Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En Kvantitativ Glycomics og Proteomics Kombineret Purification strategi

Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53735
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, North Carolina State University
* These authors contributed equally

Introduction

På proteomics, har filter hjulpet prøveforberedelse (FASP) blevet udbredt for sin evne til at minimere mængden af udgangsmateriale, mindske prøveforberedelse artefakter, og maksimere prøve gennemløb 1. Imidlertid har en sådan metode endnu at opstå og vinde trækkraft for området Glycomics. Udvikling af high-throughput, er der behov for kvantitative arbejdsgange på grund af den integrerende rolle glycosylering i biologisk forsvar og dets modulation af cancer eller sygdomme 2,3. I pattedyr er N -glycans sammensat af gentagne saccharidenheder (hexoser (Hex), hexosaminer (HexNac), sialinsyrer (NeuAc), og fucoses (Fuc)), som dekorere en kernestruktur (Hex 3 HexNac 2) 4 kovalent bundet til asparagin. Selvom glycospace er betydeligt stort når isomerer tælles (> 10 12), det er ret små på et præparat basis og molekylvægte typisk i området fra 1000-8000 Da 5 </ Sup>. Den kompositoriske homogenitet klasse og hydrofilicitet glykaner udgøre unikke udfordringer til rensning, adskillelse, og massespektrometri (MS) arbejdsgange 6.

Traditionelt er N -glycans spaltet fra proteiner eller peptider ved peptid- N -glycosidase F (PNGase F) og derefter beriget af lectin-affinitetskromatografi 7, fanget af hydrazid perler 8, eller oprenset via fastfaseekstraktion (SPE) 9,10. Mens disse metoder alle meget effektive, de indfører ekstra trin til afsaltning og begrænse antallet af prøver samtidigt behandles. I det seneste årti er der blevet foreslået en række high-throughput platforme for Glycomics. Kim et al. Udgivet en semi-automatiseret metode under anvendelse af en vakuum-drevet, SPE 96-brønds plade 11. Alternativt blev en affinitet-filter metode (N -glyco-FASP) udviklet af Mann-gruppen, som krævede den indledende derivatisering af filter med en sammensætning af lektiner 12. Endelig har Thomas-Oates gruppe foreslog en semikvantitativ metode, Filter Aided N -Glycan separation (fangs), som udnyttede den smalle størrelse sammensætningen af glycospace 13. Afhængige af molekylvægt cut-off filtre blev små forureninger først vasket til affald og derefter N -glycans blev fordøjet og elueres. Deglycosylerede proteiner forbliver på filteret i denne protokol og kan blive udsat for in-line FASP.

Identifikation og kvantificering af glycaner ved elektrospray ionisering (ESI) MS kræver off-line separationer til (delvis) opløsning af isomerer og derivatisering til påvisning af lav-udbredte arter. Mærkning i individualitet når normalisere med glycan hydrazid tags strategi giver kompatibilitet med omvendt fase væskekromatografi (RPLC) 14,15. Det 4-phenethyl-benzohydrazid (P2PGN) hydrofob tag medierer hydrofiliciteten af ​​glykaner, enhsieringsbehov ionisering af i gennemsnit fire gange 16. Selv om andre teknikker, såsom permethylering 17 eller amin-reaktivt tagging kemier 18, tilbyder lignende fordele, i hydrazid reaktion, er glycaner omsættes 1: 1 støkiometrisk i letkøbte betingelser. Relativ kvantificering opnås ved tandem-analyse af prøver derivatiseret med nativt (NAT) eller 13 C 6 stabil isotop etiketter (SIL).

Følgende metode udvikler hugtænder for plasma applikationer og par den til P2GPN hydrofobe tag for nøjagtig relativ kvantificering. Endvidere blev det designet til at udføre shot-gun proteomics, deamidering profilering og kvantitative Glykobiologi på en enkelt portion af prøve, uden at kompromittere integriteten af ​​analyserne.

Protocol

1. Protein og Glycoprotein Denaturering og Alkylering

  1. Til standard præparater, belastning 2,5 pi af en 0,1 pg / pl opløsning af glycoprotein (f.eks fetuin eller RNase B) på en 30 kDa eller 10 kDa molekylvægt (MW) cut-off filter.
    1. For biologiske plasmaprøver, kontrollere protein koncentration ved en standard Bradford 19 eller bicinchoninsyre 20 (BCA) proteinanalyse. Fortynd plasmaet, om nødvendigt, med 100 mM ammoniumbicarbonat (NH4 HCO 3) i H2O (PNGase Digest Buffer) ved en pH-værdi på ~ 7 at indeholde mellem 10-100 mg / ml totalt protein. Belastning 2,5 pi plasma (25-250 ug protein) på et filter.
      Bemærk: Denne protokol er kun blevet testet på plasma fra blodprøver opsamlet i nærvær af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
  2. Tilsæt 2 pi 1 M dithiothreitolopløsning (DTT) til hver prøve i filteret.
  3. Fortynde prøven med 200 pi PNGase fordøje puffer.
  4. Cap filteret prøveglasset og let vortex, og pas på ikke at forstyrre filter fra sit sæde. Prøven inkuberes ved 56 ° C i 30 min for at denaturere proteinerne og glycoproteinerne.
  5. At alkylere prøverne, tilsættes 50 pi 1 M Iodacetamid, hvilket gav en slutkoncentration på ~ 200 mM, og der inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter.
    BEMÆRK: Hvis ikke ønskes proteomics analyse kan trin 1.5 springes over.
  6. Koncentrer det denaturerede glycoprotein på filteret ved centrifugering prøver ved 14.000 xg i 40 min. Kassér flyde igennem.

2. N-bundet Glycan enzymatisk nedbrydning

  1. Vask prøven med 100 pi PNGase fordøje puffer. Koncentrer glycoproteinet på filteret ved 14.000 xg i 20 minutter og kassere flyde igennem.
    1. Gentag vask og koncentratet trin to gange, i alt tre gange, hvilket gav et koncentrat i filteret dødvolumen (~ 5 pi). Kassér alleflow-through.
    2. Kassér samling hætteglas når vasker er komplette. Saml alle fremtidige eluenter og vaske i et nyt hætteglas kollektion.
      BEMÆRK: PNGase fordøje buffer i H 2 18 O kan anvendes under den PNGase F fordøjelsen skridt for stabile isotoper mærkning af de-glykosyleret asparagin sites, som bliver kemisk deamideret.
  2. Tilsæt 2 pi glycerol-fri PNGase F (75.000 x enheder / ml) for at filtrere efter overførsel til en frisk hætteglas samling. Tilføj 98 pi PNGase fordøje puffer, hvilket bringer den samlede volumen til 100 pi, og forsigtigt pipetteres op og ned på filteret for at blande. Enzymatisk fordøje glycanerne under betingelserne i trin 2.2.1, 2.2.2, OR 2.2.3.
    BEMÆRK: Der kan anvendes tre metoder til deglycosylering af proteiner. For udelukkende Glykobiologi analyse (ingen proteomics), anbefales den lange inkubationstid i trin 2.2.1. For Glycomics og proteomics forskning, trin 2.2.2 og 2.2.3 vil producere peptider af høj kvalitet med minimal ikke-specific deamidering.
    1. Glycomics kun for fordøjelse protokol (18 timer): Inkuber prøver ved 37 ° C i 18 timer til enzymatisk kløve alle N -glycans.
    2. Spike-i fordøjelsen protokol (SPI): Inkuber prøverne ved 50 ° C i 2 timer. Arbejder hurtigt, udtage prøver, og spike i yderligere 2 pi af glycerol-fri PNGase F (75.000 x enheder / ml). Let vortexes prøverne i 1-2 sek at blande. Inkuber prøverne ved 50 ° C i yderligere 2 timer.
    3. Mikroovn fordøjelse protokol (MD): Anbring prøverne i et mikrocentrifugerør flydende rack. Løsblokke i en 1 liters bægerglas fyldt med 1 I deioniseret (DI) vand. Anbring bægerglasset i centrum af en mikrobølgeovn (950 W) med en roterende plade. Mikrobølgeovn ved 60% effekt (570 W) i 5 minutter. For at køle, fjerne prøver og holde ved stuetemperatur i 2 min. Derefter mikrobølgeovn i yderligere 5 minutter ved 60% kraft.
      BEMÆRK: Mikrobølgeforstærkere indstillinger skal justeres baseret på den maksimale effekt af mikrobølgeovn.Gennemsnitlig effekt bør holdes konstant mellem modeller.

3. Eluering af N -glycans

  1. Eluer glycaner ved centrifugering af prøven ved 14.000 xg i 20 minutter ved 20 ° C.
  2. Tilsæt 100 pi PNGase fordøje puffer til filteret og der centrifugeres ved 14.000 xg i 20 minutter ved 20 ° C. Indsamle vask indeholdende eventuelt resterende N-bundet glycan, i samme samling hætteglasset som eluenten. Gentag to gange. Fjern filter og plads i nyt hætteglas kollektion.
  3. Inkuber glycan prøver i -80 ° C fryser indtil frosset (30-60 min). Tør til færdiggørelse, ved stuetemperatur, i vakuumkoncentrator (4-6 timer).
    BEMÆRK: N -glycans kan opbevares ved -20 ° C i op til seks måneder før derivatisering.

4. Protein FASP fordøjelse

BEMÆRK: Hvis der ikke ønskes proteomics eller deamidering websted analyse kan § 4 i protokollen blive sprunget over.

  1. Skyl than foretage indeholdende de deamiderede peptider, med 400 pi 8 M urinstof-buffer. Sæt låg på indsamling hætteglasset og let vortex at blande. Koncentrer på filteret ved 14.000 xg i 15 min. Kassér alle gennemstrømning.
    1. Gentag trin 4.1 to yderligere gange, i alt tre urinstofbuffer vaske.
  2. Filteret skylles, der indeholder de deamiderede peptider, med 400 pi 2 M urinstof, 10 mM CaCl2 puffer (trypsinnedbrydningsprodukt puffer). Sæt låg på indsamling hætteglasset og let vortex at blande. Koncentrer på filteret ved 14.000 xg i 15 min. Kassér alle gennemstrømning.
    1. Gentag trin 4.1 to yderligere gange, i alt tre trypsinnedbrydningsprodukt puffersystemer vaske.
    2. Kassér samling hætteglas når vasker er komplette. Saml alle fremtidige eluenter og vaske i et nyt hætteglas kollektion.
  3. Der tilsættes 50 pi porcin modificeret trypsin i et 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein (vægt / vægt) henholdsvis ratio for opdagelse eller kvantitative proteomics eksperimenter.Sæt låg på indsamling hætteglasset og let vortex at blande.
  4. Inkuber prøverne ved 37 ° C i 2 timer. Arbejde hurtigt, udtage prøver, og spike i yderligere 50 pi trypsin ved 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein-forhold. Let vortexes prøverne i 1-2 sek at blande. Inkuber prøverne ved 50 ° C i yderligere 2 timer.
  5. Eluer peptiderne ved centrifugering ved 14.000 xg i 15 min.
  6. Skyl de resterende peptider fra filteret med 400 pi 1% myresyre og 0,001% Zwittergent 3-16 (stoppuffer). Eluere fra filteret ved centrifugering ved 14.000 xg i 15 min.
  7. Kvantificer koncentrationen peptidet i prøverne ved Bradford-19 eller BCA assay 20.
  8. Inkuber peptidprøver i -80 ° C fryser indtil frosset (30-60 min). Tør til færdiggørelse, ved stuetemperatur, i vakuumkoncentrator (4-6 timer).
    BEMÆRK: Tørrede peptider kan opbevares ved -20 ° C i op til tre måneder.
  9. Resuspender tryptiske proteiner lige før LIQUId chromatografi-massespektrometri (LC-MS) analyse i 2% acetonitril, 98% H2O, og 0,1% myresyre (mobil fase A) til den ønskede koncentration. Tryptiske peptidkoncentrationer fra 2,5 pi plasma fra 100 - 300 ng / pl.

5. Derivatisering af N-forbundet Glykaner med hydrofobe hydrazid Tags

  1. Rekonstituer tørrede tunge (SIL) eller lys (NAT) P2GPN reagenser i 1 ml 75:25 MeOH: eddikesyre (Derivatisering opløsning), for en endelig koncentration på 0,25 mg / ml. Reagenser vil tage op til 10 minutter for fuldt ud at opløse. Ekstensivt vortex for at sikre fuldstændig opløsning.
    Bemærk: I tilfælde denne derivatisering protokol bruges til standard N -glycans, versus oprensede glycaner, det molære forhold mellem P2GPN: glycan bør være ca. (og ikke mindre) end 17: 1.
  2. Tag tørret N -glycans med 200 pi (50 ug) af SIL eller NAT P2GPN reagens. Pipette op og ned for at opblande tørrede glykaner. Vortex samples og derefter spin ned prøver til ~ 5 sek på en bordcentrifuge.
  3. Omsætte glycaner med reagenset i 3 timer ved 56 ° C.
  4. Straks gå glycaner fra inkubatoren til vakuumkoncentrator. Tør fuldstændigt ved 55 ° C (3-5 timer).
    BEMÆRK: Dette trin slukker derivatisering reaktion; prøven skal være helt tørt for at undgå krydsreaktivitet i de efterfølgende trin.
    BEMÆRK: prøver Tørret, tagget kan opbevares ved -20 ° C i op til seks måneder.
  5. Resuspender tagget N -glycans i 25-50 pi H2O lige før LC-MS-analyse. Pipette op og ned for at sikre N -glycans er fuldt opløst.
    BEMÆRK: Volumenet for resuspension er afhængig af startkoncentrationen af ​​glycoprotein, der kan beregnes ud fra koncentrationen start protein. Imidlertid vil området varierer pr prøvetype og bør individuelt optimeres.
  6. Centrifugér prøver ved 14.000 xg i 5 minutter. Fjern supernatant, og pas på ikke at lade spidsen af ​​pipetten rører bunden af ​​centrifugerør.
    Bemærk: Overskydende tag kan ikke være synlige for øjet, men vil blive reduceret ved centrifugering.
  7. Kombiner et par NAT og SIL prøver, hvis det ønskes til relativ kvantificering, i et 1: 1 forhold for tandem-analyse.

6. Ultra-højtryksvæskechromatografi og massespektrometri Analyse

BEMÆRK: LC og MS beskrevet for en Easy nLC-1000 og en Q Exactive High Field henholdsvis blev optimeret in-house for proteomics analyse og for glycan analyse 21. Disse betingelser kan tilpasses til andre ultra-høje tryk- eller nano- LC-systemer og andre high-opløsningsevne massespektrometre men kan kræve mindre ændringer. Anvendelsen af høj opløsningsevne massespektrometri er nødvendig for glycan identifikation og deamidering analyse 22,23.

BEMÆRK: Trin 6.1-6.3 kan være skipped hvis der anvendes en passende revers-fase-kromatografi eller hydrofil interaktion kommerciel fælde og kolonne.

  1. Syntetisere en fritte i 100 uM ID kapillar ifølge Meiring et al. 24 til anvendelse som en fælde.
  2. Pak fælden under tryk med 2,6 pM, 100 Å, C18 emballage og skæres til en længde på 5 cm.
  3. Pakke en 75 uM ID emitter kolonne under tryk med 2,6 pM, 100 Å, C18 emballage og skæres til en længde på 30 cm.
  4. Forbered to forskellige LC-MS-metoder for proteomics (6.4.1) og Glycomics (6.4.2) arbejdsgange.
    Bemærk: Protein og glycan prøver kan køre på den samme fælde / kolonne setup i vilkårlig rækkefølge.
    1. For protein analyse, injicere ~ 400 ng protein på kolonnen i mobil fase A (MPA). Kør prøven ved 300 nl / min, ifølge tabel 1, med en 1 pi præ-kolonne ækvilibrering (500 bar) og en 5 pi analytisk søjle ækvilibrering(500 bar). Ionisere proteiner under MS betingelserne i tabel 2.
    2. For glycan analyse, injicere 5 ul resuspenderes, P2GPN mærkede NAT / SIL ækvimolære prøver på søjlen. Kør prøven ved 300 nl / min, i henhold til tabel 3, med en 2 pi præ-kolonne ækvilibrering (500 bar) og en 5 pi analytisk søjle ækvilibrering (500 bar). Ionisere glycaner under MS betingelserne i tabel 4.
Tid % MPA % MPB
0 100 0
5 98 2
105 80 20
135 68 32
136 5 95
151 5 95
152 100 0
167 100 0

Tabel 1. LC betingelserne for proteomisk analyse. En gradienteluering med mobil fase B (MPB, 98% acetonitril, 2% H2O, 0,1% myresyre) blev udført for at eluere peptider til shot-gun proteomics, data-afhængig overtagelsen , MS eksperimenter.

MS 1 Parametre
Mass Range (Th) 375-1500
Løsning 120.000
AGC 1 × 10 6
Max Ionisering Time 30
S-Lens FR Level 55
kapillær Temp (° C) 300
Spray Spænding 1,75
MS 2 Parametre
erhvervelse Type Top20
Løsning 15.000
AGC 1 × 10 5
Max Ionisering Time 30
underfyldnings Ratio 2%
Isolation Window (Th) 1.4
Charge State Udelukkelse 1
Normalized Collision Energy 27
Udelukkelse Tid (s) 20

Tabel 2: MS betingelser for proteomisk analyse Parametrene for elektrospray ionisering, MS 1 erhvervelse og MS 2 erhvervelse i et orbitrap instrument ved hjælp af højere energi dissociatio.n (HCD) er angivet.

Tid % MPA % MPB
0 95 5
1 70 30
41 60 40
46 37 63
47 10 90
55 10 90
56 95 5
66 95 5

Tabel 3:. LC betingelserne for glycan analyse En gradient eluering blev udført for at eluere hydrazid mærkede N -glycans til MS-analyse.

<tr>
MS 1 Parametre
Mass Range (Th) 600-1900
Løsning 60.000
AGC 5 × 10 5
Max Ionisering Time 64
S-Lens FR Level 65
Kapillær Temp (° C) 325
Spray Spænding 1,75
MS 2 Parametre
erhvervelse Type Top12
Løsning 15.000
AGC 5 × 10 4
Max Ionisering Time 100
underfyldnings Ratio 1%
Isolation Window (Th) 1.4
Fast First Mass 125
Trådte Normalized Collision Energy 10/20/30
Udelukkelse (sek) 15

Tabel 4: MS betingelser for hydrazid tagged N -glycan analyse Parametrene for elektrosprayionisering, er MS en erhvervelse, og MS 2 erhvervelse i et orbitrap instrument ved hjælp af højere energi dissociation (HCD) givet..

7. Proteomics og Deamidering Analyse

  1. Identificer proteiner / peptider ved hjælp af standard bioinformatik søgeværktøjer.
    Bemærk: I den følgende analyse protokol designet ved hjælp af Swiss-Prot / Trembl databaser UniprotKB og søge via SEQUEST i Proteome Discoverer 1.4 software, men protokollen kan direkte oversættes til noget protein søgning og scoring motoren med en GUI software. Alle kommandoer nedenfor kan tilgås i software interfaces via drop-down menuer.
      <li> Opret eller downloade en organisme passende protein sekvens database fra genomiske data eller tilgængelige proteomanalyse databaser som beskrevet af Apweiler et al. 25
      Bemærk: Fælles proteomanalyse databaser omfatter Swiss-Prot, TrEMBL, og NCBI, men kan være opbygget fra interne data samt.
    1. Inden softwaren, skal du vælge en database søgemaskine og vælg parametre efter kvaliteten af de data, der er erhvervet og strenghed af den ønskede søgning, som beskrevet af Perkins et al. for MASCOT 26 eller Eng et al. for SEQUEST 27.
      1. Til høje-masse nøjagtighed data, sæt parametre for søgning i softwaren som følger: max 2 ubesvarede spaltninger, 5 ppm forløber masse tolerance og 0,02 Da fragment masse tolerance (for optimeret nøjagtig deamidering detektering 22) og omfatter følgende tryptiske peptid modifikationer : "carbamidomethyl (C)" statisk modifikation og "deamidering (N / Q)" og "okseidation (M) "dynamiske ændringer. Hvis du bruger 18 O fordøjelse mærkning, omfatter" deamidering 18 O (1) "som en ekstra dynamisk modifikation.
      2. Søg ved hjælp af den valgte motor, de rå peptid data mod proteinet database (7.1.1).
        Bemærk: Masse tolerancer skal være passende for det anvendte instrument og ikke vilkårligt lav.
        Bemærk: Søgefunktionen er automatisk udfyldt af software ved hjælp af forskellige søgemaskine specifikke algoritmer. Den percolator algoritme (MASCOT), SEQUEST, eller andre kombinationer af algoritmer anvendes til at identificere proteiner fra peptider og at score gyldigheden af ​​hits; mere information om de tilgængelige værktøjer er dækket i en bedømmelse fra Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Afhængigt af den software, kan være nødvendigt at vælges i henhold til brugerens skøn yderligere søgeparametre.
    2. Eksporter de identificerede peptider til manuel datasikring og FurthER analyse.
  2. Manuelt kuratere en liste over peptider indeholdende en identificeret deamidering på asparagin af N-forbundet glycosylering motiv (NX- (S / T), hvor X ≠ P). Cross-validere disse steder med kendte glycosyleringsmotiver fra litteraturen og oprette to puljer af resultater (validerede og teoretisk).
  3. Brug spektral optælling 30 at sammenligne den procentvise belægning af et givet glycosyleringssite ved at sammenligne den overflod af deamiderede og ikke-deamiderede former.

8. Glycan Relativ Kvantificering

Bemærk: Følgende identifikation og kvantificering blev afsluttet ved hjælp af Xcalibur software. software, der analyserer rådata og automatisk integrerer Imidlertid kromatografiske toppe kan erstattes.

  1. Generere en teoretisk liste over glycan præparater ud fra biologisk mulige kombinationer af hexoser, deoxy-hexoser, hexosaminer, sialinsyrer, og andre saccharides. Til dette formål har en menneskelig glycan database blevet offentliggjort af Walker et al. 15 og kan bruges som den er. For teoretiske databaser, skal pålægges artsspecifikke biologiske begrænsninger på den kombinatoriske rum, og disse regler er beskrevet af Kronewitter et al. 31.
  2. Beregn glycan monoisotopisk masser (M) fra atommasserne for hver sammensætning for proton opladningstilstand + 1-3. Rediger monoisotopisk masserne til at omfatte tilsætning af NAT (254,14191 g / mol) eller SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag.
  3. Åbn "Processing Setup" program fra køreplanen visning i Xcalibur. Opsætning af en forarbejdningsmetode som nøjagtigt beskrevet i supplerende materiale fra Walker et al. 15 under anvendelse af listen er frembragt i trin 8.2 indeholdende de teoretiske monoisotopisk masserne for [M + H] 1+, [M + 2H] 2+, og [ M + 3H] 3 + arter.
    Bemærk: For at bekræfte glycan identitet ud over præcismasse, for NAT / SIL duplex kørsler, kontrollere, at NAT og SIL N -glycan par co-elueres med samme retentionstid. Kvalitativt cross-validere identifikationer med MS 2 spektre, som skal indeholde toppe tilhører oxonium- ionserier 32.
  4. Eksporter integrerede, udvundet ion kromatogram (XIC) områder til Excel for at opnå de SIL og NAT mængderne som præcis beskrevet i supplerende materiale fra Walker et al. 15
  5. I Excel program cellerne i en ny kolonne for at beregne korrektionen for molekylvægten overlap ved at justere SIL overflod ifølge ligningen offentliggjort af Walker et al 1 5.:
    ligning 1 ,
    hvor A er monoisotopiske peak og den teoretiske isotop overlap, ligning 2 , Kan være uafhængigt beregnes pr sammensætning.
  6. I en anden kolonne, program cellerne til at normalisere NAT og SIL kanaler under anvendelse af ligningen for den samlede normaliserede glycan faktor (TGNF), pr spektrum, som beskrevet af Walker et al 1 5.:
    ligning 3 ,
    hvor N er antallet af N -glycans over bestemmelsesgrænsen.
  7. I en ny kolonne, program cellerne at tage forholdet SIL: NAT glycaner (eller omvendt) for at beregne fold-ændring i koncentration mellem de to prøver.

Representative Results

Figur 1
Figur 1:. Ordningen af hugtænder-P2GPN hydrofobe tagging koblede metode (metode A) til kombinerede proteomics og Glykobiologi analyse gives Steps, der adskiller sig mellem Glycomics kun for forarbejdning og tandem Glykobiologi og proteomics analyse, med identifikation glykosyleringssted, er fremhævet. klik her for at se en større version af dette tal.

Den in-line proteomics og Glykobiologi blev filter-baserede P2GPN hydrofobe tagging metode (metode A) valideret for identifikation, kvantificering og molekylvægt skævhed hjælp pooled høne plasmaprøver (figur 1). For udelukkende Glycomics eksperimenter, -glycans indbyrdes sammenligninger i mængderne af N udvundet ved metodeA til carbograph SPE (guld-standard, metode B) blev fremstillet (Figur 2). Der var ingen signifikante forskelle i mængderne af glykaner mellem de to metoder. Den intra-variabilitet blev også vurderet ved kvantificering af SIL: NAT forhold af glycaner ekstraheret ved den samme metode. Log 2 -distributions ved begge metoder var gaussisk, centreret på nul, og ikke signifikant forskellig (figur 3A-B). Molekylvægten ligger mellem de to protokoller fuldstændigt overlappende, hvilket antyder, at filteret ikke diskriminerede N -glycans baseret på molekylvægtsområde og hydrofilicitet (figur 4).

Figur 2
Figur 2: En ækvimolær blanding af NAT og SIL N -glycans ekstraheret ved fremgangsmåde A eller fremgangsmåde B blev fremstillet ud fra 2,5 pi høne plasma (n = 4) Prøver blev anal.yzed af UPLC-MS i henhold til de anbefalede parametre foreslået i afsnit 6. mængderne for hver glycan, i hvert NAT / SIL kanal, blev beregnet ved at integrere arealet under den udtrukne ion kromatogrammet (MMA = 3 ppm), korrigere for den molekylære vægt overlap, og justering af TGNF. Disse forhold er vist med deres standardafvigelser. Mængderne af metode B: Metode A N -glycans var ikke signifikant forskellige (p> 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: intra-variabilitet i (A) Fremgangsmåde A (N = 133) eller (B) Fremgangsmåde B (N = 123) strategier blev sammenlignet. NAT og SIL ækvimolære blandinger af N -glycans, fra samme udvinding ordningen, Blev analyseret i løbet af tre tekniske gentagelser. Log 2 -distributions var centreret på nul og var ikke signifikant forskellig mellem de to arbejdsgange. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Molekylvægtsstandarderne intervaller af glycaner fra hver strategi blev sammenlignet. De to arbejdsgange gav glycaner spænder over samme molekylvægt interval. N -glycans påvist i én protokol versus den anden faldt lige over detektionsgrænsen (1 × 10 5 overflod) og afspejler ikke systematisk bias. Klik her for at se et større version af denne figur.

(tabel 5). Vores typiske 18 timer filter baseret PNGase F fordøjelsen, efterfulgt af FASP trypsin fordøjelse (Std-protokol) resulterede i signifikante niveauer af ikke-specifik deamidering, som kan forstyrre identifikation af glycosites. Derfor blev der kun anvendes en kortere inkubationstid ved forhøjet temperatur (50 ° C) og en PNGase F spike-i trin (SPI protokol) undersøgt som et alternativ, sammen med en mikrobølge-protokol (MD-protokol), for at minimere ikke- specifik deamidering. De glycans observeret i de nye fordøjelse metoder var ikke signifikant forskellig i kompositioner eller mængderne fra standard 18 timer, 37 ° C filter PNGase F digest ( (tabel 5).

Proteiner Peptider deamideret peptider Glycosites glycoproteiner
+ - + - + - + - + -
FASP 3083 795 5 5
18 timer 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18
MD 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7
SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8

. Tabel 5: Sammenligning af proteomik data fra en standard trypsinnedbrydningsprodukt versus in-line fangs-P2GPN tagging metode blev foretaget Præparater blev udført med (+) og uden (-) PNGase F til bestemmelse baggrundsraten af uspecifik deamidering og skøn glycosite falsk positive satser. Proteiner blev identificeret med 1% falsk opdagelse sats (FDR); peptider blev filtreret baseret på "høj" peptid tillid Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites blev identified baseret på unikke sekvenser indeholdende deamidering af det konserverede glycosylering motiv (NXS / T); og glycoproteiner blev defineret som identificerede proteiner indeholdende mindst et identificeret glycosite.

Figur 5
Figur 5: Forkortet protokoller for glycaner blev udviklet for at minimere deaminering i prøverne og sammenlignet med 18 timer fangs PNGase F-fordøjelse. De gennemsnitlige forskelle i mængderne var 10% og 5% for MD (2.2.3) og (2.2.2) protokoller SPI hhv. Af de 48 glykaner identificeret, 90% viste mindre end 1,5 gange variation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid (50%) Sigma Aldrich  45754
Acetonitrile, HPLC grade Burdick & Jackson  AH015-4
Ammonium Bicarbonate Sigma Aldrich  A6141
Bradford Reagent Sigma Aldrich  B6916 Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride Sigma Aldrich  C1016
Centrifuge Eppendorf 5804 R Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1 M in solution Sigma Aldrich  646563
Easy-nLC 1000 Thermo Scientific LC120 Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters).
Floating Tube Rack TedPella 20831-20
Fetuin New England Biolabs  P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens Fisher Scientific 11-690-625F Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
GE Microwave Oven General Electric 57B5 E82904 Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit  Cambridge Isotope Laboratories GTK-1000 The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide Sigma Aldrich  A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase Phenomenex  Bulk Media Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM
Mascot Daemon Software and Server Matrix Science Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade Burdick & Jackson  AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm New Objective 1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml New England BioLabs P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B New England Biolabs  P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma Aldrich  T6567-5X
Urea Sigma Aldrich  51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters  Sartorius Stedim Biotech VN01H22 Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade Burdick & Jackson  AH365-4
Water, 18O Cambridge Isotope Laboratories OLM-240-97-1 The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0 Thermo Scientific XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit Merck Millipore 693030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
  2. Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
  3. Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
  4. Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
  5. Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
  6. Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
  7. Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
  8. Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
  9. Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
  10. Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
  11. Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
  12. Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
  13. Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
  14. Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
  15. Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
  16. Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
  17. Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
  18. Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  21. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
  22. Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
  23. Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
  24. Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
  25. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
  26. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
  27. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
  28. Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
  29. Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
  30. Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
  31. Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
  32. Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).

Tags

Kemi Glycomics proteomics glykosylering-site analyse deamidering hydrazid tagging relativ kvantificering
En Kvantitativ Glycomics og Proteomics Kombineret Purification strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hecht, E. S., McCord, J. P.,… More

Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy. J. Vis. Exp. (109), e53735, doi:10.3791/53735 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter