiwit. Load 2,5 gl plasma (25-250 ug eiwit) op een filter.
- Voeg 2 pl 1 M oplossing Dithiothreitol (DTT) aan elk monster in het filter.
- Verdun het monster met 200 ul PNGase verteren buffer.
- Cap het filter monsterbus en licht vortex, zorg dat u de filter van zijn plaats niet te verstoren. Incubeer het monster bij 56 ° C gedurende 30 minuten om de eiwitten te denatureren en glycoproteïnen.
- Om de monsters te alkyleren, voeg 50 ul 1 M joodaceetamide, tot een uiteindelijke concentratie van ~ 200 mM, en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
LET OP: Als proteomics analyse niet gewenst is, kan stap 1.5 worden overgeslagen. - Concentreer het gedenatureerde glycoproteïne op het filter door centrifugeren monsters bij 14.000 xg gedurende 40 min. Gooi doorstromen.
2. N-gebonden Glycan enzymatische afbraak
- Was het monster met 100 ui buffer PNGase verteren. Concentreer het glycoproteïne op het filter bij 14.000 xg gedurende 20 min en gooi doorstromen.
- Herhaal het wassen en concentreren stap tweemaal voor een totaal van drie keer, waardoor een concentraat in het filter dode volume (~ 5 pl). gooi alledoorstromen.
- Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon.
OPMERKING: PNGase verteren in buffer H 2 18 O tijdens het PNGase F vertering stap voor stabiele isotoop labeling van de geglycosyleerde asparagine-sites, die chemisch gedeamideerde aangestoken kunnen worden gebruikt.
- Voeg 2 ul van glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml) te filteren na het overbrengen naar een nieuwe verzameling flesje. Voeg 98 gl buffer PNGase verteren, waardoor de totale volume op 100 pl, en voorzichtig pipet op en neer op het filter te mengen. Enzymatisch verteren de glycanen onder de voorwaarden in de stappen 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR.
OPMERKING: Drie werkwijzen voor de deglycosylatie van eiwitten kunnen worden gebruikt. Voor uitsluitend glycomics analyse (geen proteomics), wordt de lange incubatietijd in stap 2.2.1 aanbevolen. Voor glycomics en proteomics onderzoek, de stappen 2.2.2 en 2.2.3 zal een hoge kwaliteit peptiden met minimale niet-specifieke deamidering.- Glycomics alleen digestie protocol (18hr) Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 18 uur enzymatisch splitsen alle N-glycanen.
- Spike-vertering protocol (SPI): Incubeer monsters bij 50 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen monsters en piek in een extra 2 ui glycerol-vrije PNGase F (x 75.000 eenheden / ml). Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur.
- Microgolfontsluiting protocol (MD): Leg monsters in een microcentrifugebuis drijvend rek. Vlotter monsters in een 1 L beker gevuld met 1 liter gedeïoniseerd (DI) water. Plaats het bekerglas in het midden van een magnetron (950 W) met een roterende plaat. Magnetron op 60% vermogen (570 W) gedurende 5 min. Afkoelen verwijderen monsters houdt bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. magnetron vervolgens gedurende nog 5 min bij 60% vermogen.
LET OP: Magnetron energie-instellingen zal moeten worden aangepast op basis van het maximale vermogen van de magnetron.Gemiddeld vermogen moet constant tussen de modellen worden gehouden.
3. Elutie van N-glycanen
- Elueer glycanen door centrifugeren van het monster bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C.
- Voeg 100 ul PNGase verteren buffer om het filter en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Collect wash bevattende resterende N-gebonden glycan in dezelfde verzameling flacon als elutiemiddel. Herhaal dit twee keer. Verwijder filter en plaats in de nieuwe collectie flacon.
- Incubate glycan monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur).
OPMERKING: N-glycanen kunnen worden bewaard bij -20 ° C tot zes maanden voor derivatisering.
4. Eiwit FASP Spijsvertering
LET OP: Als proteomics of deamidering siteanalyse niet gewenst is, kan deel 4 van het protocol worden overgeslagen.
