Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

doi: 10.3791/53737 Published: April 13, 2016

Introduction

Temel metaller ikincil haberci yollar, metabolizma yolları ve organel fonksiyonları dahil normal biyolojik fonksiyonlar, hayati bir rol oynamaktadır. Tüm proteinlerin% 30 metalloproteinlerdir 1 ve enzimlerin 2% 50 olduğu tahmin edilmektedir. Metalloenzimler, kimyasal reaksiyonları katalize protein yapısını stabilize etmek kofaktör olarak ve ikincil haberciler gibi düzenleyici rolleri için bu iz metalleri kullanın. Nörodejenerasyon getirmedi en çok çalışılan eser elementlerin bazıları bakır, demir ve çinko 3 vardır. Onlar yan etkiler içebileceğiniz dyshomeostasis birçok hastalık yollarıyla ilgili olduğu düşünülmektedir. Örneğin, süperoksit dismutaz (SOD) doğrudan etkiler ömrü ve amiyotrofik lateral sikleroz (ALS) 4 ailesel Çeşidi transgenik fare modellerinde fenotipinin metal durumu. Alzheimer hastalığında, metalloproteomics teknikleri p transferrin metal durumunda bir azalma keşfetmek için kullanılmıştırlasma 5. Bu çalışmalar önemli bir rol metalloproteinlerdir hastalığa oynayabileceği vurgulayın.

doğrudan biyolojik dokulardan Metaloproteinlerde çalışma gelişen bir alandır. Bazı Metalloenzimler, özelliği olmasına rağmen, çoğu hala karakterize edilmemiş ya da 6 bilinmemektedir. Ölçüm Metaloproteinlerde önemli zorluklardan biri proteinin 7 yerli durumunu korumak için bir gerekliliktir. Klasik aşağıdan yukarıya proteomik teknikler peptidler içine proteinlerin sindirimi güveniyor. Bu işlem, metal ve proteinlerin kovalent olmayan etkileşimi bozar. Böylece, bir protein metal durumu hakkında herhangi bir bilgi elde edilir.

Kütle spektrometresi 8,9 (SEC-ICP-MS) - Bu sorunu aşmak için bir yolu ICP ile eşleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi kullanılarak gereğidir. Bu proteinin yaklaşık boyutu hakkında bilgilerin yanı sıra doç hiçbir metaller üretir10 ile iated. Bundan başka, boyut dışlama, bir enzim ya da protein-protein kompleksinin yerli durumunu korumak için hafif bir kromatografik bir tekniktir. indüktif olarak birleştirilmiş plasma kullanmanın bir avantajı, - kütle spektrometrisi (ICP-MS) teknolojisi kantitatif doğasıdır. Metalloproteinlerdir bir dizi standardı kullanarak biyolojik örneklerin 9,11 den Metaloproteinlerde mutlak kantitatif sağlamak mümkündür. Bu, metal bir konsantrasyon aralığı üzerinde bilinen metalloproteinleri enjekte standart bir eğri üretilmesiyle sağlanır.

Bu protokol, bu metalloprotein çeşitli standartlara için elde edilebilir bir örnek göstermektedir. Bu yazıda demir (Fe), bakır (Cu), çinko (Zn), iyot (I) ve kobalt (Co) da dahil olmak üzere, büyük ölçüde biyolojik alanlarda incelenmiştir metaller için standart eğrileri yaratmayı amaçlıyoruz.

Protocol

Tamponlar ve Örneklerin hazırlanması 1.

  1. Tampon 500 mi, 200 mM amonyum nitrat pH 7.6 - hazırlayın sezyum (CS) ile karşıtlık (Sb) 7.8 (amonyum hidroksit (NH4OH) ile ayarlanabilir pH) 10 ppb nihai bir konsantrasyona kadar ilave edildi. ICP-MS yanıt herhangi bir sürüklenme izlemek için iç standartlar olarak sezyum ve karşıtlık kullanın. 0.22 mikron filtre ile kullanmak için Filtre tampon önce.
  2. Sıvı, doku ya da hücre kültürü: Örnek tipine bağlı olarak örnek hazırlayın.
    1. Homojenizasyon (örneğin, doku ya da hücre) gerektiren numuneler için, bu deterjan içermeyen emin olun. Numune hazırlama için Tris tamponları kullanın. Alternatif olarak, fosfat tamponları kullanın ama olumsuz zamanla veya donma çözülme döngüleri 12 ile metalloproteome etkileyebilir.
    2. Tris tuz (50 mM Tris pH 8.0 tampon kullanılarak 5 dakika, 150 mM sodyum klorür el Dounce veya sonikasyon ile doku ya da hücre kültür örnekleri homojenize(NaCl) + etilendiamintetraasetik asit (EDTA) serbest proteaz inhibitörleri).
    3. 5 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjleme ile homojenatları açıklık getirmektedir. Elde edilen süpernatant toplayın. 4 ° C'de örnekleri tutun.
      Not: Tüm numuneler önce, yüksek performanslı sıvı kromatografisi içine boyut dışlama kromatografisi (SEC), sütun bloke parçacıkların önlemek için (HPLC) şişeleri yükleme için santrifüj gerekir.
  3. numuneler üzerinde kolon üzerine yüklenir protein toplam tutarı normalleştirmek. Bir mikro ses UV spektrofotometresi 13 kullanılarak 280 nm'de protein konsantrasyonlarını belirlemek. 20 ve 150 ug protein arasındaki yük. Örnek konsantrasyona bağlı olarak, 80 ul - 2 arasında değişen tipik enjeksiyon hacimlerini kullanın.
    1. Örnek yüklemeden önce distile su ile mikro hacim UV spektrofotometre örnek kolunu temizleyin. Protein örnekleri yüklenen nerede örnek koludur.
    2. th 2 ul karşı boş enstrümane örnek tamponu. Daha sonra, yük 2 kolu üzerine her bir numunenin ul ve 280 nm'de absorbans ölçümü.
    3. konsantrasyonları belirler. Ham protein örnekleri için, 1 Abs = 1 mg / ml'lik bir tükenme katsayısı kullanın. örneklerin protein konsantrasyonunu belirlemek için, ekstinksiyon katsayısı ε bir absorbansını Beer-Lambert kuralına, A = ε xlxc, kullanımı, l santimetre olarak yol uzunluğu ve Cı konsantrasyonudur.

Kütle Spektrometresi - İndüktif Coupled Plasma kullanma Metalloprotein Standartları 2. Toplu Analizi

  1. Isınma ve melodi üreticinin protokolleri kullanarak enstrüman.
  2. enstrüman ısınmış ve ayarlı sonra, toplu ICP-MS gerçekleştirin.
    Not: Saflaştırılmış metalloprotein stok çözeltileri, genel olarak ölçümden önce seyreltilmesi gerekir. Metal stochiometries ve tahmini protein konsantrasyonları: standart metal konsantrasyonu bilinen proteinden tahmin edilebiliryon. Bu bilgiler, üretilen standart eğri aralığı içinde uygun olacaktır seyreltme belirlemek için kullanılabilir.
    1. % 1 nitrik asit kullanılarak, 500 mg / L - onlar 0 aralığındaki sağlamak için, metalloprotein standartları, tiroglobulin, ferritin, seruloplazmin, Cu / Zn SOD ve Vitamin B 12 sulandırmak. Bu aralıkta standartlarına ulaşmak için, gerekirse bunun öncesinde stoklarını seyreltmek için su içinde seri dilüsyonları gerçekleştirin 20'de 1'ini geçemeyecek dilüsyonları kullanmayın.
    2. enjeksiyonlar sırasını ayarlayın. İlk olarak, yedi kalibrasyon seviyelerini analiz 0 arasında değişen konsantrasyon - 500 mg / L, metalloprotein standartlarına eklenmiştir. Yedi kalibrasyon düzeyleri 0, 1, 5, 10, 50, 100 ve 500 ug / L'dir.
    3. ilgi elemanları seçin. Onlar protein standartlarına bağlı olduğunu unsurlar olarak burada, Fe, Cu, Zn, Co ve ben kullanın. eleman seçme sekme açma ve Eleme ekleyerek satın alma yöntemine elemanları seçin Hangi NTS ve ilgili izotop kütleleri analiz edilmesi.
    4. alet ile örnek analizi yapın ve enstrüman yazılım otomatik elemanların her biri için kalibrasyon eğrileri analiz edilen oluşturur. Kalibrasyon eğrileri, standart ug / L olarak, ihtiva ettiği kastedilmektedir metal miktarına göre tespit metal sayım / saniye çizilmesi ile yazılım tarafından oluşturulur. bilinmeyen numunelerin metal konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon eğrileri kullanın.
      Not: Kalibrasyon eğrisi kullanılarak, yazılım metalloprotein standartları, her metal konsantrasyonunu belirler.
    5. kütle analizi sonuçlarından, Cu bir karışımı kullanılarak memeli dokularında üç en bol bulunan eser elementler içerir metalloprotein standartları üretmek Zn süperoksit dismutaz (SOD) nihai olarak bakır ve çinko ve ferritin (FTN) 200 ug / L'ye seyreltilmiş demir 2.000 ug / L konsantrasyonu.
jove_title "> 3. HPLC Sistemi Ve boy hariç tutularak kromatografi, sütun dengeleme

Not: her ikisi de yaklaşık 1 gereklidir, çünkü bu bölümde, bir önceki paralel yapılmalıdır - tamamlamak için 1.5 saat.

  1. Boşaltma HPLC adım 1.1 yapılan tamponu ile pompa ve / dakika, 5 ml bir akış hızında 5 dakika pompaları temizleyin.
  2. Sistem temizlendi sonra, 0.1 mL / dakika akış hızı ayarlanır ve boyut çıkarma kolonu (4.6 x 300 mm, um 3, 150) bağlanır.
    Not: boru ve sütun arasındaki ıslak bağlantı herhangi bir hava kabarcıkları sütunun bağlantısı sırasında hapsolmak önler.
  3. PEEK boru kullanılarak, 280 nm'de absorbansı ölçmek için ayarlanmış, UV detektörü için sütunun zıt ucunu.
  4. Yavaş yavaş 0.05 artışlarla sütunun akış oranını artırmak - 0.4 ml'lik nihai bir akış oranı kadar 0.1 ml / dakika / dakika ulaşılır. Bu cereyan etmekte iken, herhangi bir sızıntı kolona boru bağlantılarını kontrol edin. basıncını izlemekSistemin yazılımın kromatogram'ın basınç trasesini kolon gereksinimlerini aşmadığından emin olmak için.
  5. 10 kolon hacmi 5 - fazla gerekli akış hızında dengelenmeye sütun bırakın. o dengelenmiş sonra, alet numune analizi meydana gelmesine izin bağlanın.
  6. 15 dakika boyunca, 0.4 ml / dakika sütun üzerinde bir tampon, bir pompa HPLC yöntemini ayarlayın.

4. Kurma ve Boyut Dışlama Koşu - Kütle Spektrometresi - Endüktif Coupled Plasma

Not: Çalışma prosedürleri araçlar ve modeller arasında değişebilir. ICP-MS kullanıldığını nasıl yapılandırılacağı hakkında daha fazla bilgi edinmek için enstrüman teknik uzmanıyla görüşün.

  1. ICP yerleştirin - bekleme moduna MS donanım ayarını değiştirmeden önce.
    1. Bir kez bekleme modunda, otomatik numune için iletişimi kapatmak ve örnek giriş için "öteki" olarak değiştirin.
      Not: Yazılımın ve sert bağlıBir örnek tanıtım kaynağı olarak ware yapılandırma seçerek "HPLC" kullanılabilir. Bu seçenek olup olmadığını öğrenmek için cihaz teknik uzmanıyla görüşün.
  2. doğrudan ICP-MS ile ilgili nebulizer UV dedektör dışarı akışını bağlamak için PEEK boru (ID 0.13 mm) kullanın.
  3. Güç ICP yedeklemek - MS ve enstrüman 10 ısınmasını bekleyin - 20 dakika.
  4. Plazma ateşledi sonra, ICP uzak kablo bağlamak - MS, HPLC otomatik numune arkasına. Plazma ateşledi sonra bunu; Aksi takdirde HPLC sistemi otomatik olarak ICP beri kapanacaktır - MS değil.
  5. LC-ICP-MS için veri toplamak için ICP-MS yöntemi değiştirin.
    1. Zaman çözmek edinme (TRA) için spektrum elde etme yöntemi değiştirin.
    2. (- 0.3 sn tipik 0.05) seçin elemanları, Fe, Cu, Zn, Co, ben yanı sıra ilgi herhangi bir diğer unsurları ve set entegrasyon süreleri analiz edilecek. Faiz a unsurları sonraseçilen yeniden, Kromatografi için çalışma süresi eşleşecek şekilde satın alma süresini ayarlamak (örneğin, bir 15 dakika kromatografi çalıştırmak için 900 sn).
    3. Manuel olarak ayarlamak ICP - duyarlılık ve çarpışma hücre helyum MS (O) Cs ve Sb tamponunda bulunan kullanarak akan kromatografi tamponu ile gaz akış hızları. O akış oranları tipik olarak dökme analizi için kullanılan daha ~ 1 ml / dakika daha azdır. metal iyonu sayımları stabilize ve bağıl standart sapma (RSD) değerleri% 5'in altında olduğunda, sistem kullanıma hazırdır.
  6. HPLC ve ICP-MS yazılım programları hem örnek çalıştırmak listeleri yapmak. Örnek çalışma listesi örneklerinin her veri kaydedilir hangi isim yanı sıra enjekte edilecek sırayı içerir. İki program arasında liste maçta numunelerin toplam sayısı kontrol edin.
  7. toplamaya başlamak için MS - ICP tetikleyecek HPLC ile örnek enjeksiyonu gibi HPLC önce ICP-MS için örnek toplu, başlatmakveri. Bu doğru sırayla yapılmazsa o kayıp veri neden olur.
  8. 6000 ug / L ila 200 g / L'den SOD ve FTN karışık standart değişen miktarlar enjekte kalibrasyon eğrisi noktaları oluşturmak Fe için 60,000 ug / L Cu, Zn ve 2.000 ug / L up kolonu üzerinde enjekte edilmiştir. Enjeksiyon hacmi, 1 ila 30 ul arasında değişir.
    Not: Bu konsantrasyon aralıkları, tipik olarak karmaşık bir homojenatlarında gözlendi Fe, Cu ve Zn konsantrasyonları kapsar. Sadece saflaştırılmış protein içerir numuneler için eğrinin azami menzili buna göre ayarlanması gerekir. diğer faktörler arasından numune daha az kirlenme olduğundan daha küçük veya daha büyük bir aralığı gerektirir protein ile bağlantılı metal miktarı olarak gösterilir.
  9. bilinmeyen örnekleri, doku, plazma veya hücre kültürünün her bir analiz edin.

5. Veri Analizi, Manipülasyon ve Görselleştirme

  1. virgülle ayrılmış değer verileri (CSV) dosya biçimini depolamak ve i yükNto işleme programları gerektiği gibi.
  2. Gösterge sürüklenme kontrol etmek amacıyla, Cs veya Sb ya saniyede sayım tarafından her eleman için saniyede sayıları bölmek.
  3. elemanların her biri için kalibrasyon eğrileri oluşturmak.
    1. o tercih veri analiz yazılımı zirve entegrasyonunu gerçekleştirerek enjeksiyonlar her biri için bağlı metalloprotein karşılık gelen metal tepe altındaki alanı belirleyin.
    2. Fe için 60,000 ug / L - Cu ve Zn ve 2.000 6.000 ug / L - her çalışmadaki kolona enjekte edildi metalin toplam miktarı, 200 karşı metal tepe noktasının altındaki alan çizilir. Yazılım protokolüne göre lineer regresyon analizi yapın.
    3. pg / sn saniyede sayılarını dönüştürmek için bir faktör olarak lineer regresyon analizinde elde edilen eğim sonuçlarını kullanın. hat değerinin degrade ile kromatogram genelinde ikinci veri noktalarının başına sayım her bölün.
  4. veri grafiğinikromatogram zamana karşı pg / sn. ilgi tepelerin altındaki alanların belirlenmesi. tepe noktasının altındaki alan proteini pg, bağlı metalin toplam miktarını temsil eder.
  5. bilinen metalloprotein ve elüte edildiği zaman molekül ağırlığına dayalı olarak bir kalibrasyon oluşturur. Karmaşık örneklerinde protein zirveleri boyutunu tahmin için bunu kullanın.

Representative Results

Metalloprotein standartlarının kullanımı boyut dışlama sütun kalibrasyonu için izin verir. Şekil 1A için sağım profilini gösterir standartları tiroglobülin, ferritin, seruloplazmin, Cu / Zn SOD ve bağlı olan metal bazlı Vitamin B 12 (Fe, Co, Cu, Zn ve I) 'in. Şekil 1B boşluk hacmine bölünen (ve elüsyon hacmi biçiminde sunulmaktadır molekül protein standartlarının ve ağırlıkça elüsyon süresi göre ebat eksklüzyon kolonu için kalibrasyon eğrisi) görülmektedir kolonu (Vo). Bu standart eğri oluşturmak için kullanılan proteinler, A, konalbümin, seruloplazmin, ferritin, SOD ve tiroglobülin Concanavalin vardır.

Sütun üzerine enjekte Fe 60,000 ug Şekil 2B regresyon analizi s kullanılarak gerçekleştirilir - Şekil 2A, 2.000 aralığında ferritin elüsyon gösterireak alanı. 2B ve 2C pik alanları kullanılarak oluşturulan analizleri regresyon Cu ve Zn ve 2E ve 2F için Cu / Zn SOD için yıkama profilleri are Rakamlar. Regresyon analizi sonuçları protein ile bağlantılı metal miktarı kantitatif tespit edilebilir, böylece ug / sn sayım / saniye ham verileri dönüştürmek için kullanılır. Dönüşüm lineer regresyon (bakır ör 334,6 (sayım / saniye) x (san / PG)) eğimi tarafından sayım / saniye bölünmesi ile yapılır.

Belirtildiği gibi, bu tekniğin karmaşık biyolojik örneklerinde metalloproteinleri tespit etmek için kullanılabilir. İnsan beyni ve plazma Bu teknik tabi tutulmuş ve 3 ve 4, sırası ile, elde edilen sonuçları gösterir Şekil edilmiştir. SEC-ICP-MS ile ayrılmış insan beyni, her biri farklı bir metali temsil ettiği, Şekil 3A-3C'de gösterilen İlgi alanına (Cu, Zn veya Fe). insan plazma Bu teknik maruz kaldığında 4A-4C elde izleri de gösterir. Numunenin karmaşıklığı ve bolluğu görülür zirveleri sayısını etkileyecektir. beklenen plazma seruloplazmin ve transferrin dahil olmak üzere birkaç Metaloproteinlerde hakim gibi.

Şekil 1
Boyut Dışlama Kromatografisi Şekil 1. Kalibrasyon -. Kendi metallere dayalı metalloprotein standartları için bilinen Metaloproteinlerde (A) Elüsyon profilinin kullanılması Kütle Spektrometresi - Endüktif Coupled Plasma. (B) protein standartları tiroglobulin (I) 'in, ferritin için moleküler ağırlık, kalibrasyon eğrisi, (ii), seruloplazmin, (iii), konalbumin (IV), Cu / Zn SOD (V) ve (VI)' ya concanavalin."Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Ferritin ve Metalloprotein Standartları olarak Cu / Zn SOD Şekil 2. Kompleks Biyolojik örnek olarak Metalloproteinler ile Cu, Fe ya da Zn Eşlik miktarını belirlemek için (A) Elüsyon profili ferritin enjeksiyon aralığı 2000'den fazla -. 60.000 mg / L demir. (B) ve 200 enjeksiyonu aralığında Cu / Zn SOD (c) Elüsyon profili -, sırasıyla bakır ve çinko, 6.000 ug / L'dir. (D), (E) ve (F) metaller demir, bakır ve çinko için regresyon analizi sonuçlarını gösterir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 3. Cu, Fe ve (C) Çinko iz İnsan Beyin. (A) Bakır iz (B) Demir iz Zn Metalloproteome. Her metal için protein standartlarının elüsyon grafiğinin altında belirtilen moleküler ağırlığı ile siyah iz ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
İnsan Plazma Şekil 4. Cu, Fe ve Zn Metalloproteome. (A) Bakır iz (B) Demir iz (C) Çinko iz. her metal için Protein standartlarının elüsyon molekül ağırlığına sahip siyah izleme ile gösterilmiştirGrafiğin altında dicated. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Proteinin doğal durumunu sağlanması kullanılan ve örnek depolama gerekli tamponlar özel önem anlamına gelir. Tüm kromatografi teknikleri veya örnek hazırlama teknikleri kullanılabilir değil. Numune hazırlama ve kromatografi boyunca kullanılan tamponlar metal şelatörleri ve fizyolojik pH ve tuz konsantrasyonlarına taklit kullanımı tampon yoksun olması önemlidir. Önlemek için diğer koşullar Isıtma örnek veya protein denatüre edici (örneğin, üre) ilave edilmesini içerir. Donma çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. çift ​​değerli metallerin tespit edilmesi için seçilen tampon kabiliyeti önemlidir ve Tris ya da amonyum nitrat tamponlar fosfat bazlı tamponlar içinde seçilen bir nedenidir.

kromatografi diğer biçimlerine boyut dışlama kromatografisi göreceli düşük çözünürlüklü ve pik kapasitesi bu tekniğin önemli bir sınırlama olduğunu. boyut dışlama Kromatografi Bununla birlikte, nazik doğaPHY proteinin doğal durumunu korumak ve böylece görece zayıf metal-protein bağları korumak için önemlidir. Proteinlerin doğal durumunu korumak için gereksinim metal şelat (örneğin, EDTA) veya kaotropik tuzlar ve deterjanlar kaçınarak, donma çözülme döngüsü sayısını sınırlayarak da dahil olmak üzere örneklerin tedaviye özel dikkat gerektirir.

Bu teknik, etkilerin bu düşük çözünürlük daha sonra bir protein içerir görülen tepe gibi kompleks bir örneğinde ise, özel bir protein ile bağlantılı metal miktarını ölçmek için yeteneği. Bu nedenle, en yüksek entegrasyonu kullanılarak saptanmıştır metal miktarı proteinlerinin hepsi sadece belirli bir protein, bu zaman noktasında elüsyon olup ilişkili metalin toplam miktarının bir göstergesi olacaktır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, ilgi konusu olan proteini ayrıca doğal koşullar altında, saflaştırılmış olmak zorunda olacaktır. Bu ölçümü için izinbu protein ile bağlantılı metaller kesinlik arasında daha yüksek bir derece ile raporlanır. Bu tekniğin bir başka potansiyel güçlüğü kolona olmayan geri bağlayıcı proteinin kaybı olur. sütunun elüt protein miktarı, bu enjekte edilen miktar, eşleşip eşleşmediğini belirlemek için analiz edilir ve böylece bu geri deney oluyor olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Aynı elüsyon malzemenin metal içeriğine ve dökme ICP-MS ile başlangıç ​​malzemesinin ölçülerek yapılabilir. Sütun geri kullanılan koşullara bağlı olarak, ancak bir ebat eksklüzyon kolonu proteinlerin tam iyileşme 9 mümkün olduğu gösterilmiştir. Böylece kullanılan çalışma koşulları altında herhangi bir kayıp olup olmadığını kontrol etmek önemlidir.

protokole değişiklikler analiz elemanların yanı sıra, kullanılan metalloprotein standartları ile ilgili olabilir. metalloprotein standardının bize türüed ilgi unsurları bağlı olarak değişecektir. Cu, Fe ve Zn proteinler gibi elemanlar için, SOD ve ferritin istihdam edilmektedir. bilinen stoichometries herhangi bir başka metalloprotein de kullanılabilir ve bazı örnekler burada gösterilmiştir.

Bu tekniği kullanarak ortaya çıkabilir Bir majör komplikasyon ICP-MS meşale tuz kristallerinin birikimi olduğunu. sistem geçirildi edilmiş ya da görsel kontrol altında belirlendiği zaman torç yıkanmalıdır bu tamponun 1,000 ml - tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için, fener her 500 sonra damıtılmış su ile yıkanır. ortaya çıkabilir Başka bir problem örnek ve çıkarma koni temizliği daha hızlı bir düşüş olduğunu. Bu üreticinin protokolleri takip düzenli temizlenmesi gerekir.

İlk örnek hazırlama protokolü en kritik adımdır. Metal kompleksi enf - proteine ​​herhangi bir değişiklik varsaormation geçerli olmayacaktır üretti. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları biridir; Buna ek olarak düşük çözünürlüklü kullanımı ebat eksklüzyonlu kolon biyolojide metalloprotein gerçek karmaşıklığı sınırlı ayrıntılı bir görünümünü verir.

Burada anlatılan teknik, organizmanın metalloproteome bilgisinin genişletilebilir. Toplu analizi sadece bir örnek içinde metal miktarına değişikliklerin ham gösterge verir. dikkate alınması gereken genel düşünceler Bunun yanı sıra, bu teknik, elde edilen izleri karşılaştırarak farklı protein olarak tanımlayan metalloprotein bağlantılı metal miktarını ölçmek için kullanılabilecek bir araç sağlar. Bu tekniğin kullanılması, hastalık durumlarında arasındaki farkları belirlemek için kullanılabilir. belirlenen metalloproteinlerdir daha sonra da hastalık sürecinde oynadıkları rol belirlemeye yardımcı olmak için araştırılabilir. Hecelenmiş ICP-MS uygulama büyüyen vardırgelecek ilaç bağlayan proteinleri tespit için kullanılabilecek bu tür ICP-MS gibi platin, iyot veya bakır gibi bir hetero sahip ilaçların rolünü belirlemek için.

Acknowledgments

Biz Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Agilent Technologies) ile Avustralya Araştırma Konseyi Bağlantı Projeleri Programı, Ruh Sağlığı ve Neuroproteomics Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Victoria beyin bankası, Kooperatif Araştırma Merkezi desteği kabul etmek istiyorum tesis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump Agilent G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler Agilent G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat Agilent G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector Agilent G1314E
Agilent 7700 ICP-MS Agilent G3282A
 Ammonium hydroxide trace metal basis    Sigma 338818
 Ammonium nitrate  Sigma  256064 Make fresh 200mM solution on day of experiment
 Antinomy  Choice analytical  10002-3 
 Ceruloplasmin  Sigma
 Cesium  Choice analytical  100011-1 
 Complete, EDTA free protease inhibitors   Roche 11873580001
 Conalbumin  Sigma C7786
 Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)  Sigma L7647
 Cu, Zn Superoxide dismutase  Sigma S9697
 Ferritin  Sigma F4503
 ICP-MS multielemental calibration standards  AccuStandard Made up to required concentrations in 1% nitric acid
 Microvolume UV spectrophotometer  Thermo Scientific
 65% Nitric acid  Millipore 100441 Diluted to 1% for use
 Peek tubing   Agilent 5042-6461
 Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å  Agilent 5190-2508
 Sodium Chloride  Chem Supply SA046
 Tris Hydrochloride  ICN Biomedicals inc.  103130
 Thyroglobulin  Sigma T9145
 Vitamin B12  Sigma V2876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120, (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. e1610 (2009).
Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).More

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter