Introduction
I feltet av proteomikk, har filter hjulpet prøvepreparering (FASP) vært i omfattende bruk for dens evne til å minimalisere mengden av utgangsmaterialet, redusere prøveopparbeidelse gjenstander, og maksimere en prøvekapasitet. Imidlertid har en slik fremgangsmåte, men å dukke opp og få trekkraft for feltet glycomics. Utvikling av high-throughput kvantitative arbeidsflyter nødvendig på grunn av den integrerte rolle glykosylering i biologisk forsvar og dens modulering av kreft eller sykdommer 2,3. I pattedyr, er N -glycans består av repeterende sakkaridenheter (heksoser (Hex), hexosamines (HexNac), sialinsyrer (NeuAc), og fucoses (FUC)), som dekorerer en kjernestruktur (Hex 3 HexNac 2) 4 kovalent bundet til asparagin. Selv om glycospace er betraktelig stor når isomerer telles (> 10 12), er det ganske liten på en sammensetning basis og molekylvekter typisk i området fra 1,000-8,000 Da 5 </ Sup>. Den kompositoriske homogenitet av klassen og hydrophilicity av glykaner utgjøre unike utfordringer til rensing, separasjon, og massespektrometri (MS) arbeidsflyt 6.
Tradisjonelt er N -glycans fordøyd fra proteiner eller peptider av peptid N -glycosidase F (PNGase F) og deretter beriket av lektin affinitetskromatografi 7, fanget av hydrazide perler 8, eller renset via fast fase ekstraksjon (SPE) 9,10. Selv om disse metodene er alle meget effektive innføre de ekstra trinn for avsalting og begrense antall prøver samtidig behandlet. I løpet av det siste tiåret, har en rekke high-throughput plattformer for glycomics blitt foreslått. Kim et al., Publisert en semi-automatisert fremgangsmåte ved bruk av en vakuum-operert, SPE 96-brønns plate 11. Alternativt ble en affinitet-filter-metoden (N -glyco-FASP) som er utviklet ved hjelp av Mann-gruppen, som kreves for den første derivatisering av den fi-lter med en sammensetning av lektiner 12. Til slutt, Thomas-Oates Gruppen foreslo en semi-kvantitativ metode, Filter Aided N -Glycan separasjon (FANGS), som utnyttet den smale sammensetning størrelsen på glycospace 13. Avhengig av molekylvekt cut-off-filter, ble små forurensninger først vasket til avfall, og deretter N--glycans ble spaltet og eluert. Deglykosylert proteiner forblir på filteret i denne protokollen, og kan utsettes for på-linje FASP.
Identifikasjon og kvantifisering av glykaner ved elektrospray ionisering (ESI) MS krever off-line separasjon av (delvis) oppløsning av isomerer og derivatisering for deteksjon av lav-artene. Merking i individualitet når normal med sukker hydrazide tags strategi overfører kompatibilitet med revers-fase væskekromatografi (RPLC) 14,15. Den 4-fenetyl-benzohydrazide (P2PGN) hydrofob tag formidler hydrophilicity av glykaner, ENHsering ionisering av i gjennomsnitt fire ganger 16. Selv om andre teknikker så som permethylation 17 eller amin-reaktive kjemikalier tagging 18, gir tilsvarende fordeler, i hydrazidet reaksjonen er glykaner omsettes 1: 1 støkiometrisk i lettvinte forhold. Relativ kvantifisering oppnås ved tandem analyse av prøver derivatisert med native (NAT) eller 13 C 6 stabile isotopen etiketter (SIL).
Følgende metode utvikler FANGS for plasma applikasjoner og par den til P2GPN hydrofobe tag for nøyaktig relativ kvantifisering. Videre ble det utformet for å utføre shot-gun proteomikk, deamidering profilering og kvantitative glycomics på en enkelt porsjon av prøven, uten å kompromittere integriteten av analysene.
Protocol
1. Protein og glykoprotein Denaturering og Alkylering
- For standard forberedelser, legger 2,5 mL av en 0,1 ug / ul løsning av glykoprotein (f.eks Fetuin eller RNase B) på et 30 kDa eller 10 kDa molekylvekt (MW) cut-off filter.
- For biologiske plasmaprøver, sjekke proteinkonsentrasjonen ved en standard Bradford 19 eller bicinchoninic syre 20 (BCA) proteinanalyse. Fortynn plasma, om nødvendig, med 100 mM ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) i H2O (PNGase Digest buffer) ved en pH av ~ 7 til å inneholde mellom 10-100 mg / ml totalt protein. Belastning 2,5 pl plasma (25-250 ug protein) på et filter.
Merk: Denne protokollen har bare vært testet på plasma fra blodprøver tatt i nærvær av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
- For biologiske plasmaprøver, sjekke proteinkonsentrasjonen ved en standard Bradford 19 eller bicinchoninic syre 20 (BCA) proteinanalyse. Fortynn plasma, om nødvendig, med 100 mM ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) i H2O (PNGase Digest buffer) ved en pH av ~ 7 til å inneholde mellom 10-100 mg / ml totalt protein. Belastning 2,5 pl plasma (25-250 ug protein) på et filter.
- Tilsett 2 ul av 1 M ditiotreitol Solution (DTT) til hver prøve i filteret.
- Fortynne prøven med 200 ul PNGase fordøye buffer.
- Cap filter prøverøret og lett vortex, være forsiktig for ikke å forstyrre filteret fra sitt sete. Inkuber prøven ved 56 ° C i 30 minutter for å denaturere proteiner og glykoproteiner.
- For å alkylere prøvene, tilsett 50 pl 1 M Jodacetamid, for å gi en endelig konsentrasjon på ~ 200 mM, og inkuber ved 37 ° C i 60 min.
MERK: Hvis proteomikk analyse ikke er ønsket, kan trinnet 1,5 hoppes over. - Konsentrer den denaturerte glykoproteinet på filteret ved sentrifugering prøver ved 14 000 xg i 40 min. Kast strømme gjennom.
2. N -bundne Glycan Enzymatisk spalting
- Vaske prøven med 100 mL PNGase fordøye buffer. Konsentrer glykoproteinet på filteret ved 14 000 xg i 20 min og kast strømme gjennom.
- Gjenta vasketrinn og konsentratet to ganger, til et totalt tre ganger, og ga et konsentrat i filter dødt volum (~ 5 mL). kast alleflyte gjennom.
- Forkast oppsamlingsbeger når vaskinger er fullstendige. Samle alle fremtidige utvasking og vasker i en ny oppsamlingsbeger.
MERK: PNGase fordøye buffer i H 2 18 O kan brukes under PNGase F fordøyelsen steg for stabile isotoper merking av de-glykosylert asparagin nettsteder, som blir kjemisk deamidert.
- Tilsett 2 mL av glycerol-fri PNGase F (75.000 x enheter / ml) for å filtrere etter overføring til en ny oppsamlingsbeger. Legg 98 mL av PNGase fordøye buffer, og bringer totalvolumet til 100 ul, og forsiktig pipettere opp og ned på filteret, for å blande. Enzymatisk fordøye glykaner under betingelsene i trinn 2.2.1, 2.2.2, OR 2.2.3.
MERK: Tre metoder for deglykosylering av proteiner kan anvendes. For utelukkende glycomics analyse (ingen proteomikk), er den lange inkubasjonstiden i trinn 2.2.1 anbefales. For glycomics og proteomikk forskning, trinn 2.2.2 og 2.2.3 vil produsere høykvalitets peptider med minimal non-specific deamidering.- Glycomics kun fordøyelse protokoll (18t): Inkuber prøvene ved 37 ° C i 18 timer til enzymatisk å spalte alle N -glycans.
- Spike-i fordøyelsen protokoll (SPI): Inkuber prøvene ved 50 ° C i 2 timer. Arbeider hurtig, fjerner prøver og pigg i ytterligere 2 ul av glycerol-fri PNGase F (75.000 x enheter / ml). Lett vortex prøvene for 1-2 sekunder for å blande. Inkuber prøvene ved 50 ° C i ytterligere 2 timer.
- Mikrobølgeovn fordøyelsen protokollen (MD): Plasser prøver i et mikrosentrifugerør flytende rack. Float prøver i en 1-liters begerglass fylt med 1 liter deionisert (DI) vann. Plasser begerglasset i sentrum av en mikrobølgeovn (950 W) med en roterende plate. Mikrobølgeovn ved 60% effekt (570 W) i 5 minutter. Å kjøle, fjerne prøver og holde ved romtemperatur i 2 min. Deretter mikrobølgeovn for ytterligere 5 minutter ved 60% effekt.
MERK: Mikrobølgestrøminnstillingene må justeres basert på maksimal effekt av mikrobølgeovn.Gjennomsnittlig effekt bør holdes konstant mellom modellene.
3. Eluering av N -glycans
- Eluere glykaner ved sentrifugering av prøven ved 14 000 xg i 20 min ved 20 ° C.
- Tilsett 100 ul av PNGase fordøye buffer til filteret og sentrifuger ved 14 000 xg i 20 min ved 20 ° C. Samle vaske inneholder eventuelle gjenværende N -bundne glykan, i det samme oppsamlingsbeger som elueringsmiddel. Gjenta to ganger. Fjern filter og plass i ny oppsamlingsbeger.
- Inkuber glykan prøvene i -80 ° C fryser inntil frosset (30-60 min). Tørr til fullførelse, ved romtemperatur i vakuum konsentratoren (4-6 timer).
MERK: N -glycans kan lagres ved -20 ° C i inntil seks måneder før derivatisering.
4. Protein FASP Fordøyelse
MERK: Hvis proteomikk eller deamidering nettstedet analyse ikke er ønskelig, kan § 4 protokollen hoppes over.
- skyll than filter, inneholdende de deamiderte peptider, med 400 ul av 8 M urea-buffer. Cap de oppsamlingsbeger og lett virvle å blande. Konsentrer på filteret ved 14 000 xg i 15 min. Kast all gjennomstrømning.
- Gjenta trinn 4.1 to ganger til, for totalt tre vaskinger urea buffer.
- Skyll filteret, som inneholder de deamiderte peptider, med 400 ul av 2 M urea, 10 mM CaCl2-buffer (trypsin fordøye buffer). Cap de oppsamlingsbeger og lett virvle å blande. Konsentrer på filteret ved 14 000 xg i 15 min. Kast all gjennomstrømning.
- Gjenta trinn 4.1 ytterligere to ganger, for totalt tre trypsin fordøye buffer vasker.
- Forkast oppsamlingsbeger når vaskinger er fullstendige. Samle alle fremtidige utvasking og vasker i en ny oppsamlingsbeger.
- Tilsett 50 ul porcint modifisert trypsin i en 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein (vekt / vekt) henholdsvis forholdet for oppdagelse eller kvantitative proteomics eksperimenter.Cap de oppsamlingsbeger og lett virvle å blande.
- Inkuber prøvene ved 37 ° C i 2 timer. Arbeid raskt, fjerne prøver og pigg i ytterligere 50 mL av trypsin på 1:50 eller 1: 5 trypsin: protein ratio. Lett vortex prøvene for 1-2 sekunder for å blande. Inkuber prøvene ved 50 ° C i ytterligere 2 timer.
- Eluere peptidene ved spinning ved 14 000 xg i 15 min.
- Skyll de gjenværende peptider fra filteret med 400 ul 1% maursyre og 0,001% Zwittergent 3-16 (quench-buffer). Eluering av filteret ved spinning ved 14 000 xg i 15 min.
- Kvantifisere peptid-konsentrasjonen i prøvene ved Bradford 19 eller BCA-analyse 20.
- Inkuber peptid-prøver i -80 ° C fryser inntil frosset (30-60 min). Tørr til fullførelse, ved romtemperatur i vakuum konsentratoren (4-6 timer).
MERK: Tørket peptider kan lagres ved -20 ° C i inntil tre måneder. - Suspender tryptiske proteiner rett før Liquid-kromatografi-massespektrometri (LC-MS-analyse) i 2% acetonitril, 98% H2O og 0,1% maursyre (mobil fase A) til ønsket konsentrasjon. Tryptiske peptid konsentrasjoner fra 2,5 mL plasma range 100-300 ng / mL.
5. Derivatisering av N -bundne Glykaner med Hydrofobe hydrazin tagger
- Rekonstituer tørket tunge (SIL) eller lys (NAT) P2GPN reagenser i 1 ml 75:25 MeOH: eddiksyre (Derivatisering oppløsning), til en sluttkonsentrasjon på 0,25 mg / ml. Reagenser vil ta opptil 10 minutter å full oppløse. Omfattende vortex å sikre fullstendig oppløsning.
Merk: I tilfelle denne derivatiseringen protokollen brukes med standard N -glycans, versus rensede glykaner, det molare forhold mellom P2GPN: glykan bør være omtrent (og ikke mindre) enn 17: 1. - Tag tørket N -glycans med 200 mL (50 mikrogram) av SIL eller NAT P2GPN reagens. Pipetter opp og ned for å suspendere tørkede glykaner. Vortex samples og deretter spinne ned prøver for ~ 5 sek på en benk-top sentrifuge.
- Reagerer de glykaner med reagenset i 3 timer ved 56 ° C.
- Umiddelbart flytte glykaner fra inkubatoren til vakuum konsentrator. Tørr til ferdigstillelse ved 55 ° C (3-5 timer).
MERK: Dette trinnet slukker derivatisering reaksjon; prøven må være helt tørre for å unngå kryss-reaktivitet i de påfølgende trinn.
MERK: Tørket, tagget prøvene kan lagres ved -20 ° C i inntil seks måneder. - Resuspender merket N -glycans i 25-50 pl av H2O akkurat før LC-MS-analyse. Pipetter opp og ned for å sikre N -glycans er fullt oppløst.
MERK: Volumet for resuspendering er avhengig av utgangskonsentrasjon av glykoprotein, som kan beregnes ut fra startproteinkonsentrasjon. Imidlertid vil området variere fra prøvetype, og bør være individuelt optimalisert. - Sentrifuger prøvene ved 14 000 xg i 5 min. Fjern supernatant, være forsiktig med å la spissen av pipetten berøre bunnen av sentrifugerøret.
Merk: Overskudd av merkelappen kan ikke være synlig for øyet, men vil bli redusert ved sentrifugering. - Kombiner et par av NAT og SIL prøver, hvis det er ønskelig for relativ kvantifisering, i et 1: 1 forhold for tandem analyse.
6. Ultra-høytrykks-væskekromatografi og massespektrometri-analyse
MERK: LC og MS forholdene som er beskrevet for en Easy NLC-1000 og et Q Exactive High Field, henholdsvis, ble optimalisert in-house for proteomikk analyse og for sukker analyse 21. Disse forholdene kan tilpasses andre ultra-høye trykk- eller nano LC-systemer og andre høyt oppløsningsevne massespektrometre, men kan kreve små endringer. Bruk av høy oppløsningsevne massespektrometri er nødvendig for glycan identifikasjon og deamidering analyse 22,23.
MERK: Trinn 06.01 til 06.03 kan være skipped hvis en passende revers-fase kromatografi eller hydrofile interaksjoner kommersiell felle og kolonnen blir brukt.
- Syntetisere en fritte på 100 uM ID kapillær ifølge Meiring et al. 24 for bruk som en felle.
- Pakk fellen under press med 2,6 mikrometer, 100 A, C 18 emballasje og kuttet til en lengde på 5 cm.
- Pakk en 75 mikrometer ID emitter kolonne under press med 2,6 mikrometer, 100 A, C 18 emballasje og kuttet til en lengde på 30 cm.
- Forbered to forskjellige LC-MS metoder for proteomikk (6.4.1) og glycomics (6.4.2) arbeidsflyt.
Merk: Protein og sukkervareprøver kan kjøres på den samme fellen / kolonne oppsett i hvilken som helst rekkefølge.- For proteinanalyser, injiserer ~ 400 ng av protein på kolonnen i mobil fase A (MPA). Kjør prøven ved 300 nl / min, i henhold til tabell 1, med et 1 ul pre-kolonne likevektsinnstilling (500 bar) og en 5 pl analytisk kolonne ekvilibrering(500 bar). Ionisere proteiner under de MS betingelsene gitt i Tabell 2.
- For glykan analyse, injisere 5 mL av resuspendert, P2GPN merket NAT / SIL ekvimolare prøver på kolonnen. Kjør prøven ved 300 nl / min, i henhold til tabell 3, med en 2 ul pre-kolonne likevektsinnstilling (500 bar) og en 5 pl analytisk kolonne likevektsinnstilling (500 bar). Ionisere glykaner under MS vilkår som er fastsatt i tabell 4.
| Tid | % MPA | % MPB |
| 0 | 100 | 0 |
| 5 | 98 | 2 |
| 105 | 80 | 20 |
| 135 | 68 | 32 |
| 136 | 5 | 95 |
| 151 | 5 | 95 |
| 152 | 100 | 0 |
| 167 | 100 | 0 |
Tabell 1. LC-betingelsene for proteomikk analyse. En gradient-eluering med mobil fase B (MPB, 98% acetonitril, 2% H2O, 0,1% maursyre) ble utført for å eluere peptidene for shot-gun proteomforskning, data-avhengig-innhentings , MS eksperimenter.
| MS 1 Parametere | |
| Mass Range (Th) | 375-1500 |
| oppløsning | 120000 |
| AGC | 1 × 10 6 |
| Max ionisering Tid | 30 |
| S-Lens FR nivå | 55 |
| capillary Temp (° C) | 300 |
| spray Spenning | 1,75 |
| MS 2 Parametere | |
| Oppkjøp Type | Top20 |
| oppløsning | 15000 |
| AGC | 1 × 10 5 |
| Max ionisering Tid | 30 |
| underfill Ratio | 2% |
| Isolasjon Window (Th) | 1.4 |
| Charge State Utelukkelse | 1 |
| Normalisert Kollisjon Energy | 27 |
| Utelukkelse Tid (s) | 20 |
Tabell 2: MS vilkår for proteomikk analyse Parametrene for electrospray ionisering, MS en anskaffelse, og MS to oppkjøp i et orbitrap instrument ved hjelp av høyere energi dissociatio.n (HCD) er gitt.
| Tid | % MPA | % MPB |
| 0 | 95 | 5 |
| 1 | 70 | 30 |
| 41 | 60 | 40 |
| 46 | 37 | 63 |
| 47 | 10 | 90 |
| 55 | 10 | 90 |
| 56 | 95 | 5 |
| 66 | 95 | 5 |
Tabell 3:. LC-betingelsene for glycan analyse En gradienteluering ble utført for å eluere hydrazidet merket N -glycans for MS-analyse.
| MS 1 Parametere | |
| Mass Range (Th) | 600-1900 |
| oppløsning | 60000 |
| AGC | 5 × 10 5 |
| Max ionisering Tid | 64 |
| S-Lens FR nivå | 65 |
| Capillary Temp (° C) | 325 |
| spray Spenning | 1,75 |
| MS 2 Parametere | |
| Oppkjøp Type | Top12 |
| oppløsning | 15000 |
| AGC | 5 × 10 4 |
| Max ionisering Tid | 100 |
| underfill Ratio | 1% |
| Isolasjon Window (Th) | 1.4 |
| Fast Første Mass 125 | |
| Trappet Normalisert Kollisjon Energy | 10/20/30 |
| Utelukkelse Tid (sek) | 15 |
Tabell 4: MS forhold for hydrazide merket N -glycan analyse Parametrene for electrospray ionisering, er MS en anskaffelse, og MS to oppkjøp i et orbitrap instrumentet med høyere energi dissosiasjon (HCD) gitt..
7. proteomikk og Deamidering Analysis
- Identifisere proteiner / peptider ved hjelp av standard bioinformatikk søkeverktøy.
Merk: Følgende analyse protokollen er designet ved hjelp av Swiss-Prot / TrEMBL databaser i UniprotKB og søke via SEQUEST i Proteome Discoverer 1.4-programvaren, men protokollen kan være direkte oversettes til alle protein søk og scoring motoren med et GUI programvare. kan nås alle kommandoer gitt nedenfor i programvaregrensesnitt via rullegardinmenyer.- <li> Opprett eller last ned en organisme passende proteinsekvens database fra genomisk data eller tilgjengelige proteomet databaser som beskrevet av Apweiler et al. 25
Merk: Vanlige proteomet databaser inkluderer Swiss-Prot, TrEMBL, og NCBI, men kan bygges fra interne data også. - I programvaren, velger en database søkemotor og velger parametere i henhold til kvaliteten på data innhentet og rigorousness av ønsket søke, som beskrevet av Perkins et al. for MASCOT 26 eller Eng et al. for SEQUEST 27.
- For høy masse nøyaktighet data, angi parametere for søke i programvaren som følger: maks to savnet splittelser, 5 ppm forløper masse toleranse og 0,02 Da fragment masse toleranse (for optimalisert nøyaktig deamidering påvisning 22) og omfatter følgende tryptiske peptid modifikasjoner : "carbamidomethyl (C)" static modifikasjon og "deamidering (I / Q)" og "okseidation (M) "dynamiske modifikasjoner. Ved bruk av 18 O fordøyelse merking, omfatter" deamideringen 18 O (1) "som en ytterligere dynamisk modifisering.
- Søk ved hjelp av den valgte motoren, rå peptid data mot proteinet database (7.1.1).
Merk: Mass toleranser bør være passende for instrumentet brukes, og ikke vilkårlig lav.
Merk: Søkefunksjonen er ferdig automatisk av programvaren ved hjelp av ulike søkemotor spesifikke algoritmer. Trakteren algoritme (MASCOT), SEQUEST, eller andre kombinasjoner av algoritmer er ansatt for å identifisere proteiner fra peptider og å score gyldigheten av treff, mer informasjon om verktøyene som er tilgjengelige er dekket i en anmeldelse fra Gonzalez-Galarza et al. 28,29. Avhengig av programvaren, kan ytterligere søkeparametre må velges i henhold til brukerens skjønn.
- Eksportere identifisert peptider for manuell utvelgelse og Fürther analysen.
8. Glycan Relativ kvantifisering
Merk: Følgende identifisering og kvantifisering ble gjennomført ved hjelp av Xcalibur programvare. Men all programvare som analyserer rådata og automatisk integrerer kromatografiske topper kan erstattes.
- Generere en teoretisk oversikt over sukker komposisjoner fra de biologisk mulige kombinasjoner av heksoser, deoksy-heksoser, hexosamines, sialinsyrer, og andre saccharides. For dette formål har en human glykan database blitt publisert av Walker et al., 15 og kan brukes som den er. For teoretiske databaser, må artsspesifikke biologiske begrensninger pålegges den kombinatoriske plass, og disse reglene er beskrevet av Kronewitter et al. 31.
- Beregn ved sukker monoisotopic massene (M) fra atommasser for hver komposisjon for protonladetilstander + 1-3. Endre monoisotopic massene til å inkludere tillegg av NAT (254,14191 g / mol) eller SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag.
- Åpne "Processing Setup" -programmet fra veikartet utsikt i Xcalibur. Sett opp en prosesseringsmetode som nettopp er beskrevet i Supplemental Materiale fra Walker et al., 15 ved hjelp av en liste generert i trinn 8,2 inneholdende de teoretiske monoisotopic massene for [M + H] 1 +, [M + 2H] 2+, og [ M + 3H] 3+ arter.
Merk: For å bekrefte sukker identitet utover nøyaktigmasse, for NAT / SIL tosidig går, sjekk at NAT og SIL N -glycan parene coelueres med samme oppholdstid. Kvalitativt, tverr validere identifikasjoner med MS 2-spektra, som må inneholde topper som tilhører oksoniumion serie 32. - Eksportere den integrerte, hentet ion kromatogram (XIC) områder til Excel for å få SIL og NAT Forekomsten som nøyaktig beskrevet i Supplemental Materiale fra Walker et al. 15
- I Excel, program cellene i en ny kolonne for å beregne korreksjons for molekylvekten overlappingen ved å justere SIL overflod i henhold til ligningen publisert av Walker et al 1 5.:
,
der A er monoisotopic topp og teoretiske isotopen overlapping,
Kan være uavhengig beregnes pr sammensetning. - I en annen kolonne, program cellene til å normalisere NAT og SIL kanaler ved hjelp av ligningen for den totale normalisert sukkerfaktor (TGNF), per spekteret, som beskrevet av Walker et al en 5.:
,
hvor N er antallet av N -glycans over grensen for kvantifisering. - I en ny kolonne, program cellene for å ta forholdet mellom SIL: NAT-glykaner (eller vice versa) for å beregne den fold-endringen i konsentrasjonen mellom de to prøvene.
, 
Kan være uavhengig beregnes pr sammensetning. 
, Representative Results
Figur 1:. Ordningen med hoggtenner-P2GPN hydrofob merking kombinert metode (metode A) for kombinert proteomikk og glycomics analyse er gitt trinn som skiller mellom glycomics kun prosessering og tandem glycomics og proteomikk analyser, med glykosyleringsstedet identifikasjon, er uthevet. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den in-line proteomikk og glycomics, ble filter-baserte P2GPN hydrofobe tagging metode (metode A) validert for identifisering, kvantifisering og molekylvekt skjevhet ved hjelp av samle høne plasmaprøver (figur 1). For utelukkende glycomics eksperimenter, -glycans inter-sammenligninger i Forekomsten av N hentet ved metodeA til carbograph SPE (gullstandard, Metode B) ble gjort (figur 2). Det var ingen signifikante forskjeller i Forekomsten av glykaner mellom de to metodene. Den intra-variasjon ble også vurdert ved å kvantifisere den SIL: NAT-forhold på glykaner utvunnet etter samme metode. Loggen 2 -distributions av begge metodene var Gaussian, sentrert på null, og ikke signifikant forskjellig (figur 3A-B). Molekylvekt i området mellom de to protokollene helt overlappende, noe som antyder at filteret ikke diskriminere N -glycans basert på molekylvektområde og hydrofilisitet (figur 4).
Figur 2: En ekvimolar blanding av NAT og SIL N -glycans ekstrahert ved metode A eller metode B ble fremstilt fra 2,5 mL av høne plasma (N = 4) Prøvene ble anal.yzed ved UPLC-MS i henhold til de anbefalte parametre som foreslås i avsnitt 6. Forekomsten for hver glykan, i hvert NAT / SIL kanal, ble beregnet ved å integrere arealet under ekstrahert ion kromatogrammet (MMA = 3 ppm), korrigere for den molekylære vekt overlapping, og justering av TGNF. Disse forholdene er vist med sine vanlige feil. De Forekomsten av Metode B: Metode A N -glycans var ikke signifikant forskjellige (p> 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Den intra-variabilitet i (A) Metode A (N = 133) eller (B) Metode B (n = 123) strategier ble sammenlignet. NAT og SIL ekvimolare blandinger av N -glycans, fra samme utvinning ordningenBle analysert over tre tekniske replikater. Loggen 2 -distributions var sentrert på null, og var ikke signifikant forskjellig mellom de to arbeidsflyter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Molekylvekt serier av glykaner fra hver strategi ble sammenlignet. De to arbeidsflyter ga glykaner som spenner over samme molekylvekt i området. N -glycans oppdaget i en protokoll versus den andre falt like over deteksjonsgrensen (1 × 10 5 overflod) og gjenspeiler ikke systematisk skjevhet. Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
(tabell 5). Vår typiske 18 hr filter basert PNGase F fordøyelsen, etterfulgt av FASP trypsin digest (Std protokoll) resulterte i betydelige nivåer av ikke-spesifikke deamidering, som kan forstyrre med identifisering av glycosites. Derfor ble en fremgangsmåte som utnytter en kortere inkuberingstid ved forhøyet temperatur (50 ° C) og en PNGase F-pigg i trinn (SPI-protokoll) utforsket som et alternativ, sammen med en mikrobølge fordøyelse protokoll (MD-protokollen), for å minimere ikke- spesifikk deamidering. De glykaner observert i de nye fordøyelsen metodene var ikke signifikant forskjellig i komposisjoner eller hopetall fra standard 18 timer, 37 ° C filter PNGase F digest (
| proteiner | peptider | deamiderte peptider | Glycosites | glykoproteiner | |||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | + | - | + | - | + | - | ||||||||||||||||
| FASP | 3083 | 795 | 5 | 5 | |||||||||||||||||||||
| 18t | 217 | 304 | 6013 | 5086 | 1029 | 733 | 257 | 24 | 112 | 18 | |||||||||||||||
| MD | 270 | 266 | 5190 | 5125 | 465 | 455 | 254 | 8 | 102 | 7 | |||||||||||||||
| SPI | 281 | 288 | 4729 | 4482 | 602 | 573 | 232 | 10 | 145 | 8 | |||||||||||||||
. Tabell 5: Sammenligning av proteomikk data fra en standard trypsin fordøye versus in-line FANGS-P2GPN tagging metode ble gjort forberedelser ble utført med (+) og uten (-) PNGase F for å bestemme bakgrunnstall for uspesifikk deamidering og anslag glycosite falske positiver. Proteiner ble identifisert med 1% falsk funnrate (FDR); Peptidene ble filtrert basert på "high" peptid tillit Proteome Discoverer 1,4 (q <0,01); glycosites ble identifikasjoned basert på unike sekvenser som inneholder deamidering av den konserverte glykosylering motiv (NXS / T); og glykoproteiner ble definert som identifiserte proteiner som inneholder minst en identifisert glycosite.
Figur 5: Forkortet protokoller for glykaner ble utviklet for å minimere deaminering i prøvene, og sammenlignet med 18 timer FANGS PNGase F fordøye. De midlere forskjeller i Forekomsten var 10% og 5% for MD (2.2.3) og SPI (2.2.2) protokoller, respektivt. Av de 48 glykaner identifisert, vises 90% mindre enn 1,5 ganger variasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid (50%) | Sigma Aldrich | 45754 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916 | Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1) |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable |
| DL-Dithiothreitol, 1 M in solution | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Easy-nLC 1000 | Thermo Scientific | LC120 | Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Waters). |
| Floating Tube Rack | TedPella | 20831-20 | |
| Fetuin | New England Biolabs | P6042S | |
| Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens | Fisher Scientific | 11-690-625F | Alternate incubators that reach 56 °C are suitable |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| GE Microwave Oven | General Electric | 57B5 E82904 | Any microwave with adjustable power settings is suitable |
| INLIGHT Glycan Tagging Kit | Cambridge Isotope Laboratories | GTK-1000 | The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent. |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | A3221 | |
| Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase | Phenomenex | Bulk Media | Alternative: Any C18 stationary phase 5 mM |
| Mascot Daemon Software and Server | Matrix Science | Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific) | |
| Methanol, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| PicoFrit Self-Pack Column: 360 μm, OD 75 μm ID, 15 μm tip, non-coated, 5 per box, 50 cm | New Objective | 1 5 PF360-75-15-N-5 | |
| PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml | New England BioLabs | P0705L | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Alternate high mass accuracy (5 ppm) mass spectrometers will provide similar data | |
| RNase B | New England Biolabs | P7817S | |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma Aldrich | T6567-5X | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | Alternate vacuum concentrators are suitable |
| Vivacon 500 30 kDa Filters | Sartorius Stedim Biotech | VN01H22 | Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096) |
| Water, HPLC grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Water, 18O | Cambridge Isotope Laboratories | OLM-240-97-1 | The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence |
| Xcalibur 2.0 | Thermo Scientific | XCALIBUR20 | |
| Zwittergent Test Kit | Merck Millipore | 693030 |
References
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
- Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
- Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
- Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
- Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
- Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
- Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
- Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
- Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
- Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
- Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
- Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
- Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
- Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
- Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
- Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
- Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
- Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
- Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
- Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
- Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
- Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
- Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
- Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
- Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
- Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).