- Spoel tHij filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 8 M ureum buffer. Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom.
- Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen ureumbuffer.
- Spoel de filter met het gedeamideerde peptiden met 400 gl 2 M ureum, 10 mM CaCl2 buffer (trypsinedigest buffer). Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen. Concentreren op de filter bij 14.000 xg gedurende 15 min. Gooi alle doorstroom.
- Herhaal stap 4.1 nog tweemaal voor een totaal van drie wassingen trypsinedigestie buffer.
- Teruggooi collectie flacon eenmaal wast zijn voltooid. Verzamel alle toekomstige elutiemiddelen en wast in een nieuwe collectie flacon.
- Voeg 50 ul van varken gemodificeerd trypsine in een 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwit (w / w) respectievelijk ratio voor ontdekking of kwantitatieve proteomics experimenten.Cap de collectie flacon en licht vortex te mengen.
- Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 2 uur. Snel te werken, te verwijderen samples en piek in een extra 50 ul van trypsine aan de 1:50 of 1: 5 trypsine: eiwitverhouding. Licht vortex de monsters gedurende 1-2 sec te mengen. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende nog 2 uur.
- Elueer de peptiden door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min.
- Spoel de resterende peptiden van de filter met 400 ul 1% mierenzuur en 0,001% Zwittergent 3-16 (quench buffer). Elueer van de filter door het draaien bij 14.000 xg gedurende 15 min.
- Kwantificeren van de peptide-concentratie in de monsters door Bradford 19 of BCA assay 20.
- Incubate peptide monsters in de -80 ° C vriezer tot bevroren (30-60 min). Droge voltooid, bij kamertemperatuur, onder vacuüm concentrator (4-6 uur).
OPMERKING: Droge peptiden kunnen tot drie maanden worden bewaard bij -20 ° C. - Resuspendeer tryptische eiwitten net voorafgaand aan Liquid chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) analyse 2% acetonitril, 98% H2O en 0,1% mierenzuur (mobiele fase A) tot de gewenste concentratie. Tryptische peptide concentraties van 2,5 pl plasma range 100-300 ng / ul.
5. Derivatisering van N-gebonden glycanen met Hydrofobe hydrazide Tags
- Reconstitueren gedroogd zware (SIL) of licht (NAT) P2GPN reagentia in 1 ml 75:25 MeOH: azijnzuur (Derivatisering oplossing), om een eindconcentratie van 0,25 mg / ml. Reagentia zal duren tot 10 minuten volledig oplosbaar. Uitvoerig vortex om volledige solubilisatie waarborgen.
Opmerking: Bij deze derivatisering protocol wordt gebruikt met standaard N-glycanen, versus gezuiverd glycanen, de molaire verhouding van P2GPN: glycaan duurt ongeveer (en niet minder) dan 17 zijn: 1. - Tag gedroogd N-glycanen met 200 pi (50 ug) van SIL of NAT P2GPN reagens. Pipet op en neer om gedroogde glycanen mengen. vortex samples en dan spin down monsters voor ~ 5 sec op een bench-top centrifuge.
- Reageren de glycanen met het reagens gedurende 3 uur bij 56 ° C.
- Onmiddellijk naar glycanen uit de incubator het vacuüm concentrator. Droge voltooid bij 55 ° C (3-5 uur).
OPMERKING: Deze stap lest de derivatisering reactie; het monster moet volledig droog kruisreactiviteit in de volgende stappen te voorkomen.
OPMERKING: Droge, hebben monsters tot zes maanden worden bewaard bij -20 ° C. - Resuspendeer hebben N-glycanen in 25-50 pl H2O vlak voor LC-MS analyse. Pipet op en neer om ervoor te zorgen N-glycanen zijn volledig oplosbaar gemaakt.
Opmerking: Het volume voor resuspensie is afhankelijk van de uitgangsconcentratie van glycoproteïne die geschat kunnen worden uit de start eiwitconcentratie. Toch zal het bereik varieert per monster type en moet individueel worden geoptimaliseerd. - Centrifugeer monsters bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant, en let niet te laten de punt van de pipet raakt de bodem van de centrifugebuis.
Opmerking: Overmatige tag mogelijk niet zichtbaar voor het oog, maar wordt verminderd door centrifugeren. - Combineer een paar NAT en SIL monsters desgewenst relatieve kwantificering, in een 1: 1 verhouding voor tandem analyse.
6. Ultra-hoge druk vloeistofchromatografie en massaspectrometrie Analyse
LET OP: De LC en MS beschreven voor een Easy nLC-1000 en een Q Exactive High Field voorwaarden, respectievelijk, werden geoptimaliseerd in-house voor proteomics analyse en voor de glycan analyse 21. Deze voorwaarden kunnen worden aangepast aan andere ultra-hoge druk- of nano- LC systemen en andere elektrische massaspectrometers high-oplossing maar kunnen kleine wijzigingen vereisen. Het gebruik van te hoge resolutie massaspectrometrie is noodzakelijk glycan identificatie en deamidering analyse 22,23.
OPMERKING: Stappen 6,1-6,3 kan zijn skipped wanneer de juiste omgekeerde fase chromatografie of hydrofiele interactie commerciële val en kolom worden gebruikt.
- Synthetiseren een frit 100 uM ID capillair volgens Meiring et al. 24 voor toepassing als een val.
- Verpak de val onder druk met 2,6 uM, 100 A, C 18 verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 5 cm.
- Pack een 75 uM ID emitter kolom onder druk met 2,6 uM, 100 A, C 18 verpakkingsmateriaal en gesneden tot een lengte van 30 cm.
- Bereid twee verschillende LC-MS methoden voor de proteomics (6.4.1) en glycomics (6.4.2) workflows.
Opmerking: Eiwit en glycan monsters kunnen worden uitgevoerd op de zelfde opstelling val / column in willekeurige volgorde.- Voor eiwitanalyse Injecteer ~ 400 ng eiwit op de kolom in mobiele fase A (MPA). Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 1, met 1 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer(500 bar). Ioniseren eiwitten onder het MS omstandigheden in tabel 2.
- Voor glycan analyse Injecteer 5 ul geresuspendeerd, P2GPN hebben NAT / SIL equimolaire monsters op de kolom. Laat het monster bij 300 nl / min, volgens tabel 3, met 2 pi pre-kolomequilibratiebuffer (500 bar) en een 5 pl analytische kolomequilibratiebuffer (500 bar). Ioniseren glycanen onder de MS omstandigheden in tabel 4.
| Tijd | % MPA | % MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
Tabel 1. LC voorwaarden voor proteoomanalyse. Een gradiëntelutie met mobiele fase B (MPB, 98% acetonitril, 2% H2O, 0,1% mierenzuur) werd uitgevoerd om peptiden jachtgeweer proteomics, data-afhankelijke acquisitie elueren MS experimenten.
| MS 1 Parameters | |
| Mass Range (Th) | 375-1500 |
| Resolutie | 120.000 |
| AGC | 1 x 10 6 |
| Max ionisatie Time | 30 |
| S-Lens FR Level | 55 |
| capillaire Temp (° C) | 300 |
| Spray Voltage | 1.75 |
| MS 2 Parameters | |
| acquisitie Type | top20 |
| Resolutie | 15.000 |
| AGC | 1 x 10 5 |
| Max ionisatie Time | 30 |
| ondervulling Ratio | 2% |
| Isolatie Window (Th) | 1.4 |
| Laadtoestand Uitsluiting | 1 |
| Genormaliseerde Collision Energy | 27 |
| Uitsluiting Time (s) | 20 |
Tabel 2: MS voorwaarden voor proteomics analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS 1 acquisitie, en MS 2 acquisitie in een orbitrap instrument met hogere energie dissociatio.n (HCD) gegeven.
| Tijd | % MPA | % MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
Tabel 3:. LC condities voor glycaan analyse Gradient elutie werd uitgevoerd elueerde hydrazide hebben N-glycanen voor MS analyse.
| MS 1 Parameters | |
| Mass Range (Th) | 600-1900 |
| Resolutie | 60.000 |
| AGC | 5 x 10 5 |
| Max ionisatie Time | 64 |
| S-Lens FR Level | 65 |
| Capillaire Temp (° C) | 325 |
| Spray Voltage | 1.75 |
| MS 2 Parameters | |
| acquisitie Type | top12 |
| Resolutie | 15.000 |
| AGC | 5 x 10 4 |
| Max ionisatie Time | 100 |
| ondervulling Ratio | 1% |
| Isolatie Window (Th) | 1.4 |
| Vaste Eerste Mass 125 | |
| Stapte Genormaliseerde Collision Energy | 10/20/30 |
| Uitsluiting Time (sec) | 15 |
Tabel 4: MS voorwaarden voor hydrazide tag N-glycan analyse van de parameters voor electrospray ionisatie, MS 1 acquisitie, en MS 2 acquisitie in een orbitrap instrument met een hogere energie-dissociatie (HCD) worden gegeven..
7. Proteomics en Deamidatie Analyse
- Identificeer eiwitten / peptiden met behulp van standaard bioinformatica zoekfuncties.
Opmerking: De volgende analyse protocol werd ontworpen met behulp van de Swiss-Prot / Trembl databases in UniprotKB en zoeken via SEQUEST in de Proteome Discoverer 1.4 software, maar het protocol kan direct worden vertaald naar een eiwit search engine en scoren met behulp van een GUI-software. Alle opdrachten hieronder weergegeven kunnen worden geraadpleegd in de software-interfaces door middel van drop-down menu's.- <li> maken of downloaden van een organisme geschikte eiwitsequentie database genomische data of ter beschikking proteoom databases zoals beschreven door Apweiler et al. 25
Opmerking: Common proteoom databases bevatten Swiss-Prot, Trembl, en NCBI, maar kan worden gebouwd van in-house gegevens, alsmede. - Binnen de software, kies een database zoekmachine en selecteer parameters op basis van de kwaliteit van de verkregen gegevens en de strengheid van de gewenste zoeken, zoals beschreven door Perkins et al. voor MASCOT 26 of Eng et al. voor Sequest 27.
- Voor high-mass nauwkeurigheid van de gegevens, set parameters voor het zoeken in de software als volgt: max 2 gemiste breuklijnen, 5 ppm voorloper massa tolerantie, en 0,02 Da fragment massa tolerantie (voor optimale accurate deamidering detectie 22) en omvatten de volgende tryptische peptide modificaties "carbamidomethyl (C)" statische modificatie en "deamidering (N / Q)" en "oxidation (M) "dynamische veranderingen. Bij gebruik 18 O digestie labeling bevatten" deamidering 18 O (1) "als extra dynamische wijziging.
- Zoek met behulp van de gekozen motor, de ruwe peptide data tegen het eiwit database (7.1.1).
Opmerking: Mass toleranties moet geschikt zijn voor het gebruikte instrument en niet willekeurig laag zijn.
Opmerking: De zoekfunctie wordt automatisch ingevuld door de software met behulp van verschillende zoekmachines specifieke algoritmes. De percolator algoritme (MASCOT), SEQUEST of andere combinaties van algoritmen worden toegepast om eiwitten te identificeren van peptiden en de geldigheid van de treffers behaalt; meer informatie over de beschikbare instrumenten worden behandeld in een recensie van Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Afhankelijk van de software, kunnen extra zoekparameters moeten worden afhankelijk van de beoordeling van de gebruiker.
- Exporteer de geïdentificeerde peptiden voor handmatige curation en Fürther analyse.
8. Glycan Relatieve kwantificering
Opmerking: De volgende identificatie en kwantificatie werd voltooid met behulp van de Xcalibur software. Echter, alle software die ruwe data analyseert en automatisch integreert chromatografische pieken kunnen worden vervangen.
- Genereer een theoretische overzicht van glycan composities uit de biologisch mogelijke combinaties van hexosen, deoxy-hexosen, hexosamines, siaalzuren en andere saccharides. Daartoe is een menselijke glycan databank gepubliceerd door Walker et al. 15 en kunnen worden gebruikt zoals het is. Voor theoretische databases, moet soortspecifieke biologische beperkingen worden opgelegd aan de combinatorische ruimte, en deze regels worden beschreven door Kronewitter et al. 31.
- Bereken de glycan mono-isotopische massa (M) van de atomaire massa's voor elke compositie voor proton lading staten + 1-3. Wijzig de mono-isotopische massa van de toevoeging van de NAT (254,14191 g / mol) of SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag bevatten.
- Open de "Processing Setup" programma van de routekaart uitzicht in Xcalibur. Stel een verwerkingsmethode precies in het Aanvullend materiaal beschreven door Walker et al. 15 met de lijst gegenereerd in stap 8.2 met de theoretische mono-isotopische massa van de [M + H] 1+, [M + 2H] 2+ en [ M + 3H] 3+ soorten.
Opmerking: Om glycaan identiteit daarbuiten nauwkeurig te bevestigenmassa, voor NAT / SIL dubbelzijdig runs, controleer dan of NAT en SIL N-glycan paren co-elueren met dezelfde retentietijd. Kwalitatief cross-identificaties bevestig met de MS spectra 2, waarbij pieken behorend tot de oxonium ion serie 32 moet bevatten. - Exporteer de geïntegreerde, geëxtraheerd ion chromatogram (XIC) gebieden om Excel aan de SIL en NAT abundanties precies in het Aanvullend materiaal beschreven van Walker et al te verkrijgen. 15
- In Excel programma de cellen in een nieuwe kolom aan de correctie van het molecuulgewicht overlap berekenen door aanpassing van de SIL overvloed volgens een door Walker e.a. vergelijking 1 5.:
,
waarbij A de mono-isotopische piek en de theoretische isotoop overlap,
, Kunnen onafhankelijk van elkaar worden berekend per samenstelling. - In een tweede kolom, het programma cellen NAT en SIL kanalen normaliseren behulp van de vergelijking van het totale genormaliseerde glycan factor (TGNF), per spectrum, zoals beschreven door Walker et al 1 5.:
,
waarbij N het aantal N-glycanen boven de limiet van kwantificering. - In een nieuwe kolom Programmeer de cellen met de verhouding tussen SIL nemen: NAT glycanen (of vice versa) om de veelvoudverandering concentratieverhouding tussen de twee monsters te berekenen.
, 
, Kunnen onafhankelijk van elkaar worden berekend per samenstelling. 
, Representative Results
Figuur 1:. De regeling van de HOEKTANDEN-P2GPN hydrofobe tagging gekoppeld methode (methode A) voor gecombineerde proteomics en glycomics analyse wordt gegeven Stappen die verschillen tussen glycomics-enige vorm van verwerking en tandem glycomics en proteomics analyse, met glycosylatieplaats identificatie, worden gemarkeerd. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De in-line proteoomanalyse en glycomics, filter-gebaseerde P2GPN hydrofobe tagging methode (methode A) werd gevalideerd voor de identificatie, kwantificering en molecuulgewicht voorspanning waarbij gebundelde hen plasmamonsters (Figuur 1). Voor uitsluitend glycomics experimenten, glycanen onderlinge vergelijkingen in de abundanties van N gewonnen door MethodA Carbograph SPE (gouden standaard, methode B) werden gemaakt (figuur 2). Er waren geen significante verschillen in de dichtheden van glycanen tussen beide methoden. De intra-variabiliteit werd ook beoordeeld door het kwantificeren van de SIL: NAT verhouding glycanen geëxtraheerd volgens dezelfde werkwijze. De log 2 -distributions van beide methoden waren Gaussian, gecentreerd op nul en niet significant verschillend (Figuur 3A-B). Het molecuulgewicht varieert tussen de twee protocollen volledig overlappende, wat suggereert dat het filter niet discrimineren N-glycanen basis van moleculaire gewichtsbereik en hydrofiliciteit (figuur 4).
Figuur 2: Een equimolair mengsel van NAT en SIL N-glycanen geëxtraheerd volgens werkwijze A of werkwijze B werd bereid uit 2,5 pl hen plasma (N = 4) De monsters waren anal.yzed door UPLC-MS volgens de aanbevolen parameters in paragraaf 6. De abundances per glycan voorgesteld, in elke NAT / SIL kanaal, berekend door integratie van de oppervlakte onder de geëxtraheerde ionenchromatogram (MMA = 3 ppm) en corrigeert de moleculaire gewicht overlap, en aanpassen door de TGNF. Deze ratio's worden getoond met hun standaard fouten. De dichtheden van Methode B: Methode A N-glycanen waren niet significant verschillend (p> 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De intra-variabiliteit in de (A) Methode A (N = 133) of (B) Methode B (N = 123) strategieën vergeleken. NAT en SIL equimolaire mengsels van N-glycanen, uit dezelfde extractie schemaWerden geanalyseerd via drie technische replicaten. De log 2 -distributions werden gecentreerd op nul en waren niet significant verschillend tussen de twee workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het molecuulgewicht varieert van glycanen van elke strategie vergeleken. De twee workflows leverde glycanen verspreid over hetzelfde gewicht bereik moleculaire. N-glycanen aangetroffen in een protocol ten opzichte van de andere viel net boven de detectielimiet (1 x 10 5 overvloed) en komen niet overeen met systematische vooringenomenheid. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
(Tabel 5). Onze typische 18 uur filter gebaseerd PNGase F vertering, gevolgd door FASP trypsine digestie (Std protocol) geleid tot aanzienlijke niveaus van niet-specifieke deamidering, die kunnen interfereren met de identificatie van glycosites. Daarom is een methode waarbij een kortere incubatietijd bij verhoogde temperatuur (50 ° C) en een PNGase F piek in stap (SPI protocol) werd onderzocht als alternatief, samen met een microgolfontsluiting protocol (MD protocol), die niet-minimaliseren specifieke deamidering. De glycanen waargenomen in de nieuwe digestiemethoden waren niet significant verschillend in samenstelling of abundanties van de standaard 18 uur, 37 ° C filter PNGase F digest (
| eiwitten | peptiden | gedeamideerde Peptiden | Glycosites | glycoproteïnen | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18hr | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
. Tabel 5: Vergelijkingen van proteomics data van een standaard trypsine verteren ten opzichte van de in-line HOEKTANDEN-P2GPN tagging methode werden voorbereidingen getroffen werden uitgevoerd met (+) en zonder (-) PNGase F op de achtergrond de tarieven van de niet-specifieke deamidering en de raming te bepalen glycosite vals positieve tarieven. Eiwitten werden geïdentificeerd met 1% valse ontdekking tarief (FDR); peptiden werden gefilterd op basis van peptide vertrouwen "hoog" in Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites werden identified basis van unieke sequenties die deamidering van het geconserveerde motief glycosylering (NXS / T); en glycoproteïnen werden gedefinieerd als geïdentificeerde eiwitten die ten minste één geïdentificeerde glycosite.
Figuur 5: Verkorte protocollen voor glycanen werden ontwikkeld om deaminering in de monsters te minimaliseren en vergeleken met de 18 uur HOEKTANDEN PNGase F vertering. De gemiddelde verschillen waren in dichtheden 10% en 5% van de MD (2.2.3) en SPI (2.2.2) protocollen, respectievelijk. Van de 48 glycanen geïdentificeerd, 90% weergegeven minder dan 1,5-voudige variatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
