Introduction
必須金属は、二次メッセンジャー経路、代謝経路と細胞小器官機能を含む通常の生物学的機能、で重要な役割を果たしています。全タンパク質の30％が金属タンパク質1、全ての酵素2の50％であると考えられています。金属酵素は、化学反応を触媒するタンパク質の構造を安定化させるための補因子として、またこのような二次メッセンジャーとして調節の役割のためにこれらの微量金属を使用します。神経変性の点で最も研究微量元素の一部は、銅、鉄、亜鉛3です。これらはdyshomeostasisによって影響悪影響を有することができ、多くの疾患経路に関与すると考えられています。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）に直接影響を与える寿命と筋萎縮性側索硬化症（ALS）4の家族型のトランスジェニックマウスモデルの表現型の金属状態。アルツハイマー病では、metalloproteomics技術は、pにおけるトランスフェリンの金属状態の低下を検出するために使用されていますlasma 5。これらの研究は、金属タンパク質が病気で遊ぶことができる重要な役割を強調表示します。
直接生体組織から金属タンパク質の研究が発展フィールドです。いくつかの金属酵素が特徴づけられているが、大半はまだ特徴付けられていないか、6未知のままです。金属タンパク質を測定する際の主要な課題の一つは、タンパク質7の本来の状態を維持するための必要条件です。古典的なボトムアッププロテオミクス技術は、ペプチドへのタンパク質の消化に依存しています。このプロセスは、金属およびそれらのタンパク質の非共有結合相互作用を破壊します。したがって、タンパク質の金属状態についての情報は得られていません。
質量分析8,9（SEC-ICP-MS） -この問題を克服する一つの方法は、誘導結合プラズマと対にサイズ排除クロマトグラフィーを使用することです。これは、タンパク質のおおよそのサイズに関する情報と同様に連想されている任意の金属を生成し、それ10でiated。また、サイズ排除は、酵素やタンパク質 - タンパク質複合体の本来の状態を維持することができます穏やかなクロマトグラフィー技術です。誘導結合プラズマを使用することの一つの利点 - 質量分析法（ICP-MS）は、技術の定量的な性質です。金属タンパク質標準のセットを使用して、生物学的試料9,11の金属タンパク質の絶対定量を提供することが可能です。これは、金属濃度の範囲にわたって既知の金属タンパク質を注入することによって標準曲線を生成することによって達成されます。
このプロトコルは、これが金属タンパク質標準の様々な達成することができる方法の一例を示しています。本稿では、主に鉄（Fe）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、ヨウ素（I）、及びコバルト（Co）を含む生物学の分野で研究されている金属のための標準曲線を作成することを目指しています。
Protocol
緩衝液および試料の調製
- 緩衝液500mlを、200mMの硝酸アンモニウムpH7.6の調製-セシウム（Cs）及び二律背反（SB）と7.8（水酸化アンモニウム（NH 4 OH）を用いてpH調整）は、10ppbの最終濃度に添加しました。 ICP-MSの応答におけるドリフトを監視するために内部標準としてセシウムと二律背反を使用してください。 0.22μmのフィルターに通して使用する前にバッファをフィルタリングします。
- 試料のタイプに応じて試料を調製液体、組織または細胞培養物。
- 均質化（ 例えば 、組織または細胞）を必要とするサンプルについては、彼らは洗剤を含まないことを確認してください。サンプル調製のためのトリス緩衝液を使用してください。また、リン酸緩衝液を使用するが、それらは負の時間をかけて、または凍結融解サイクル12でmetalloproteomeに影響を与えることができます。
- トリスを用いて5分間、手動ダウンスまたは超音波処理によって、組織または細胞培養サンプルを均質化生理食塩水（50mMトリスpH8.0の、150mM塩化ナトリウム緩衝しました（塩化ナトリウム）+エチレンジアミン四酢酸（EDTA）フリープロテアーゼ阻害剤）。
- 5分間、16,000×gで遠心分離することによってホモジネートを明確にします。得られた上清を収集します。 4°Cでサンプルを保管してください。
注：全てのサンプルは、従来のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムをブロックから微粒子を防止するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）バイアルに装填するために遠心分離されなければなりません。
- サンプル全体のカラムに充填したタンパク質の総量を正規化します。マイクロボリュームUV分光光度計13を用いて280nmでのタンパク質濃度を決定します。 20および150μgタンパク質間の負荷。サンプル濃度に応じて80μlの - 2の範囲の典型的な注入量を使用してください。
- サンプルローディング前に蒸留水でマイクロボリュームUV分光光度計のサンプルアームを清掃してください。タンパク質サンプルがロードされるサンプルアームです。
- 第2μlのに対して、ブランク楽器電子サンプルバッファー。そして、アームへの負荷を各サンプルの2μLをし、280 nmの吸光度を測定します。
- 濃度を決定します。粗タンパク質サンプルについて、1のAbs = 1 mg / mlでの吸光係数を使用します。ランベルト・ベールの法則を使用して、試料中のタンパク質の濃度を決定するために、Aは吸光度であるA =εxlxcは、εは吸光係数で、lはセンチメートルおよびcにおける経路長は濃度です。
誘導結合プラズマを用いた金属タンパク質基準の2バルク分析 - 質量分析法
- ウォームアップとチューニング製造業者のプロトコルを使用してインストゥルメント。
- 機器はウォームアップとチューニングされたら、バルクICP-MSを行います。
注：精製された金属タンパク質のストック溶液は、一般的に、測定前に希釈する必要があります。金属stochiometries推定タンパク質concentra：標準の金属濃度は、既知のタンパク質から推定することができまする。この情報は、生成された標準曲線の範囲内にすることが適切であろう希釈を決定するために使用することができます。- 1％の硝酸を用いて、500μg/ Lが-彼らは0の範囲を確認するために、金属タンパク質規格、サイログロブリン、フェリチン、セルロプラスミン、銅/亜鉛SODとビタミンB 12を希釈します。この範囲内で基準を達成するために、必要に応じて前にこれに株式を希釈するために水で連続希釈液を行い20に1を超える希釈液を使用しないでください。
- 注射の順序を設定します。まず、7較正レベルを分析し、0の範囲の濃度 - を500μg/ Lは、金属タンパク質標準続きます。 7キャリブレーションレベルは0、1、5、10、50、100および500μg/ Lがあります。
- 関心の要素を選択します。彼らはタンパク質標準がバインドされている要素であるとしてここでは、鉄、銅、亜鉛、CoおよびIを使用します。要素セレクター]タブを開き、elemeを追加することで、取得方法の要素を選択します国税庁と分析されるそれぞれの同位体の質量。
- 器具とサンプルの分析を実行し、機器のソフトウェアが自動的に分析される要素のそれぞれのための検量線を作成します。検量線は、標準がμg/ Lが中に、含まれていることを意味している金属の量に対して検出された金属のカウント/秒をプロットすることによってソフトウェアで作成されます。未知の試料中の金属の濃度を決定するための検量線を使用。
注記：検量線を使用して、ソフトウェアは、金属タンパク質標準の各々における金属の濃度を決定します。 - バルク分析結果から、銅の混合物を使用して、哺乳動物組織三最も豊富な微量元素を含む金属タンパク質標準を生成する、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、最終的に銅と亜鉛とフェリチン（FTN）200μgの/ Lに希釈しました鉄の2,000μg/ Lを集中。
注：彼らは両方とも約1必要なので、このセクションでは、以前に並行して行われるべきである - 完了するために、1.5時間を。
- パージHPLCは、ステップ1.1で作製緩衝液ポンプおよび/分5mlを流速で5分間、ポンプをパージ。
- システムがパージされると0.1 ml /分での流速を設定し、サイズ排除カラム（4.6×300ミリメートル、3ミクロン、150オングストローム）を接続します。
注：チューブと列の間に湿った接続は、カラムの接続中にトラップされる気泡を回避することができます。 - PEEKチューブを使用して280nmでの吸光度を測定するように設定したUV検出器に列の反対側の端を接続します。
- 徐々に0.05刻みでカラムの流量増加 - 0.4 mlの最終流量まで0.1ミリリットル/分/分に到達します。これが発生している間、任意の漏れの列にチューブの接続を確認してください。圧力を監視これはソフトウェアでクロマトグラムに圧力トレースを観察することによって、カラム容量を超えないようにするシステム。
- 10カラム容量 - 5の上に、必要な流量で平衡化するために列を残します。それは平衡化された後に、試料の分析が発生することを可能にする器具を接続します。
- 15分間、0.4ミリリットル/分でカラムを緩衝液AをポンプするためにHPLC法を設定します。
4.設定とサイズ排除実行 - 誘導結合プラズマ - 質量分析法を
注：操作手順は、楽器やモデルの間で異なる場合があります。 ICP-MSが使用されて構成する方法の詳細を学ぶために、機器の技術的な専門家にお問い合わせください。
- ハードウェアの設定を変更する前にスタンバイモードにMS - ICPを置きます。
- いったんスタンバイモードでは、オートサンプラのための通信をオフにして、「その他」のサンプル導入を変更します。
注：ソフトウェアとハードに依存試料導入源としてウェア構成の選択「HPLC」は、使用することができます。このオプションが利用可能であるかどうかを学習するための楽器技術専門家にお問い合わせください。
- いったんスタンバイモードでは、オートサンプラのための通信をオフにして、「その他」のサンプル導入を変更します。
- 直接ICP-MS上の噴霧器にUV検出器からの流出を接続するためのPEEKチューブ（ID 0.13ミリメートル）を使用します。
- 電源は、ICPのバックアップ - MSを、機器が10のためにウォームアップすることができます - 20分。
- HPLCオートサンプラーの背面にMS - プラズマが点火された後、ICPからリモートケーブルを接続します。プラズマが点火した後、これを行います。それ以外の場合はHPLCシステムは自動的にICP以来、シャットダウンします - MSがオンになっていません。
- LC-ICP-MSのデータを収集するためにICP-MS法を変更します。
- スペクトルから時間解決取得（TRA）に取得方法を変更します。
- （ - 0.3秒、典型的には0.05の間）、鉄、銅、亜鉛、共同、私だけでなく、目的の任意の他の要素、および設定積分時間を分析する要素を選択します。関心aの要素の後選択された再、クロマトグラフィーのための実行時 間に合わせて取得時間を調整する（ 例えば、15分クロマトグラフィーの実行のために900秒）。
- 手動で曲ICP - クロマトグラフィーバッファがCsとのSbを使用して流れると感度との衝突セルヘリウムのためのMS（He）のガス流量は、バッファに含まれています。ヘリウム流量は、典型的には、バルク分析のために使用されるものより約1 ml /分以下です。金属イオン数が安定しており、相対標準偏差（RSD）の値が5％以下であると、システムが使用できるようになりました。
- HPLCとICP-MSソフトウェアプログラムの両方でサンプル実行リストを作ります。サンプル実行リストは、サンプルのそれぞれが、データが保存されることにより、名前だけでなく、注入されるべき順序が含まれています。二つのプログラム間のリストの試合でサンプルの総数ことを確認してください。
- HPLCによる試料の注入は、ICPをトリガーするように、HPLCの前にICP-MS用のサンプルバッチを開始 - MSが収集を開始しますデータ。これは、正しい順序で行われていない場合には、欠落しているデータをもたらします。
- 6,000μg/ Lが200μg/ LがよりSODとFTN混合標準の様々なボリュームを注入することにより検量線のポイントを生成したCu＆Znおよび60,000μgの鉄のために/ Lに2,000μg/ Lがアップのためにカラムに注入。注入量は、1から30μlに及びます。
注：これらの濃度範囲は、典型的には、複雑なホモジネートにおいて観察鉄、銅および亜鉛の濃度を包含する。唯一の精製されたタンパク質を含む試料の場合、曲線の最大範囲は、それに応じて調整されるべきです。他の要因からのサンプル中の少ない汚染があるので、タンパク質に関連した金属の量としては小さいまたは大きい範囲を必要とするかもしれません。 - 未知のサンプルの組織、血漿または細胞培養物のそれぞれを分析します。
5.データ分析、操作と可視化
- カンマ区切り値（CSV）ファイル形式と負荷私にデータを格納Ntoの処理プログラム必要に応じて。
- 計器ドリフトを制御するために、セシウムまたはSbのいずれかのために、毎秒カウントすることにより、各要素について秒当たりのカウントを分割。
- 各元素の検量線を生成します。
- それは好ましいデータ解析ソフトウェアでピーク積分を行うことにより、注射の各々のためにバインドされている金属タンパク質に対応する金属ピーク下の面積を決定します。
- CuおよびZnの6,000μg/ Lが2,000 - - 60,000μgの/鉄用L 200、各ランでカラムに注入した金属の総量に対する金属ピーク下の面積をプロットします。ソフトウェアプロトコルに従って線形回帰分析を実行します。
- PG /秒にカウント毎秒に変換する要因として、線形回帰分析からスロープ結果を使用してください。ライン値の勾配によりクロマトグラムを横切る第二のデータポイントあたりのカウントのそれぞれを分割します。
- 内のデータのグラフクロマトグラムの時間に対するPG /秒。関心のピーク下面積を決定します。ピークの下の面積は、PGで、タンパク質が結合された金属の合計量を表します。
- 既知の金属タンパク質の分子量及びそれらが溶出した時刻に基づいてキャリブレーションを生成します。複雑なサンプル中のタンパク質のピークの大きさを推定するために使用します。
Representative Results
金属タンパク質標準を使用することは、サイズ排除カラムの較正を可能にする。 図1Aは標準のチログロブリン、フェリチン、セルロプラスミン、銅/亜鉛SOD及びそれらが結合している金属（鉄、に基づいて、ビタミンB 12の溶出プロフィールを示しますCO、銅、亜鉛、およびI）。 図1Bは、溶出体積の形式で提示分子タンパク質標準の重量およびそれらの溶出時間に基づいて、サイズ排除カラムの較正曲線は、（VE）の空隙容量で割っ示しますカラム（VO）。この標準曲線を生成するために使用されるタンパク質は、A、コンアルブミン、セルロプラスミン、フェリチン、SODとサイログロブリンコンカナバリンされています。
カラムに注入されたFeの60,000 PGおよび図2Dは 、回帰分析は、pを使用して実行される- 図2Aは、2,000の範囲にわたってフェリチンの溶出を示しますEAKエリア。 図2Bおよび図2Cは、溶出CuおよびZnのための銅/亜鉛SODのプロファイルと2Eと2Fが回帰がピーク面積を使用して生成された分析されています。回帰分析の結果は、タンパク質に関連した金属の量を定量的に決定することができるように、PG /秒カウント/秒で生データを変換するために使用されます。変換は、線形回帰（銅例えば 、334.6（カウント/秒）×（秒/ PG））の傾きにより、カウント/秒を分割することによって行われます。
述べたように、この技術は、複雑な生物学的試料中の金属タンパク質を同定するために用いることができます。人間の脳および血漿は、この技術に付し、3及び4は 、それぞれ、得られた結果を示しています。 SEC-ICP-MSによって分離人間の脳は、その各々が異なる金属を表し、 図3A-3Cに示されています関心（銅、亜鉛または鉄）が図4A-4Cは、ヒト血漿を、この技術に供されたときに得られたトレースを示します 。サンプルの複雑さと豊かさが見られるピークの数に影響を与えます。予想されたように、プラズマは、セルロプラスミンおよびトランスフェリンを含むいくつかの金属タンパク質によって支配されています。
サイズ排除クロマトグラフィーの 図1. キャリブレーション- 。それぞれの金属に基づく金属タンパク質基準で知られる金属タンパク質 （A）の溶出プロファイルを使用した質量分析法-誘導結合プラズマ 。 （B）タンパク質標準サイログロブリン（I）、フェリチン（II）、セルロプラスミン（III）、コンアルブミン（IV）、銅/亜鉛SOD（V）とコンカナバリンA（VI）の分子量校正曲線。"ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フェリチンおよび金属タンパク質規格であるCu / ZnのSODの図2.使用は、複雑な生物学的サンプル中の金属タンパク質と銅、鉄や亜鉛関連の量を決定するために （A）の溶出プロファイルをフェリチンのための噴射範囲2000の上に- 。60,000μg/ Lが鉄の。それぞれ銅と亜鉛の6,000μg/ Lが、 - 200の噴射範囲で銅/亜鉛SODのための（B）及び（C）の溶出プロファイル。 （D）、（E）及び（F）金属、鉄、銅と亜鉛のための回帰分析の結果を示し、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
人間の脳の図3のCu、FeとZnのMetalloproteome。（A）銅トレース（B）鉄トレース（C）亜鉛トレース。各金属のためのタンパク質標準の溶出は、グラフの下に示され、それらの分子量を持つ黒のトレースによって示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ヒト血漿については、図4のCu、FeとZnのMetalloproteome。（A）銅トレース（B）鉄トレース（C）亜鉛トレース。各金属のためのタンパク質標準の溶出は、それらの分子量を持つ黒のトレース内で示されていますグラフの下にdicated。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
タンパク質の天然状態を確保することが使用され、サンプルの保存が必要とされるバッファへの特別な注意を意味します。すべてのクロマトグラフィー技術または試料調製技術を用いることができません。サンプル調製およびクロマトグラフィーを通して使用される緩衝液は、生理学的pHと塩濃度を模倣する金属キレート剤と使用バッファを欠いていることが重要です。回避するために、他の条件はタンパク質変性剤（ 例えば 、尿素）のサンプルまたは付加を加熱することが含まれます。凍結融解サイクルの数を最小限にすることが重要です。二価金属を結合するための選択されたバッファの能力もまた重要であり、トリスまたは硝酸アンモニウムバッファは、リン酸ベースのバッファ上で選択されていることが理由です。
クロマトグラフィーの他の形態の低解像度およびサイズ排除クロマトグラフィーの相対ピーク容量は、この技術の主要な制限です。しかし、サイズ排除chromatograの、穏やかな性質PHYは、タンパク質の天然状態を維持し、比較的弱い金属 - タンパク質結合を維持することが重要です。タンパク質の天然状態を維持するための要件は、金属キレート剤（ 例えば 、EDTA）またはカオトロピック塩や界面活性剤を避け、凍結融解サイクルの数を制限するなどのサンプルの治療に特別な注意が必要です。
この技術の影響のこの低解像度、それはもっとして一つのタンパク質が含まれています見たピークのような複雑なサンプルである場合、特定のタンパク質と結合した金属の量を定量する能力。したがって、ピーク積分を用いて決定された金属の量は、タンパク質の全てがひとつの特定のタンパク質をこの時点で溶出なく、関連付けられた金属の総量の指標です。この制限を克服するために、目的のタンパク質は、さらに、天然の条件下で精製されなければなりません。これは、の定量化を可能にしますこのタンパク質に関連付けられている金属はcertainity度の高い報告します。この技術の別の潜在的な制限は、カラムへの非可逆的結合にタンパク質の損失になります。カラムから溶出したタンパク質の量は、これは注入量と一致するかどうかを決定するために分析されるこの回復実験が起こっているかどうかを決定するために行われるべきです。同じことは、溶出材料の金属含有量とバルクICP-MSによって出発物質を測定することによって行うことができます。カラム回復は使用条件に応じて異なり得るが、サイズ排除カラムからのタンパク質の完全な回復が9可能であることが示されています。したがって、使用されている動作条件の下で損失があるか否かをチェックすることが重要です。
プロトコルへの変更を解析要素と同様に使用される金属タンパク質標準に関連付けることができます。金属タンパク質の標準的な私たちのタイプedは関心のある要素によって異なります。例えば、Cu、FeおよびZnのタンパク質などの要素については、SODおよびフェリチンが使用されます。 stoichometriesを知られている任意の他の金属タンパク質も使用することができ、いくつかの例がここに示されています。
この技術を使用してから生じ得る一つの主要な合併症は、ICP-MSのトーチで塩結晶の蓄積です。システムを通過したか、トーチを洗浄する必要があることを、目視検査によって判定された場合、バッファ1000mlの - 塩結晶の蓄積を防止するために、トーチは、すべての500の後、蒸留水で洗浄します。発生する可能性があるもう一つの問題は、サンプルと抽出コーンの清潔でより急速な低下です。これらは、製造者のプロトコルに従って、定期的に清掃する必要があります。
初期試料調製プロトコルの中で最も重要なステップです。金属錯体INF - タンパク質に変更がある場合生成されたormationは有効になりません。これは、技術の主要な制限の一つです。加えて、低解像度の使用は、サイズ排除カラムは、生物学における金属タンパク質の真の複雑さの制限された詳細図が得られます。
ここに記載された技術は、生物のmetalloproteomeの知識を拡張することができます。バルク分析は、サンプル内の金属の量の変化の粗製の指標を与えます。考慮する必要がある一般的な考慮事項に加えて、この技術は、得られたトレースを比較することによって、異なるタンパク質、ならびに特定金属タンパク質と関連する金属の量を定量するために使用できるツールを提供します。この技術の使用は、疾患状態の違いを識別するために使用することができます。識別された金属タンパク質は、その後さらに、彼らは疾患プロセスにおいて果たす役割を決定するのを助けるために調査することができます。ハイフネーションされたICP-MSの適用が成長していますICP-MSは、薬物が結合タンパク質を同定するために使用することができるように、白金、ヨウ素または銅などのヘテロ原子を有する薬剤の役割を決定するために将来。
Acknowledgments
私たちは、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム、（Agilent Technologies社との）オーストラリアの研究評議会リンケージプロジェクトスキーム、精神保健Neuroproteomicsのためのオーストラリア国立保健医療研究評議会、ビクトリア朝の脳バンク、共同研究センターから支援を感謝したいです施設。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
| Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
| Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
| Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
| Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
| Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
| Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
| Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
| Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | ||
| Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
| Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
| Conalbumin | Sigma | C7786 | |
| Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
| Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
| Ferritin | Sigma | F4503 | |
| ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
| Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| 65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
| Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
| Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
| Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
| Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
| Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
References
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