Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

رني الزناد تسليم إلى Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53738
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

Introduction

الملاريا مرض معد يسببه البعوض الذي يؤثر على الملايين من الأفراد سنويا. منظمة الصحة العالمية (WHO) أن في عام 2013 كان هناك حوالي 584،000 حالة وفاة بسبب الملاريا، 78٪ منها وقعت في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات 1. مسببات الأمراض التي تسبب الملاريا البشرية هي طفيليات apicomplexan داخل المتصورة جنس وتنتقل بين المضيفين البشري عن طريق البعوض بعوضة الإناث. يحدث انتقال عندما يأخذ البعوض وجبة الدم من شخص مصاب، ومن ثم الودائع الطفيليات المعدية إلى فرد غير مصاب في وجبة الدم اللاحقة. ضمن جنس الأنوفيليس، بعوض الملاريا هو النوع مع أكبر قدرة اتجاهي وهو ناقل الملاريا الأبرز في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1-3.

حاليا، لا تزال مكافحة ناقلات البعوض عن طريق نشر المبيدات الحشرية إلى bالبريد الطريقة الرئيسية المستخدمة للحد من عبء الملاريا البشرية. على الرغم من أن استخدام المبيدات الحشرية منذ 1960s وقد ثبت أن تكون ناجحة للغاية، وأدى صعود مقاومة المبيدات الحشرية حاجة لتطوير المبيدات الحشرية جديدة واستراتيجيات مكافحة ناقلات بديل 4-7. خلال عام 2010، أشار ما مجموعه 49 من 63 بلدا تقارير لمنظمة الصحة العالمية وقوع مقاومة المبيدات الحشرية في نواقل الملاريا 1. بالإضافة إلى ذلك، أداة الأشعة تحت الحمراء مخطط، الذي يستخدم الأدب لاستعراض الأقران لتقييم البيانات المقاومة في المناطق المداري الإفريقي، تقارير أن ما بين 2001 و 2012 كان هناك 46٪ و 27٪ زيادة في مقاومة البيرثرويدات ومادة ال د. (دي دي تي)، على التوالي 7.

تم التعرف تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في 1990s في وقت مبكر كأسلوب التي يمكن أن تستخدم لتعطيل الجينات في مصنع بتونيا 8،9 وفي الفطر العصيباء المبوغة crassa 9،10. بعد ذلك بوقت قصير،في عام 1998، وقد تم توثيق رني لأول مرة في ايليجانس انواع معينة كوسيلة لخفض التعبير الجيني في نموذج حيواني من خلال إدخال العقاقير أو الحمض النووي الريبي مزدوج الجديلة (الرنا المزدوج الجديلة) عن طريق الحقن أو التغذية أساليب 9،11. منذ اكتشافه، قد أحدثت ثورة رني السعي لعلم الجينوم وظيفية من خلال السماح للباحثين الاستفادة من علم الوراثة العكسية للتحقيق بسرعة الأدوار الوظيفية من الجينات ذات الاهتمام عبر آلية إسكات الجينات انتقائية للغاية بعد النسخي. في بعض الكائنات الحية، مثل ذبابة الفاكهة، فإن استخدام الكائنات المعدلة وراثيا التي تعبر عن التدخل التركيبات RNA الناجح على نطاق واسع لإسقاط الموروثة (دينار كويتي). على الرغم من أن استخدام الجينات المحورة في آن. وقد استخدمت الغامبية للرني وقد تكون مفيدة للشاشات واسعة النطاق، وتوليد سلالات البعوض المعدلة وراثيا على حد سواء العمل والوقت مكثفة، مع الأخذ عموما 2-3 أشهر للانتقال من تحديد الجينات التي تهم الجيلعلى من الأسهم المعدلة وراثيا المناسب (12). حاليا، الوسيلة الرئيسية لدينار الجينات في آن. الغامبية هو عن طريق الحقن في الدملمف، خلال مرحلة البلوغ، من الرنا المزدوج الجديلة محدد لجين معين 12،13. هذه العملية تستغرق عادة حوالي شهر واحد للذهاب من تحديد الجينات التي تهم تقييم الجين دينار كويتي، يبرهن على أن تكون أسرع بكثير من الطرق المعدلة وراثيا 12. تم إنشاء طرق اليرقات المرحلة رني مؤخرا في آن. الرنا المزدوج الجديلة المستندة إلى الطحالب الغامبية والزاعجة المصرية عبر جسيمات متناهية الصغر تغذية 14-17 أو عن طريق التسليم عن طريق الفم من الجزيئات 18، مما يتيح فرصا لإجراء تحليل الجيني وظيفية خلال المراحل الأولى من التنمية. في الحقن المباشر، والتغذية، وطرق التسليم جسيمات متناهية الصغر، يؤخذ الرنا المزدوج الجديلة تصل بشكل مستقل من قبل الخلية المستهدفة والمشقوق بواسطة انزيم المقامر إلى 21-25 النوكليوتيدات طويلة "التدخل باختصار الرنا" (الرناوات siRNAs) 19،20. هذه الرناوات siRNAs ثم يتم incorporATED في الحمض النووي الريبي الناجم عن إسكات المعقدة (RISC)، والتي سيتم التخلص منها حبلا واحد، مما يتيح للمجمع RISC محددة RNA لربط ويلتصق مرنا الهدف، وبالتالي تقلل من مستوى، وتحول دون ترجمتها 19،20.

العديد من الميزات الجوهرية لعلم الأحياء البعوض الأساسي تعدل قدرة اتجاهي، بما في ذلك تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الشم، ذوق حاسة)، التزاوج والتناسل والحصانة. ونظرا لأهمية هذه العمليات البيولوجية، فمن المرجح أن تعديل على المستوى الجيني أو الدوائي سوف توفر فرصا جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض، بما في ذلك تزييف مقاومة المبيدات الحشرية، وتوفير أدوات جديدة لنهج متكامل على نطاق أوسع لإدارة ناقلات. فإن استخدام علم الجينوم وظيفية لتقييم دور الجينات الكامنة وراء هذه الميزات البيولوجية الجوهرية يمكن تحديد أهداف جديدة وتقديم رؤى جديدة في كيفية يمكننا خلق فعال الجديدة، الاستراتيجيه مراقبة أكثر فعاليةالمنشأ. وصفنا تطوير واستخدام طريقة الحقن السريع لبدء رني خلال طور العذراء من آن. الغامبية. ونلاحظ أن حقن مرحلة العذراء لالزناد رني يمكن رصد الظواهر الناتجة في البالغين مرحلة مبكرة، أي عاجلا بعد ظهور من شأنه أن يلاحظ إذا بدأت الجينات ضربة قاضية في البالغين بعد ظهور. هذه الأساليب تمكن الجينات ضربة قاضية تبدأ خلال الفترة التنموي العذراء وتمتد إلى مراحل الكبار، بحيث إسقاط الموروثة بدأت خلال تطوير العذراء يمكن أن يستمر ويؤثر على الكبار في وقت مبكر أنواع الخلايا اللمف الدموي يمكن الوصول إليها، وكذلك أنواع الخلايا التي هي أكثر الدملمف الوصول اليها خلال التحول مما كانت عليه في الكبار، مثل الخلايا العصبية الحسية الموجودة في الزوائد الكبار بعد ظهور.

Protocol

1. تحضير وإعداد الرنا المزدوج الجديلة

  1. تعريف المنطقة ضربة قاضية 200-800 سنة مضت (لتوليد الرنا المزدوج الجديلة المقابلة) داخل الجين الذي يتوقع أن يكون لا يمكن تحديدها آثار خارج الهدف (على سبيل المثال، لا تسلسل تناظر ≥18 بي بي داخل الجين آخر) والسيطرة السلبية (على سبيل المثال ، سلسلة مغاير ليست موجودة في الجينوم الحشرة المستهدفة، مثل الجين كولاي lacZ (بنك الجينات معرف جين: 945006). بدلا من ذلك، استخدام تحكم إيجابية (على سبيل المثال، والتي ينتج النمط الظاهري ملاحظتها بسهولة، مثل SRPN2 21،22 ، بنك الجينات الجينات الرقم: 1270169) ويعرف تسلسل استهداف SRPN2 الرنا المزدوج الجديلة في ميشيل وآخرون (2005) 21.
    ملاحظة: E-رني موردا بيوينفورمتيك مفتوح المصدر يمكن أن يكون مفيدا لتحديد هذه المناطق ولعملية تصميم الاشعال النوكليوتيد 23.
  2. أداء الصورةtandard PCR التضخيم (أي يؤديها مع طق الحمض النووي بوليميريز تستخدم 30-35 دورات) باستخدام الحمض النووي الجيني أو قالب كدنا] للحصول على الرنا المزدوج الجديلة قالب التوليف يحيط بها تسلسل T7 المروج (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') والمضي قدما في إعداد الرنا المزدوج الجديلة و تنظيف باستخدام المختبر في عدة نسخ التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام SRPN2 PCR الظروف التضخيم والمعلومات التمهيدي كما وردت في أحد وآخرون (2011) 22.
  3. تحديد عوائد RNA amplicon تنقيتها من التحليل الطيفي امتصاص الاشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي من 260 نانومتر، والتكيف مع التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 3 ميكروغرام / ميكرولتر) في ريبونوكلياز خالية من المياه.
    1. لاستكشاف تركيزات منخفضة RNA، والحد من حجم السائل عن طريق الدوران عينات عليها في جهاز للطرد المركزي فراغ في درجة حرارة الغرفة أو lyophilizing العينات وإعادة تشكيل في حجم أصغر من المياه. الوقت اللازم لعينة تجفيد سوف تختلف تبعاعلى وحدات تخزين عينة أولية وتركيزات الرنا المزدوج الجديلة.
  4. تحقق من جودة وطول الرنا المزدوج الجديلة على هلام الاغاروز 2٪ أعدت مع 1X TBE أو تاي العازلة وملطخة بروميد إيثيديوم (EtBr)، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي القالب المستخدم للتفاعل النسخ. فإن الرنا المزدوج الجديلة الهجرة بصورة أبطأ من الحمض النووي القالب. جودة وطول يمكن تقييمها من خلال ضمان عدم وجود منتجات الرنا المزدوج الجديلة غير محددة وبمقارنة المنتجات مع علامة الحمض النووي القياسية، على التوالي.
    ملاحظة: EtBr هو المغير قوية، وينبغي أن يتم التعامل معها وفقا لذلك.
    ملاحظة: عند تركيز الرنا المزدوج الجديلة من 3 ميكروغرام / ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر من العينة هي أكثر من كافية لتصور على هلام الاغاروز EtBr-الملون.
  5. تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. قد يسبب عدة دورات تجميد / الذوبان التدهور، لذلك يجب أن تكون على استعداد قسامات لكميات كبيرة من الرنا المزدوج الجديلة.

2. إعداد سريع الخضراء FCF صبغ (FGD) أنابيب

  1. تمييع سريع الخضراء FCF صبغمن المحلول (≥85٪ محتوى الصبغة) إلى 0.1٪ (ت / ت) (الحل العمل) في ريبونوكلياز خالية من المياه.
  2. ماصة 1 ميكرولتر من صبغ في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  3. أنابيب مكان في كتلة الحرارة 65 درجة مئوية لمدة حوالي 3 ساعات حتى تتبخر السوائل، ثم أنابيب مكان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل، لتبرد قبل استخدام. وهذه الصبغة صلبة جافة إعادة تكوين في الرنا المزدوج الجديلة الحل إعادة تعليق.

3. إبر سحب حقن

  1. سحب الإبر الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب إبرة ساخنة لقطر غيض من 10-30 ميكرون. سحب إعدادات تتوافق مع: تعديل سخان لا. 1 = 100، تعديل سخان لا. 2 = 70.
  2. لتجنب الأضرار التي لحقت طرف غرامة الإبرة، ووضع كل الإبر سحبت أفقيا في طبق بيتري على شريط من صب المعجون.
    ملاحظة: يمكن الحصول على معلومات إضافية عن إبرة الشعرية سحب الأساليب في مزيد من التفاصيل في أبحاث الملاريا والمراجع الكاشف مركز الموارد Mدليل R4 24.

4. إعداد محطة حقن

  1. جمع المواد المطلوبة: الإبر الزجاج microcapillary انسحبت لطرف على ما يرام، microinjector، ورقة مرشح رقيقة ورقة مرشح سميكة، أطباق بتري، ماصات نقل، فرشاة الطلاء وتشريح المجهر ضوء.
  2. إعداد microinjector وفقا للتعليمات في دليل microinjector، وضبط حجم حقن لحجم المطلوب لكل نبضة (على سبيل المثال، بحد أقصى 69 NL في النبض).
  3. على منصة التي هي سهلة للمناورة تحت المجهر (على سبيل المثال، الجانب المسطح من رف أنبوب الستايروفوم)، كومة اثنين من ورقة ورقة فلتر مع ورقة الترشيح رقيقة على القمة، وتأمين مع الشريط حول الحواف.
  4. و resuspend 10 ميكرولتر من كل حل الرنا المزدوج الجديلة في أنابيب الصبغة الملونة منفصلة، ​​ومكان على الجليد.

5. جمع الشرانق للحقن

  1. سد صغير 60 ملم × 15 ملم طبق بيتري مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات، وجمع ~ 50 الشرانق شاحب (الدورينانوغرام أول 24 ساعة بعد التشرنق) من علبة insectary باستخدام نقل البلاستيك القابل للتصرف ماصة.
  2. إزالة أي الشرانق التي لديها متوسط ​​إلى دباغة بشرة داكنة.
    ملاحظة: بمجرد أن تبدأ بشرة تان، فإنه يصبح أكثر صعوبة في اختراق بشرة، والنتائج حقن في أعلى بكثير الفتك.

6. الرنا المزدوج الجديلة حقن

  1. تحت المجهر تشريح، وقطع الطرف البعيد من إبرة الحقن مع زوج من ملقط غرامة.
  2. إعداد إبرة الحقن عن طريق الردم الإبرة مع الزيوت المعدنية (باستخدام حقنة مع 3 بوصة، إبرة قياس 30)، وطرد فائض المعروض النفطي مع microinjector.
  3. ملء أمام إبرة الحقن مع أقصى قدر ممكن من الرنا المزدوج الجديلة، وإخراج نبضة واحدة تحت المجهر للتأكد من صرف السائل. في حالة عدم وجود السائل وتناولها و / أو طرد، والتحقق من الطرف البعيد من الإبرة للأي انسداد والتأكد من أن الإبرة المضمونة بقوة في microinjectoص.
  4. اختيار 1-3 الشرانق، ووضعها على ورقة الترشيح.
  5. باستخدام فرشاة الرسام، ووضع الشرانق على ورقة الترشيح مع الظهرية بشرة الوصول إليها، واستخدام الفرشاة لدفع على ورق الترشيح وامتصاص أي المياه الزائدة.
  6. استقرار خادرة مع غيض من الفرشاة، وادخال الإبرة في إهاب الظهرية بين الصدر والبطن في زاوية ما يقرب من 30 درجة بالنسبة إلى السطح الظهري للخادرة. وينبغي توجيه حقن نحو نهاية الخلفي من الشرنقة والإبرة يجب أن يتم نقل في اتجاه الأمامي إلى الخلفي.
  7. حقن اثنين من البقول (69 NL في النبضة) من 3 ميكروغرام / حل الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر في الدملمف، وتحقق لتوزيع اللون في جميع أنحاء الجسم. إذا تم تحديد أي لون، وتحول موقف إبرة حقن قليلا لمسح معلومات من إعاقة وكرر تسليم السائل.
  8. استخدام الفرشاة المبللة للتحرك بلطف خادرة من الإبرة في المياه لزراعة. تانه بوبا يجب التمسك الفرشاة على ضوء الاتصال.

7. شروط المشاركة الحقن

  1. وضع طبق بتري مع الشرانق حقنها في قفص البعوض مع تدفق الهواء مناسب (على سبيل المثال، قفص شبكة أو حاوية مع غطاء شبكة). وينبغي أن تظل الظروف تربية العذراء باستمرار في 27 ± 3 درجة مئوية درجة الحرارة، و75 ± 5٪ الرطوبة ويكون تحت ضوء: دورة الظلام من 16: 8 ساعة.
  2. إعداد 10٪ (ث / ت) محلول الجلوكوز، ووضع كرة من القطن مشبعة حل على قفص البعوض شبكة لتغذية الكبار.

8. تقييم ضربة قاضية

  1. في الوقت المطلوب نقاط (ق)، وتقييم الظواهر في الحشرات التجريبية حقن الرنا المزدوج الجديلة، مقارنة بالمجموعة الضابطة.
    1. تقييم dsSRPN2 وdsLacZ الحشرات يوميا من قبل تقشعر لها الأبدان أسفل البالغين لمدة 2-3 دقائق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ونقلهم إلى لوحة الباردة في 2 درجة مئوية، وتحديد أي تشكيل شبه الورم عن طريق استخدام المجهر تشريح في 15Xالتكبير مع إضاءة brightfield. بعد التقييم، والعودة البالغين لظروف insectary (27 ± 3 درجة مئوية، 75 ± 5٪ الرطوبة).
      ملاحظة: dsRNAs المجموعتين الضابطة والتجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول هم dsSRPN2 وdsLacZ، على التوالي. هناك العديد من الخيارات المناسبة للضوابط. ومع ذلك، يقترح أن تحكم إيجابية التي النمط الظاهري و / أو التعبير تصور بسهولة (على سبيل المثال، من خلال تشريح المجهر) و / أو كميا [على سبيل المثال، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، وصمة عار الغربية] وينبغي أن تستخدم عندما تعلم هذه التقنية. البروتين SRPN2 وتقدير نسخة عبر طخة غربية وQRT-PCR، على التوالي، تم وصفها في ميشيل وآخرون (2005) 21.

Representative Results

حقن العذراء لعوائد الجينات دينار أفضل النتائج عندما يتم تنفيذ الحقن خلال طور العذراء في وقت مبكر، عندما إهاب دبغ مستويات منخفضة (الشكل 1A، اليسار، و1B). زيادة الدباغة وتصلب بشرة، عموما بعد 24 ساعة، والنتائج في زيادة مخاطر الوفاة العذراء بعد الحقن (الشكل 1A والوسط واليمين). معدل التنمية العذراء يمكن أن تختلف تبعا لظروف insectary وكثافة الحيوانات 24،25. لذا، فمن الأفضل لتقييم تصبغ بصريا.

أثناء عملية الحقن، يتم إدخال إبرة الشعرية في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة في الجزء الأمامي إلى الاتجاه الخلفي (الشكل 2A). مرة واحدة يتم إدخال إبرة والرنا المزدوج الجديلة + 0.01٪ (ث / ت) يتم الاستغناء FGD، وتوزيع الصبغة هو واضح في جميع أنحاء الدملمف (فيقوإعادة 2B).

تقييم ظهور الكبار لالشرانق حقن مع 0.01٪ (ث / ت) كشفت FGD بمعدل 70٪ ظهور، مقارنة مع 96.7٪ ظهور الضوابط غير حقن (الشكل 3A). وتجدر الإشارة، وقد لوحظ ظهور جزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة (الشكل 3B). الحيوانات المحقونة يحمل أي تأخير في وقت ظهور الشكل (4A) أو تأثير منحازة على كلا الجنسين (الشكل 4B). قام تقييم إضافي للبقاء الكبار ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور يكشف أي تأثير واضح على بعد ظهور الكبار البقاء على قيد الحياة (الشكل 4C).

وجرى تقييم التحقق من صحة دينار الجودة من قبل الميلاني شبه ورم (كتلة الأنسجة المصطبغة بحزن) النمط الظاهري المرتبطة SRPN2 ضربة قاضية 21،22 كعنصر تحكم إيجابية لضربة قاضية و غياب الظواهر المرتبطة حقن dsLacZ كعنصر تحكم السلبية. وسجل البعوض البالغ الذي ظهر في يوم 8 بعد حقن (يوم 6-7 بعد ظهور). وقد لوحظت الميلانية الزائفة الأورام (الشكل 5A و5B) من خلال بشرة من 93.5٪ من dsSRPN2 مقابل 0٪ من البعوض dsLacZ الكبار (الشكل 6A). وقد تم تحديد مجموعات من الأنسجة melanized بحزن على تشريح من البقع المصطبغة (الشكل 5C). كانت شبه الأورام واضحة على بشرة الكبار في وقت مبكر من يوم 3 بعد ظهور وكانت أيضا حاضرة في مجموعة فرعية من dsSRPN2 الدملمف وأنسجة الأمعاء (لا تظهر البيانات). في 5 بعد الحقن (أوائل مرحلة البلوغ)، انخفضت بشكل ملحوظ SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن لوحظ عدم dsLacZ أو عزلات بروتين غير حقن الدملمف (الشكل 6B).

ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg "/>
الشكل 1: انطلاق التنموي للحقن الرنا المزدوج الجديلة العذراء حقن العذراء المبكر للنتائج الرنا المزدوج الجديلة في البقاء على قيد الحياة الأمثل والتقدم إلى مرحلة الكبار. مستويات منخفضة من تصبغ بشرة (A، غادر، وباء) ويمكن ملاحظة في أول 0-24 ساعة التشرنق التالية. الدباغة من العذراء بشرة السابقة حقن (A والوسط واليمين) النتائج في معتدلة إلى الفقراء البقاء على قيد الحياة.

الشكل 2
الشكل 2: موقف حقن وتوزيع المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة (A) شعري حقن إبرة المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة في إهاب الظهرية بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة، في سابقة لالخلفي الاتجاه. يتم توزيع (ب) صبغة واضح في الدملمف العذراء. حجم حقن الرنا المزدوج الجديلة من 138 نيكولا لانغ، وصفت مع 0.01٪ FGD (ث / ت).

الشكل (3)
الشكل (3): بعد حقن ظهور الكبار (A) 70٪ من الشرانق حقن مع 0.01٪ FGD (ث / ت) ظهر بنجاح (ن = 60)، مقابل 96.7٪ من الضوابط غير حقن (ن = 60). أجريت ثلاث مكررات البيولوجية. وقد لوحظ (ب) ظهور الجزئي من حالة العذراء لعدد كبير من البعوض غير على قيد الحياة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).

الشكل (4)
الشكل 4: معدل ظهور، وتقييم الجنس والكبار البقاء على قيد الحياة (A) لوحظت مرات ظهور المقارنة التالية حقن العذراء مع 0.01٪ FGD (24 ساعة = ​​80٪ و 48 ساعة = ​​20٪)، بالمقارنة مع العذارى غير حقن (24. ساعة = 83٪ و 48 ساعة = 17٪). (ب (C) البقاء على قيد الحياة ويكشف أن حقن مع 0.01٪ FGD لا يؤثر بقاء البالغين، بتقييم ما يصل الى 10 يوما بعد ظهور. وتمثل نتائج البيانات من ثلاث تجارب مستقلة مع 0.01٪ FGD حقن (ن = 60) وعدم حقن (ن = 60) الشرانق (عدد متساو من الذكور والإناث). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).

الرقم 5
يعكس الزائفة الورم النمط الظاهري مراقبة إيجابية ضربة قاضية ناجحة لوحظت الزائفة الأورام على (A) في منطقة البطن و (ب) بشرة الصدر من dsSRPN2 -injected، ولكن ليس dsLacZ البعوض الكبار -injected في يوم 8 بعد الحقن: الرقم 5.(C) التكبير العالي (400X) التصوير (أ) من بشرة وتشريح بقع مصطبغة (ب) تكشف مجموعات من الخلايا melanized بحزن.

الشكل (6)
الشكل 6: الكمي لتشكيل شبه الورم وانخفاض مستويات البروتين SRPN2 (A) حقن طور العذراء تؤدي إلى تشكيل شبه ورم في 93.5٪ من البالغين dsSRPN2 (ن = 21) مقابل 0٪ من الضوابط dsLacZ (ن = 19). . النتائج التي تم الحصول عليها يوم 8 بعد الحقن. (ب) لطخة غربية (يسار) يظهر انخفضت SRPN2 المستويات في dsSRPN2، ولكن ليس dsLacZ أو العزلات غير حقن البروتين الدملمف (يوم 5 بعد الحقن). النتائج على أساس ثلاث تجارب مستقلة. وكانت مكافحة SRPN2 21 و مكافحة SRPN3 التخفيفات 26 الأجسام المضادة المستخدمة 1: 1000 و 1: 2000، على التوالي. الماعز المضادة للراbbit مفتش-HRP (المنتج الشوري عام 2004، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، دالاس تكساس) كانت تستخدم في 1: 5000. وتم قياس كمية كل مستويات بروتين (يمين) من خلال كثافة الفرقة (يماغيج البرمجيات، المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تطبيع SRPN3، وإحصائية مقارنة عن طريق اختبار ر مزاوج. P <0.05: *، ف ≥0.05: نانو ثانية (لا كبيرة). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).

Discussion

الأساليب الحالية لإحداث غير المعدلة وراثيا رني في البعوض وتشمل الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة في hemocoel الكبار 12،13 أو تغذية اليرقات رني النانوية المغلفة الزناد 14-17 أو الرنا المزدوج الجديلة القائم على الطحالب الجزيئات 18. استهداف البعوض الكبار، في حين أن قيمة للغاية، يمكن استبعاد عدد كبير من الجينات التي تعمل خلال فترات النمو السابقة. ضربة قاضية بدأها تغذية اليرقات قد تسفر عن الظواهر غير متناسقة خلال مرحلة البلوغ بسبب، في جزء منه، إلى إمكانية استمرار البروتين المتغير من خلال طور العذراء. لذلك، إدخال وسيلة إضافية التي تهدف على وجه التحديد في البدء رني خلال تطوير العذراء ستوفر وسيلة لتقييم بشكل كامل وظائف الجينات خلال مراحل النمو قبل الكبار، وكذلك القدرات المعززة لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل الكبار. كما هو الحال مع نهج الجينات ضربة قاضية على أساس حقن الرنا المزدوج الجديلة أو التعبير، واستمرار الجينات ضربة قاضيةلا يمكن التنبؤ بها. ولذلك، ينبغي تقييم نص أو مستويات البروتين لجين من الفائدة خلال فترات التنموية للاهتمام. على الرغم من أن نلاحظ استمرار انخفاض مستويات البروتين في اليوم 5 بعد حقن للSRPN2 في الحيوانات حقن الرنا المزدوج الجديلة SRPN2، يمكن لعوامل مثل دوران البروتين ونصف حياة تختلف عن أهداف مختلفة. ومن الأهمية بمكان أن تضمن لها، كذلك، أن الرنا المزدوج الجديلة لاستخدامها في حقن يتركز بشكل جيد ويبدو سليما على هلام الاغاروز. ونحن نوصي المجربون إعادة تقييم هذه العوامل إذا كانت النتائج ضربة قاضية ليست كافية، وربما تحتاج إلى اختبار تجريبي لأهداف الجينات المحددة تركيزات كل من الرنا المزدوج الجديلة.

نحن تصف طريقة لبدء التدخل RNA خلال طور العذراء من آن. تطوير الغامبية. ويعتمد هذا الأسلوب على مقدمة عبر Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة مباشرة في hemocoel من الشرانق في وقت مبكر، ويسمح لتقييم جودة حقن من قبلاستخدام من المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة. القدرة على تصور نوعية حقن يشكل تعزيز حاسم لضمان ضربة قاضية ناجحة وتشكل جانبا من جوانب ضربة قاضية الجينات القائم على حقن أنه لم يتم النظر في البروتوكولات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة ذكرت معظم سابقا مع التركيز على مرحلة البلوغ. من خلال استهداف خادرة في بداية هذه الفترة التنموية، الجينات التي قد يكون لها دور خلال هذه الفترة تنموي محوري، أو خلال المراحل المبكرة من سن البلوغ يمكن تقييمها وظيفيا. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قد تمكن تسليم الرنا المزدوج الجديلة إلى الخلايا، وإنشاء تدخل الحمض النووي الريبي في الخلايا التي يمكن الوصول إليها خلال التحول، ولكن يصعب الوصول إليها في البعوض البالغ تشكيلها بالكامل.

تحليل ميكروأري مؤخرا هاركر وآخرون (2012) حددت 560 آن. النصوص الغامبية التي تصل التنظيم أو تنظيم أسفل من قبل ما لا يقل عن 4 أضعاف خلال مراحل نمو متميزة، بدءا من الجنين إلى الكبار. من 560 النصوص التي تم تحديدها، مجموعة من 309 والتنظيم صعودا خلال تطوير العذراء 27. وتشير هذه النتائج إلى أن هناك العديد من متطلبات التعبير الجيني الفرق في جميع أنحاء تنمية البعوض، بما في ذلك تلك التي تحدث خلال مرحلة العذراء، فاصل خلالها الكائن الحي يخضع التحول. في العديد من أنواع الحشرات، بما في ذلك. الغامبية، الجينات المسؤولة عن العمليات مثل التنمية (أي جليدية العذراء والبروتينات ملزم كيتين) 27-31 والمناعي استجابة (أي تول البروتينات مثل مستقبلات) 27،32-34 وأعربت غاية أثناء مرحلة العذراء. مرة واحدة ظهرت الكبار تشكيلها بالكامل، وهناك واصل التعبير الجيني في استجابة لالبيئية والفسيولوجية تغيير 35. والجدير بالذكر أن خلال تطوير الكبار في وقت مبكر، أن هناك زيادة في التعبير عن الجينات التنموية (أي جليدية الكبار والبروتينات العضلية) 36، وكذلك الجينات الرئيسية الأخرى (أي 27،36.

السيطرة الإيجابية المستخدمة في تطوير هذا البروتوكول، SRPN2، هو آن. الغامبية مثبط البروتياز سيرين (السربين). يلعب SRPN2 دورا هاما في تنظيم السلبي للالتصبغ الحشرات، مجموعة واسعة الاستجابة المناعية الفطرية في الحشرات 21،22. ضربة قاضية من SRPN2 في البعوض النتائج الكبار في تشكيل شبه ورم 21،22، النمط الظاهري الذي لوحظ بسهولة عن طريق استخدام المجهر الضوئي. وبالنظر إلى أن هذا النمط الظاهري واضح يمكن سجل بسهولة في الحشرات الحية، كنا SRPN2 لحقن مرحلة رني العذراء الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن SRPN2 خلال جميع مراحل التطوير 37، وبالتالي توفير هدفا جيدا للمرحلة العذراء حقن رني وتقييم وظيفة في الكبار في وقت مبكر. علينا أن نبرهن على طريقة وضعنا غير قادرة على إحداث الكبار مماثل pseud الميلاني تشكيل س الورم نتيجة لحقن الرنا المزدوج الجديلة المنجزة خلال مرحلة العذراء للتنمية. في تطوير هذا البروتوكول، لاحظنا أن حقن خلال تطوير العذراء في وقت مبكر (أي أول 24 ساعة بعد تساقط اليرقات، العذراء) أمر بالغ الأهمية للحصول على أفضل ظهور الكبار. في حال الفقراء ظهور يتم الحصول بعد الحقن، ونحن نوصي تنظيم اليرقات بدقة أكبر، للحصول على الشرانق مع تصلب بشرة أقل اتساعا، وأؤكد أن يتحقق في وقت مبكر حقن مرحلة العذراء. وعلاوة على ذلك، والتقليل من الأضرار التي لحقت النتائج بشرة في معدلات ظهور الأمثل وزيادة التكبير أثناء الحقن يمكن أن تساعد في ضمان أن يتم ثقب فقط المنطقة المقصودة من هذا الحيوان. إذا كانت الإبرة يجب أن ثقب من خلال لبشرة بطني، وتجميع السائل المسمى صبغ يكون واضحا على السطح الخارجي للخادرة أو سوف تشبع ورقة الترشيح. فإنه ينصح بشدة لتجاهل أي الشرانق التي لديها أكثر من ثقب بشرة.

jove_content "> مع تجارب واسعة من العديد من المختبرات مع أداء حقن البعوض الكبار، والنهج حقن مكروي التي سبق تحديدها يمكن تكييفها مع تعديلات بروتوكول بسيط للاستخدام في التجارب رني العذراء. وعموما، فإن الهدف من هذه الطريقة هو توفير الباحثين القدرة على توسيع الإطار الزمني خلالها عكس لا يمكن أن يؤديها تحاليل وراثية، مما يتيح البحوث التي من شأنها دعم تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في الأنواع الأخرى، مثل الرادنة prolixus وورق القطن frugiperda، تكشف عن أن الجينات آثار إسكات تميل إلى أن تكون من ذلك بكثير أكبر عندما بدأ أثناء مرحلة ما قبل الكبار مراحل 38،39. وخلال جميع مراحل التنمية، الجينات بوساطة رني ضربة قاضية يخضع لاعتبارات تتعلق سرعة واستمرار إسكات الجينات، واستقرار البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المستهدفة. الهدف رني المثالي جينات تميل إلى أن تكون تلك التي ترميز proteiن أو الحمض النووي الريبي التي لديها قصيرة نصف الحياة ومعدل دوران عال 11،40.

بينما الاستراتيجيات رني المعدلة وراثيا يمكن أيضا أن تستخدم لمعالجة اعتبارات تتعلق سرعة واستمرار رني خلال مراحل ما قبل الكبار، وتقنيات المعدلة وراثيا لديها العديد من نقاط الضعف (على سبيل المثال، الوقت اللازم لتوليد خطوط المعدلة وراثيا، التجريبية الأطر الزمنية لالتزاوج البعوض لتوليد الحشرات مع التعبير الرنا المزدوج الجديلة منظم، والحفاظ على مخزونات المعدلة وراثيا). على النقيض من ذلك، لدينا بروتوكول يتيح وسيلة أسهل وأسرع للبدء في إسقاط الموروثة خلال تطوير العذراء وفي أنواع الخلايا التي تنشأ ويمكن الوصول إليها خلال مسخ ولكن أقل الوصول إليها في البالغين. استخدام تعليق الرنا المزدوج الجديلة المسمى صبغ يسمح لتقييم سهلة للنجاح الحقن وتشتت المواد أدخلت داخل الشرانق. لدينا بيانات عن بداية تشكيل الورم في البالغين العذراء حقن، بالمقارنة مع الحيوانات المحقونة مثل البالغين، ويتسق مع الحرف الأولينتقم من ضربة قاضية رني بوساطة أثناء طور العذراء. باستخدام خط G3 البعوض لدينا وتحت ظروف insectary لدينا، فإننا نلاحظ الميلاني تشكيل شبه ورم الكبار في وقت مبكر من 10 أيام بعد الحقن من البالغين حقن 3-5 أيام بعد ظهور. عن طريق أداء أوائل حقن العذراء المرحلة، نلاحظ مرئية تشكيل الميلاني شبه الورم في وقت مبكر من خمسة أيام بعد الحقن (أي 03:57 آخر أيام ظهور). وتعني هذه البيانات أن هذه الطريقة يمكن الشروع في ضربة قاضية الجينات خلال فترة التنموية سابقا تحت درس (أي تنمية العذراء). قد تكون لدينا طريقة صبغ العلامات مفيدة أيضا لوضع بروتوكولات حقن اليرقات الجديدة، نظرا لطبيعة شفافة للبشرة خلال جميع الأعمار اليرقية. في حين أن التحكم المستخدمة في هذه الدراسة تتطلب التقدم إلى مرحلة البلوغ لعرض النمط الظاهري ضربة قاضية، والتجارب المستقبلية لتقييم الظواهر مرحلة معينة العذراء بعد الحقن من الشرانق في وقت مبكر سيوفرمعلومات قيمة فيما يتعلق بتوسيع هذه الطريقة في فترات التنموية إضافية مثل التنمية العذراء في وقت متأخر. وباختصار، فإن هذا الأسلوب بروتوكول رني قيما لمرحلة بدء العذراء من ضربة قاضية الجينات بوساطة رني ويوسع أدوات الجينومية الوظيفية المتاحة للاستخدام ضمن الأوساط البحثية ناقلات الامراض والحشرات.

Disclosures

وتدفع الوصول المفتوح لهذا الفيديو المادة تكفلها بيوجين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript RNAi kit Ambion AM1626
Nanoject II injector Drummond 3-000-204
Nanoject II foot switch Drummond 3-000-026
Borosilicate glass capillaries Drummond 3-000-203-G/X
Glass micropipette puller Narishigne PB-7
Fast Green FCF dye Sigma F7258 Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes Thermo Scientific 1371150 ¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper  GE Healthcare 1001-090 This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper BioRad 107-3931 This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Paint brush (size 0) Michael’s Art 10474940 Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope  ----  ----- This can vary based on availability and user preference.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Tags

عدوى، العدد 109، البعوض، خادرة، والملاريا، الغامبية، ناقلات، حقن، الرنا المزدوج الجديلة، تدخل الحمض النووي الريبي، رني، عكس علم الوراثة وعلم الجينوم وظيفي
رني الزناد تسليم إلى<em&gt; بعوض الملاريا</em&gt; شرانق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse,… More

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter