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Chemistry

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

doi: 10.3791/53737 Published: April 13, 2016

Introduction

metalli essenziali svolgono un ruolo fondamentale nelle funzioni biologiche normali, tra cui percorsi di messaggistica secondarie, percorsi del metabolismo e le funzioni degli organelli. Il 30% di tutte le proteine ​​sono pensato per essere metalloproteine ​​1 e il 50% di tutti gli enzimi 2. Metalloenzimi utilizzano questi metalli in tracce come cofattori di catalizzare reazioni chimiche, stabilizzare la struttura delle proteine, e per i ruoli di regolamentazione, come messaggeri secondari. Alcuni degli oligoelementi più studiati con riferimento a neurodegenerazione sono rame, ferro e zinco 3. Si pensa di essere coinvolti in molte vie malattia in cui da dyshomeostasis può avere effetti negativi. Per esempio lo stato di metallo di superossido dismutasi (SOD) direttamente gli impatti del ciclo di vita e il fenotipo dei modelli di topi transgenici di tipo familiare di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 4. Nella malattia di Alzheimer, metalloproteomics tecniche sono state utilizzate per scoprire una diminuzione dello stato metallico di transferrina in pLasma 5. Questi studi evidenziano le importanti metalloproteine ​​ruolo possono giocare nella malattia.

Lo studio di metalloproteine ​​direttamente dai tessuti biologici è un campo in via di sviluppo. Anche se alcuni metalloenzimi sono stati caratterizzati, la maggior parte rimane ancora indefinita o sconosciuti 6. Una delle principali sfide in metalloproteine ​​di misura è l'obbligo di mantenere lo stato nativo della proteina 7. Classica bottom-up tecniche di proteomica si basano sulla digestione delle proteine ​​in peptidi. Questo processo interrompe l'interazione non covalente di metalli e loro proteine. Quindi, nessuna informazione sullo stato di metallo di una proteina è guadagnato.

Un modo per superare questo problema è quello di utilizzare la cromatografia dimensione esclusione in coppia con plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa 8,9 (SEC-ICP-MS). Questo genera informazioni sulla dimensione approssimativa della proteina così come tutti i metalli che sono assocIATED con esso 10. Inoltre, l'esclusione dimensioni è una delicata tecnica cromatografica che può preservare lo stato nativo di un complesso enzimatico o proteina-proteina. Un vantaggio di utilizzare plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (ICP-MS) è la natura quantitativa della tecnologia. Utilizzando un insieme di standard metalloproteine ​​è possibile fornire quantificazione assoluta di metalloproteine ​​da campioni biologici 9,11. Questo risultato è ottenuto generando una curva standard iniettando metalloproteine ​​noti in un range di concentrazioni di metalli.

Questo protocollo mostra un esempio di come questo può essere realizzato per una varietà di standard metalloproteine. In questo articolo ci proponiamo di creare curve standard per i metalli che sono in gran parte studiati nei campi biologici tra cui ferro (Fe), rame (Cu), zinco (Zn), iodio (I), e il cobalto (Co).

Protocol

1. Preparazione di buffer e Campioni

  1. Preparare 500 ml di tampone, 200 mM di nitrato di ammonio pH 7,6 - 7.8 (pH regolato con idrossido di ammonio (NH 4 OH)) con cesio (Cs) e antinomy (Sb) aggiunto ad una concentrazione finale di 10 ppb. Utilizzare cesio e antinomia come standard interni per monitorare qualsiasi deriva nella risposta di ICP-MS. tampone filtro prima dell'uso attraverso un filtro di 0,22 micron.
  2. Preparare campioni a seconda del tipo di campione: liquido, tessuti o coltura cellulare.
    1. Per i campioni che richiedono omogeneizzazione (ad esempio, tessuti o cellule), assicurarsi che non contengono detersivo. Utilizzare i buffer Tris per la preparazione del campione. In alternativa, utilizzare tamponi fosfato, ma possono influire negativamente sul metalloproteome nel tempo o con cicli di gelo-disgelo 12.
    2. Omogeneizzare campioni di tessuto o di colture cellulari di Dounce manuale o sonicazione per 5 min con Tris tamponata salina (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM di cloruro di sodio(NaCl) + acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) inibitori della proteasi libere).
    3. Chiarire omogeneizzati per centrifugazione a 16.000 xg per 5 min. Raccogliere il surnatante risultante. I campioni a 4 ° C.
      Nota: Tutti i campioni devono essere centrifugati prima di caricare nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) fiale per evitare che le particelle di bloccare la colonna dimensione esclusione cromatografia (SEC).
  3. Normalizzare la quantità totale di proteine ​​caricate sulla colonna di tutti i campioni. Determinare le concentrazioni di proteine ​​a 280 nm utilizzando un micro volume di spettrofotometro UV 13. Carico tra 20 e 150 mg di proteine. Utilizzare volumi tipici iniezione vanno da 2 - 80 microlitri seconda della concentrazione del campione.
    1. Pulire il braccio del campione del micro spettrofotometro volume di UV con acqua distillata prima di caricamento del campione. Il braccio del campione è dove i campioni di proteine ​​vengono caricati.
    2. Vuoto lo strumento contro 2 ml di thtampone campione e. Poi, carico 2 ml di ogni campione sul braccio e misurare l'assorbanza a 280 nm.
    3. Determinare le concentrazioni. Per i campioni proteici grezzi, utilizzare un coefficiente di estinzione di 1 Abs = 1 mg / ml. Per determinare la concentrazione di proteine ​​nei campioni, utilizzare la legge di Beer-Lambert, A = ε xlxc, dove A è l'assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, l è la lunghezza del percorso in centimetri e c è la concentrazione.

2. Analisi di massa di metalloproteine ​​Standards Utilizzando plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa

  1. Warm-up e accordare lo strumento utilizzando i protocolli del produttore.
  2. Una volta strumento viene riscaldato e messo a punto, eseguire massa ICP-MS.
    Nota: Le soluzioni madre di metalloproteine ​​purificati in genere bisogno di essere diluito prima della misurazione. La concentrazione di metallo dello standard può essere stimata dalla proteina nota: stochiometries metallo e concentrazione di proteine ​​stimatozione. Questa informazione può essere utilizzata per determinare la diluizione che sarà opportuno rientrare nell'intervallo della curva standard generata.
    1. Diluire standard metalloproteine, tireoglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12, per garantire che rientrano nel range di 0 - 500 mg / L, con acido nitrico 1%. Per raggiungere gli standard all'interno di questo intervallo, non utilizzare diluizioni superiori a 1 a 20. Effettuare diluizioni seriali in acqua per diluire le scorte prima di questo, se necessario.
    2. Impostare l'ordine di iniezioni. Innanzitutto, analizzare i sette livelli di taratura, concentrazioni comprese tra 0 - 500 mg / L, seguiti dalle norme metalloproteine. I sette livelli di calibrazione sono 0, 1, 5, 10, 50, 100 e 500 mg / L.
    3. Selezionare gli elementi di interesse. Qui, utilizzare Fe, Cu, Zn, Co e io, in quanto sono gli elementi che le norme proteiche sono tenuti a. Selezionare gli elementi nel metodo dell'acquisizione aprendo la scheda selettore di elementi e aggiungendo il eleme NTS e le rispettive masse isotopi che devono essere analizzati.
    4. Effettuare analisi campione con lo strumento e il software dello strumento crea automaticamente le curve di calibrazione per ciascuno degli elementi oggetto di analisi. Le curve di calibrazione sono create dal software tracciando il conteggi / sec del metallo rilevato contro la quantità di metallo che lo standard è destinato a contenere, in mg / L. Utilizzare le curve di calibrazione per determinare la concentrazione di metallo nei campioni sconosciuti.
      Nota: Usando la curva di calibrazione, il software determina la concentrazione di metallo in ciascuna soluzione standard metalloproteine.
    5. Dai risultati delle analisi di massa, generare standard metalloproteine ​​che includono i tre elementi in tracce più abbondanti nei tessuti di mammifero usando una miscela di Cu, Zn superossido dismutasi (SOD) diluito a 200 mg / l di rame e zinco e ferritina (FTN) ad una finale concentrazione di 2.000 mg / L di ferro.
jove_title "> 3. Setup HPLC del sistema e Size Exclusion Equilibration cromatografia Colonna

Nota: Questa sezione deve essere eseguita in parallelo al precedente, poiché entrambi necessari circa 1-1,5 ore per completare.

  1. Pompe di spurgo HPLC con tampone fatta allo step 1.1 e spurgare le pompe per 5 min ad una velocità di flusso di 5 ml / min.
  2. Una volta che il sistema viene spurgato, impostare la portata a 0,1 ml / min e collegare la colonna di esclusione dimensionale (4,6 x 300 mm, 3 micron, 150 Å).
    Nota: una connessione bagnata tra il tubo e la colonna evita eventuali bolle d'aria intrappolate in fase durante la connessione della colonna.
  3. Collegare l'estremità opposta della colonna al rivelatore UV impostato per misurare l'assorbanza a 280 nm usando tubo PEEK.
  4. Aumentare gradualmente la velocità di flusso della colonna in passi da 0,05 - 0,1 ml / min fino ad una velocità di flusso finale di 0,4 ml / min è raggiunto. Anche se questo è in corso, controllare i collegamenti dei tubi alla colonna di eventuali perdite. Monitorare la pressionedel sistema per garantire che non superi i requisiti delle colonne osservando la traccia pressione sul cromatogramma nel software.
  5. Lasciare la colonna per equilibrare alla portata richiesta in 5 - 10 volumi di colonna. Dopo che è equilibrato, collegare gli strumenti per consentire l'analisi del campione a verificarsi.
  6. Impostare il metodo HPLC alla pompa tampone A sopra la colonna a 0,4 ml / min per 15 min.

4. creazione e la gestione Size Exclusion - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa

Nota: le procedure operative possono variare tra gli strumenti e modelli. Contatta lo specialista tecnico dello strumento per ulteriori informazioni su come configurare la ICP-MS in uso.

  1. Posizionare la ICP - MS in modalità standby prima di cambiare l'impostazione hardware.
    1. Una volta in modalità standby, spegnere la comunicazione per il campionatore automatico e cambiare l'introduzione del campione di "altro".
      Nota: A seconda del software e duroware configurazione selezionando "HPLC" come fonte di introduzione del campione può essere utilizzato. Contatta lo specialista tecnico strumento per sapere se questa opzione è disponibile.
  2. Utilizzare PEEK tubo (ID 0,13 millimetri) per collegare il flusso in uscita dal rivelatore UV direttamente al nebulizzatore sul ICP-MS.
  3. Potenza backup ICP - MS e lasciare lo strumento si riscaldi per 10 - 20 min.
  4. Dopo il plasma è acceso, collegare il cavo remoto dal ICP - MS al retro del autocampionatore HPLC. Fate questo una volta che il plasma è acceso; altrimenti il ​​sistema HPLC si spegne automaticamente dal momento che la ICP - MS non è acceso.
  5. Modificare il metodo ICP-MS per raccogliere i dati per LC-ICP-MS.
    1. Modificare il metodo di acquisizione da spettro di acquisizione in tempo risolvere (TRA).
    2. Selezionare gli elementi da analizzare, Fe, Cu, Zn, Co, I, nonché qualsiasi altro elemento di interesse, ed i tempi di integrazione impostato (tipicamente tra 0,05-0,3 sec). Dopo che gli elementi di interesse unare scelto, regolare il tempo di acquisizione in base al tempo di funzionamento per la cromatografia (ad esempio, 900 secondi per una corsa cromatografia 15 min).
    3. sintonizzare manualmente la ICP - MS dell'elio sensibilità e collisione cella (He) portate di gas con il buffer cromatografia scorre utilizzando Cs e Sb inclusi nel buffer. Le portate He sono tipicamente ~ 1 ml / min inferiore a quelli utilizzati per l'analisi di massa. Una volta che i conteggi di ioni metallici sono stabilizzati e valori deviazione standard relativa (RSD) sia inferiore al 5%, il sistema è pronto per l'uso.
  6. Fare il campione liste eseguiti sia in HPLC e programmi software ICP-MS. L'elenco esecuzioni campione contiene l'ordine in cui ciascuno dei campioni deve essere iniettato, così come il nome con cui salvare i dati. Controllare che il numero totale di campioni nella partita lista tra i due programmi.
  7. Avviare il lotto di campioni per ICP-MS prima della HPLC, come l'iniezione del campione per HPLC attiverà l'ICP - MS per iniziare a raccoglieredati. Se questo non avviene nell'ordine corretto si tradurrà in dati mancanti.
  8. Genera punti della curva di calibrazione iniettando diversi volumi della SOD e miscela standard FTN da 200 mg / L a 6.000 mg / L iniettato su colonna per Cu e Zn e 2.000 mg / L fino a 60.000 mg / L per Fe. volumi di iniezione vanno da 1 a 30 ml.
    Nota: Questi intervalli di concentrazione comprendono le concentrazioni di Fe, Cu e Zn tipicamente osservati in omogenati complesse. Per i campioni che contengono solo le proteine ​​purificate la portata massima della curva deve essere regolata di conseguenza. Poiché la quantità di metallo associati con la proteina può richiedere un intervallo più piccolo o più grande poiché non vi è meno contaminazione del campione da altri fattori.
  9. Analizzare ciascuno dei coltura di tessuti campioni sconosciuti, plasma o cellule.

5. Analisi dei dati, manipolazione e visualizzazione

  1. Memorizzare i dati di valore separati da virgola (CSV) formato di file e caricare into programmi di elaborazione, come richiesto.
  2. Al fine di controllare per lo strumento deriva, dividere i conteggi per secondo per ogni elemento dai conti al secondo per entrambi Cs o SB.
  3. Generare curve di calibrazione per ciascuno degli elementi.
    1. Determinare l'area sotto il picco del metallo corrispondente al metalloprotein che essa è destinata a per ciascuna delle iniezioni eseguendo l'integrazione dei picchi nel software di analisi dati preferito.
    2. Tracciare l'area sotto il picco del metallo contro l'importo totale del metallo che è stato iniettato nella colonna in ciascuna prova, 200 - 6.000 mg / L per Cu e Zn e 2.000 - 60.000 mg / L per Fe. Eseguire analisi di regressione lineare secondo il protocollo software.
    3. Utilizzare i risultati pendenza dall'analisi di regressione lineare come fattore per convertire conteggi al secondo per pg / sec. Dividere ciascuno dei conteggi per punti dati secondo tutto il cromatogramma dal gradiente del valore della linea.
  4. Grafico i dati inpg / sec contro il tempo cromatogramma. Determinare l'area sotto i picchi di interesse. L'area sotto il picco rappresenta la quantità totale di metallo che la proteina è destinato a, in pg.
  5. Generare una calibrazione basato sul peso molecolare delle metalloproteine ​​conosciuti e il momento in cui essi eluiscano. Usare questo per valutare la dimensione dei picchi di proteine ​​in campioni complessi.

Representative Results

L'uso di standard metalloproteine ​​consente la taratura della colonna esclusione dimensionale. Figura 1A mostra il profilo di eluizione per gli standard tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12 in base al metallo che essi sono tenuti a (Fe, Co, Cu, Zn e I). Figura 1B mostra la curva di calibrazione per la colonna esclusione dimensionale in base al peso molecolare degli standard proteine ​​e il loro tempo di eluizione, presentata nel formato di volume di eluizione (Ve) diviso per il volume vuoto della colonna (Vo). Le proteine ​​utilizzate per generare questa curva standard sono Concanavalina A, conalbumina, ceruloplasmina, ferritina, SOD e tireoglobulina.

La Figura 2A mostra l'eluizione di ferritina su una gamma di 2.000 - 60.000 pg di Fe iniettato su colonna e la figura 2D è l'analisi di regressione effettuata utilizzando pzona eak. Figure 2B e 2C sono i profili di eluizione per Cu / Zn SOD per Cu e Zn e 2E e 2F sono l'analisi di regressione generata utilizzando aree dei picchi. I risultati dell'analisi di regressione sono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi / sec a pg / sec modo la quantità di metallo associati con la proteina può essere determinata quantitativamente. La conversione viene eseguita dividendo il conteggi / sec dalla pendenza della regressione lineare (ad esempio, 334,6 (conteggi / sec) x (sec / pg) di rame).

Come detto, questa tecnica può essere utilizzata per identificare metalloproteine ​​in campioni biologici complessi. Il cervello umano e nel plasma sono stati sottoposti a questa tecnica e le figure 3 e 4, rispettivamente, mostrano i risultati ottenuti. Il cervello umano separati da SEC-ICP-MS è mostrato nelle figure 3A-3C, ciascuna delle quali rappresenta un metallo diverso interesse (Cu, Zn o Fe). Figure 4A-4C mostrano le tracce ottenute quando plasma umano è sottoposto a questa tecnica. La complessità e l'abbondanza del campione avrà un impatto sul numero di picchi che si vedono. Come previsto il plasma è dominato da un paio di metalloproteine ​​tra ceruloplasmina e transferrina.

Figura 1
Figura 1. La calibrazione del Size Exclusion Chromatography - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Utilizzando noto profilo di Metalloproteine ​​(A) eluizione per gli standard di metalloproteine ​​in base alle loro rispettive metalli.. (B) della curva di taratura di peso molecolare per gli standard di proteine ​​tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbumina (iv), Cu / Zn SOD (v) e concanavalina A (vi)."Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Utilizzo della ferritina e Cu / Zn SOD come metalloproteine ​​standard per determinare la quantità di Cu, Fe o Zn associati con Metalloproteine ​​in un campione biologico complesso (A) profilo di eluizione per ferritina nel range di iniezione di 2.000 -. 60.000 mg / L di ferro. (B) e (C) il profilo di eluizione per Cu / Zn SOD nell'intervallo di iniezione di 200 - 6.000 mg / L rispettivamente rame e zinco,. (D), (E) e (F) mostrano i risultati dell'analisi di regressione per i metalli di ferro, rame e zinco, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 3. Cu, Fe e Zn Metalloproteome del cervello umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione degli standard di proteine ​​per ogni metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolare, indicato sotto il grafico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Cu, Fe e Zn Metalloproteome per il plasma umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione delle norme proteiche per ciascun metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolaredicato sotto il grafico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Assicurare lo stato nativo della proteina significa particolare attenzione ai buffer utilizzati e sono necessarie conservazione del campione. Non tutte le tecniche di cromatografia o tecniche di preparazione dei campioni possono essere impiegate. È importante che i buffer utilizzati durante la preparazione del campione e la cromatografia sono privi di chelanti di metalli e utilizzare buffer che imitano le concentrazioni di pH e di sale fisiologico. Altre condizioni da evitare sono il riscaldamento del campione o l'aggiunta di proteine ​​denaturanti (ad esempio, urea). È fondamentale per minimizzare il numero di cicli di gelo-disgelo. La capacità del buffer scelto di legare metalli bivalenti è importante e una ragione che Tris o ammonio nitrato buffer sono scelti fra i respingenti base di fosfato.

La risoluzione e bassa capacità di picco della cromatografia ad esclusione sterica rispetto ad altre forme di cromatografia è un grosso limite di questa tecnica. Tuttavia, la natura gentile di dimensioni esclusione crPHY è importante mantenere lo stato nativo della proteina e quindi preservare i legami metallo-proteina relativamente deboli. Il requisito per mantenere lo stato originario delle proteine ​​richiede una particolare attenzione al trattamento dei campioni anche limitare il numero di cicli di gelo-disgelo, evitando chelanti di metalli (ad esempio, EDTA) o sali caotropici e detergenti.

Questa bassa risoluzione di questa tecnica influenzano la capacità di quantificare la quantità di metallo associato con una proteina specifica se è in un campione complesso come i picchi osservati conterrà più di una proteina. Pertanto, la quantità di metallo determinato con l'integrazione dei picchi sarebbe un'indicazione della quantità totale di metallo associati con tutte le proteine ​​eluendo a questo punto di tempo e non solo una proteina specifica. Per superare questa limitazione della proteina di interesse dovrebbe essere ulteriormente purificato in condizioni native. Ciò consentirebbe per la quantificazione diil metallo associato a questa proteina da segnalare con un più alto grado di Certezza. Un altro potenziale limite di questa tecnica sarebbe la perdita di proteine ​​dovuta al legame reversibile non alla colonna. Al fine di determinare se questo accade un esperimento di recupero deve essere effettuata per cui la quantità di proteine ​​eluizione largo della colonna viene analizzato per determinare se questo corrisponde alla quantità iniettata. Lo stesso può essere fatto misurando il contenuto di metallo del materiale eluizione e il materiale di partenza da massa ICP-MS. Recupero colonna può variare a seconda delle condizioni utilizzate, ma è stato dimostrato che il recupero completo di proteine ​​da una colonna dimensioni esclusione è possibile 9. Pertanto è importante controllare se vi è alcuna perdita nelle condizioni operative utilizzate.

Le modifiche al protocollo possono essere correlati agli standard metalloproteine ​​che vengono utilizzati, così come gli elementi analizzati. Il tipo di metalloproteine ​​standard degli Stati UnitiEd sarà diverso a seconda degli elementi che sono di interesse. Per elementi come Cu, Fe e Zn proteine, SOD e ferritina sono impiegati. Qualsiasi altro metalloprotein che hanno stoichometries noti può essere utilizzato e alcuni esempi sono stati qui mostrato.

Una complicazione maggiore che può derivare dall'uso di questa tecnica è la formazione di cristalli di sale nella torcia della ICP-MS. Per impedire la formazione di cristalli di sale, la torcia viene lavata con acqua distillata ogni 500 - 1,000 ml di tampone che è stato passato attraverso il sistema o quando viene determinato mediante ispezione visiva che la torcia deve essere lavato. Un altro problema che può sorgere è un rapido declino più nella pulizia dei coni campione ed estrazione. Questi devono essere puliti regolarmente seguendo i protocolli del produttore.

La preparazione del campione iniziale è la fase più critica nel protocollo. Se ci sono eventuali modifiche alla proteina - il complesso metallico informazione generato non sarà valida. Questo è uno dei principali limiti della tecnica; inoltre l'uso della bassa risoluzione, colonna esclusione dimensionale produce una vista dettagliata limitata della vera complessità delle metalloproteine ​​in biologia.

La tecnica qui descritta permette l'espansione della conoscenza del metalloproteome di un organismo. analisi Bulk dà solo un'indicazione grezza di modifiche alla quantità di metallo in un campione. Oltre alle considerazioni generali che devono essere presi in considerazione, questa tecnica fornisce uno strumento che può essere usato per quantificare la quantità di metallo associati con proteine ​​e metalloproteine ​​identificazione che differiscono confrontando i tracciati ottenuti. L'uso di questa tecnica può essere utilizzata per identificare le differenze tra stati di malattia. Le metalloproteine ​​identificate possono poi essere ulteriormente studiati per aiutare a determinare il ruolo che svolgono nei processi di malattia. L'applicazione di un trattino ICP-MS ha una crescitafuturo per determinare il ruolo dei farmaci che hanno un eteroatomo come platino, iodio o rame come ICP-MS può essere utilizzato per identificare le proteine ​​che il farmaco si lega.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere il sostegno del programma del Governo del Victoria Operativa Infrastrutture di supporto, il collegamento Progetti Scheme (con Agilent Technologies) Australian Research Council, l'Australian Research Centre Cooperative National Health and Medical Research Council, la banca del cervello vittoriana, per la salute mentale e il Neuroproteomics servizio, struttura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump Agilent G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler Agilent G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat Agilent G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector Agilent G1314E
Agilent 7700 ICP-MS Agilent G3282A
 Ammonium hydroxide trace metal basis    Sigma 338818
 Ammonium nitrate  Sigma  256064 Make fresh 200mM solution on day of experiment
 Antinomy  Choice analytical  10002-3 
 Ceruloplasmin  Sigma
 Cesium  Choice analytical  100011-1 
 Complete, EDTA free protease inhibitors   Roche 11873580001
 Conalbumin  Sigma C7786
 Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)  Sigma L7647
 Cu, Zn Superoxide dismutase  Sigma S9697
 Ferritin  Sigma F4503
 ICP-MS multielemental calibration standards  AccuStandard Made up to required concentrations in 1% nitric acid
 Microvolume UV spectrophotometer  Thermo Scientific
 65% Nitric acid  Millipore 100441 Diluted to 1% for use
 Peek tubing   Agilent 5042-6461
 Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å  Agilent 5190-2508
 Sodium Chloride  Chem Supply SA046
 Tris Hydrochloride  ICN Biomedicals inc.  103130
 Thyroglobulin  Sigma T9145
 Vitamin B12  Sigma V2876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120, (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. e1610 (2009).
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Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).More

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).

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