Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi Trigger Delivery in Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53738
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

Introduction

Malaria är en myggburen infektionssjukdom som påverkar många miljontals individer varje år. Världshälsoorganisationen (WHO) rapporterar att under 2013 fanns det cirka 584 tusen dödsfall på grund av malaria, 78 procent av som inträffat hos barn under fem års ålder 1. De patogener som orsakar mänsklig malaria är apicomplexa parasiter inom släktet Plasmodium och överförs mellan sina mänskliga värdar av kvinnliga Anopheles myggor. Överföring sker när mygga tar en blodmjöl från en individ som är infekterad, och sedan insättningar infektiösa parasiter i en oinfekterad individ i en efterföljande blodmjöl. Inom släktet Anopheles, är Anopheles gambiae de arter som har störst vektor kapacitet och är den mest framträdande malariavektor i Afrika söder om Sahara 1-3.

Närvarande, mygga vektorkontroll genom utplacering av insekticider fortsätter till be huvud metod som används för att minska bördan av mänsklig malaria. Även om användningen av insekticider sedan 1960-talet har visat sig vara mycket framgångsrik, har ökningen av insektsresistens kört ett behov av utveckling av nya insekticider och alternativa vektorkontrollstrategier 4-7. Under 2010, totalt 49 av 63 länder som rapporterar till WHO indikerade förekomsten av insektsresistens i malaria vektorer 1. Dessutom IR Mapper verktyg som utnyttjar granskad litteratur att bedöma resistensdata i Afrotropical regioner rapporterar att mellan 2001 och 2012 fanns det 46% och 27% ökning av resistens mot pyretroider och diklordifenyltrikloretan (DDT), respektive 7.

RNA-interferens (RNAi) identifierades i början av 1990-talet som en teknik som kan användas för att inaktivera gener i växten Petunia 8,9 och i svampen Neurospora crassa 9,10. Kort därefter,1998, var RNAi första dokumenterade i Caenorhabditis elegans som ett sätt att minska genuttrycket i en djurmodell genom införande av antisens- eller dubbelsträngat RNA (dsRNA) via injektion eller uppfödningsmetoder 9,11. Sedan dess upptäckt, har RNAi revolutionerat jakten på funktionell genomik genom att tillåta forskare att använda omvänd genetik för att snabbt undersöka funktionella roller gener av intresse via en mycket selektiv posttranskriptionell geners uttryck mekanism. I vissa organismer, såsom Drosophila melanogaster, har användningen av transgena organismer som uttrycker interfererande RNA-konstruktioner varit allmänt framgångsrika för gen knockdown (KD). Även om användningen av transgener i An. gambiae för RNAi har använts och kan vara användbar för storskaliga skärmar, är generering av transgena mygga stammar både arbets- och tidskrävande, i allmänhet tar två till tre månader att gå från att identifiera en gen av intresse för generatipå en lämplig transgen lager 12. För närvarande är den främsta metoden för gen KD i An. gambiae är genom injektion i hemolymfa, under sitt vuxna stadium, av dsRNA är specifikt för en given gen 12,13. Denna process tar normalt ungefär en månad att gå från identifiering av en gen av intresse för bedömningen av genen KD, visat sig vara mycket snabbare än transgena metoder 12. Metoder för larvstadiet RNAi har inrättats nyligen i An. gambiae och Aedes aegypti via nanopartiklar utfodring 14-17 eller genom oral tillförsel av mikroalger baserade dsRNA molekyler 18, erbjuder möjligheter att utföra funktionell genomisk analys under tidiga stadier av utveckling. I direktinsprutning, utfodring, och nanopartiklar leveransmetoder är dsRNA tas upp självständigt av målcellen och klyvs av enzymet Dicer i 21-25 nukleotider lång "kort interfererande RNA" (siRNA) 19,20. Dessa siRNA är då incorporated i RNA-inducerad tysta komplex (RISC), varifrån en del kommer att kasseras, vilket gör att RNA bundna RISC-komplexet att binda till och klyva mål-mRNA och därmed minska dess nivå och hämma dess översättning 19,20.

Många inneboende egenskaper hos grund mygga biologi modulera vectorial kapacitet, inklusive värd preferens (t.ex. olfaction, gustation), parning, reproduktion och immunitet. Med tanke på betydelsen av dessa biologiska processer, är det troligt att deras modulering på en genetisk eller farmakologisk nivå kommer att erbjuda nya möjligheter för vektorstyrning, inklusive kringgående av insektsresistens och ger nya verktyg för bredare integrerade strategier för vektorhantering. Användningen av funktionell genomik att bedöma rollerna av gener som ligger bakom dessa inneboende biologiska egenskaper gör det möjligt att identifiera nya mål och ge nya insikter i hur vi på ett effektivt sätt kan skapa nya, effektivare kontroll Strategtalet. Vi beskriver utvecklingen och användningen av en snabb injektion metod för att initiera RNAi under puppstadium av An. gambiae. Vi observerar att puppstadium injektion av en RNAi utlösare möjliggör observation av resulterande fenotyper i scen vuxna tidigt, det vill säga, förr efter uppkomst än vad som skulle observeras om gen knockdown inleddes hos vuxna efter uppkomst. Detta metoder möjliggör gen knockdown början under pupal utvecklings intervall och sträcker sig in i vuxenstadier, så att genen knockdown inleddes under PUPP utveckling kan kvarstå och påverka tidigt vuxna hemolymph åtkomliga celltyper, liksom celltyper som är mer hemolymph-tillgängliga under metamorfos än i den vuxna, såsom sensoriska neuroner som finns i vuxna bihang efter uppkomst.

Protocol

1. Syntes och beredning dsRNA

  1. Identifiera en 200-800 bp knockdown regionen (för att generera motsvarande dsRNA) i genen av intresse som förutspås ha några identifierbara off-target effekter (t.ex. ingen sekvenshomologi ≥18 bp inom en annan gen) och en negativ kontroll (t.ex. , en heterolog sekvens som inte finns i målet insekt genom, såsom Escherichia coli lacZ-genen (GenBank Gene ID: 945.006). Alternativt kan du använda en positiv kontroll (t.ex., vilket ger en lätt observeras fenotyp, såsom SRPN2 21,22 , GenBank Gene ID:. 1270169) sekvensen för dsRNA targeting SRPN2 definieras i Michel et al (2005) 21..
    Obs: E-RNAi är ett open-source bioinformatik resurs som är användbar för att identifiera sådana områden och för arbetet med att utforma oligonukleotidprimers 23.
  2. utföra standard PCR-amplifiering (dvs., som utförs med Taq-DNA-polymeras med användning av 30-35 cykler) med användning av ett genomiskt DNA eller cDNA-mall för att erhålla dsRNA syntes mall flankerad av en T7-promotorsekvens (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') och fortsätter med dsRNA förberedelse och städa upp med en kommersiell in vitro transkription kit enligt tillverkarens anvisningar. Använd SRPN2 PCR förstärkningsförhållanden och primer information presenteras i An et al. (2011) 22.
  3. Kvantifiera renade RNA amplikon avkastning av ultraviolett absorbans spektroskopi vid våglängden 260 nm och anpassa sig till den önskade koncentrationen (t.ex. 3 mikrogram / ​​l) i RNas-fritt vatten.
    1. För felsökning av låga RNA-koncentrationer, minska vätskevolymen genom att snurra prover ner i en vakuumcentrifug vid rumstemperatur eller genom lyofilisering prover och rekonstituering i mindre volymer vatten. Den tid som krävs för prov lyofilisering kommer att variera beroendepå första provvolymer och dsRNA koncentrationer.
  4. Kontrollera kvaliteten och längden av dsRNA på en 2% agarosgel framställd med 1x TBE eller TAE-buffert och färgades med etidiumbromid (EtBr), tillsammans med mall-DNA som användes för transkriptionsreaktionen. DsRNA kommer att migrera långsammare än mall-DNA. kan bedömas kvalitet och längd genom att säkerställa att det inte finns några icke-specifika dsRNA produkter och genom att jämföra produkter med en standard-DNA-markör, respektive.
    Obs: EtBr är en potent mutagen och bör hanteras därefter.
    Obs: Vid en dsRNA koncentration av 3 mikrogram / l, är 0,5 | j, l av provet mer än tillräckligt för visualisering på EtBr-färgad agarosgel.
  5. Lagra dsRNA vid -20 ° C tills de behövdes. Flera frysning / upptiningscykler kan orsaka nedbrytning, så portioner bör vara redo för stora volymer dsRNA.

2. Förbered Snabb Grön FCF Dye (FGD) Rör

  1. Späd Snabb Grönt FCF färgämnefrån stamlösning (≥85% färghalt) till 0,1% (volym / volym) (arbetslösning) i RNas-fritt vatten.
  2. Pipettera 1 l av färgämne in i botten av en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  3. Placera rören i ett 65 ° C värmeblock under ca 3 timmar för att avdunsta vätska, sedan placera rören vid rumstemperatur under åtminstone 30 min, svalna innan den används. Denna torra fasta färgämnet kommer rekonstruera i dsRNA resuspension lösning.

3. Dra injektionsnålar

  1. Dra borosilikatglas nålar med hjälp av en uppvärmd nål avdragare till en spetsdiameter av 10-30 pm. Dra inställningar motsvarar: Heater inställning nr. 1 = 100, Heater justering nr. 2 = 70.
  2. För att undvika skador på fin spets av nålen, placera alla drog nålar horisontellt i en petriskål på en remsa av gjutning kitt.
    Obs: Ytterligare information för kapillär nål dra metoder kan hittas i ytterligare detalj i Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MR4 manual 24.

4. Förbered Injektion Station

  1. Samla material som krävs: glas microcapillary nålar drog till fin spets, microinjector, tunt filterpapper och tjockt filterpapper, petriskålar, överföringspipetter, pensel och dissekera ljusmikroskop.
  2. Förbered microinjector enligt instruktionerna i microinjector manual, och ställa in injektionsvolym på önskad volym per puls (t.ex. högst 69 nl per puls).
  3. På en plattform som är lätt att manövrera under ett mikroskop (t.ex. platta sidan av en frigolit provrörsställ), stapla de två filterpappersarken med det tunna filterpapper ovanpå och fäst med tejp runt kanterna.
  4. Resuspendera 10 | il av varje dsRNA lösning i separata färgämne rör och placera på is.

5. Samla Puppor för injektion

  1. Fyll en liten 60 mm x 15 mm petriskål med 10 ml avjoniserat vatten, och samla ~ 50 blek puppor (During de första 24 h efter förpuppning) från en insectary kassett med en disponibel plast överföringspipett.
  2. Ta bort eventuella puppor som har medium till mörk nagelband garvning.
    Obs! När nagelbanden börjar att tan, blir det svårare att penetrera nagelband, och injektionsresulterar i mycket högre dödlighet.

6. dsRNA Injektion

  1. Under dissektionsmikroskop, bryta av den distala spetsen av kanylen med ett par fin pincett.
  2. Förbered injektionsnålen genom återfyllning nålen med mineralolja (med användning av en spruta med en 3 tum, 30 gauge nål), och utdrivning överflödig olja med microinjector.
  3. Främre fylla injektionsnålen med maximala mängden dsRNA, och mata ut en puls under mikroskop för att se till dispenseringen av vätska. I händelse av att ingen vätska tas upp och / eller utvisas, kontrollera den distala spetsen av nålen för någon blockering och se till att nålen är ordentligt fastsatt i microinjector.
  4. Välj 1-3 puppor, och placera dem på filterpapper.
  5. Med hjälp av pensel, placera puppor på filterpapper med rygg nagelband tillgänglig, och använda pensel för att driva på filterpapper och absorbera av överflödigt vatten.
  6. Stabilisera puppan med spetsen på penseln och sätt in nålen i rygg nagelbanden mellan bröstkorgen och buken med en vinkel på ungefär 30 ° i förhållande till ryggytan av puppan. Injektion ska riktas mot den bakre änden av puppan och nålen bör flyttas i en anterior till posterior riktning.
  7. Injicera två pulser (69 nl per puls) 3 mikrogram / l dsRNA lösning i hemolymfa och kontrollera distributionen av färg i hela kroppen. Om ingen färg är identifierad, flytta injektionsnål position något för att rensa tips från hindret och upprepa vätsketillförsel.
  8. Använd fuktade pensel för att försiktigt flytta puppa från nålen i vatten för odling. Than puppa bör hålla sig till penseln på lätt kontakt.

7. Post-injektion Villkor

  1. Placera petriskål med injicerat puppor i en mygga bur med lämplig luftflöde (t.ex. mesh bur eller behållare med mesh lock). PUPP uppfödningsförhållanden bör konsekvent ligga kvar på 27 ± 3 ° C temperatur, 75 ± 5% fuktighet och vara under en ljus: mörker-cykel av 16: 8 tim.
  2. Bered en 10% (w / v) glukoslösning, och placera en lösning mättad bomullstuss på mygga bur mesh för vuxna utfodring.

8. Bedöm Knockdown

  1. Vid önskad tid (er), bedöma fenotyper i experimentella dsRNA-injicerade insekter, jämfört med kontroller.
    1. Bedöm dsSRPN2 och dsLacZ insekter dagligen genom kylning ner vuxna i ca 2-3 min vid -20 ° C, överföra dem till en kall platta vid 2 ° C och identifiera eventuella pseudo-tumörbildning genom användning av ett dissektionsmikroskop vid 15Xförstoring med brightfield belysning. Efter bedömning åter vuxna till insectary förhållanden (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% fuktighet).
      Obs: De experimentella och kontroll dsRNA som används i detta protokoll är dsSRPN2 och dsLacZ respektive. Det finns många alternativ som lämpar sig för kontroll; emellertid, föreslås det att en positiv kontroll för vilken fenotyp och / eller uttryck kan lätt visualiseras (t.ex., genom att dissekera mikroskopi) och / eller kvantifieras [t.ex., kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), Western blot] bör användas när man lär sig denna teknik. SRPN2 protein och avskrift kvantifiering via Western blot och QRT-PCR, respektive beskrivs i Michel et al. (2005) 21.

Representative Results

PUPP injektion för gen KD ger optimala resultat när injektion utförs under den tidiga puppstadium, när nagelgarvnivåerna är låga (Figur 1A, vänster, och 1B). Ökad garvning och härdning av nagelband, vanligen efter 24 timmar, resulterar i ökad PUPP död efter injektion (Figur 1A, mitten och höger). Graden av PUPP utveckling kan variera beroende på insectary förhållanden och djurtäthet 24,25; Därför är det bäst att bedöma pigmente visuellt.

Under insprutningsprocessen, är den kapillära nålen införd i den dorsala nagelband i en vinkel av ungefär 30 ° i den främre till bakre riktningen (Figur 2A). När nålen är insatt och dsRNA + 0,01% (w / v) FGD fördelas, är fördelningen av färgämnet uppenbart hela hemolymfa (Figure 2B).

Bedömning av vuxen uppkomst för puppor injicerades med 0,01% (w / v) FGD visade ett genomsnitt på 70% uppkomst, jämfört med 96,7% framväxten av icke-injicerade kontroller (Figur 3A). Att notera var partiell uppkomst från PUPP fall observerades för ett stort antal icke-överlevande mygg (figur 3B). Injicerade djuren uppvisar inga förseningar i uppkomst tid (Figur 4A) eller förspänd påverkan på endera könet (Figur 4B). Ytterligare bedömning av vuxna överlevnad utförts fram till dag 10 efter uppkomst avslöjar ingen uppenbar inverkan på efter uppkomst vuxen överlevnad (figur 4C).

Validering av KD kvalitet bedömdes av melanotiska pseudotumör (mörkt pigmenterad vävnad kluster) fenotyp samband med SRPN2 knockdown 21,22 som en positiv kontroll för knockdown och frånvaro av fenotyper associerade med dsLacZ injektion som en negativ kontroll. Vuxna myggor som framkom poängsattes på dag 8 efter injektion (dag 6-7 efter uppkomst). Melanotiska pseudo-tumörer (figur 5A och 5B) observerades genom nagelbanden av 93,5% av det dsSRPN2 vs. 0% av dsLacZ vuxna myggor (figur 6A). Kluster av mörkt melanized vävnad identifierades vid dissektion av pigmenterade fläckar (Figur 5C). Pseudo-tumörer var synliga på vuxennagelbanden så tidigt som dag 3 efter uppkomst och var också närvarande i en delmängd av dsSRPN2 hemolymfa och tarmvävnader (data ej visade). Vid 5 efter injektionen (tidig vuxenstadiet), minskade signifikant SRPN2 nivåer i dsSRPN2, men inte dsLacZ eller icke-injicerade hemolymph proteinisolat observerades (figur 6B).

ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg "/>
Figur 1: Utvecklings iscensättning för pupal dsRNA injektion tidig puppa injektion av dsRNA resulterar i optimal överlevnad och progression i vuxna stadiet.. Låga nivåer av nagelband pigmente (A, vänster, och B) kan observeras i den första 0-24 timmar efter förpuppning. Garvning av PUPP nagelband föregående injektion (A, mitten och höger) resulterar i måttlig till dålig överlevnad.

figur 2
Figur 2:. Injektion position och fördelning av färgämnesmärkt dsRNA (A) Kapillär nålinjektion av färgämnesmärkt dsRNA i den dorsala nagelband i en vinkel av ungefär 30 °, i främre till bakre riktningen. (B) Färgämnet är synligt fördelad i PUPP hemolymfa. dsRNA injektionsvolym av 138 nl, märkt med 0,01% FGD (vikt / volym).

Figur 3
Figur 3:. Post-injektion vuxen uppkomst (A) 70% av puppor injiceras med 0,01% FGD (vikt / volym) med framgång framkommit (n = 60), jämfört med 96,7% av icke-injicerade kontroller (n = 60). Tre biologiska replikat utfördes. (B) Partiell uppkomst från PUPP fallet observerades för ett stort antal icke-överlevande myggor. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM).

figur 4
Figur 4: Emergence hastighet, bedömning kön och vuxna överlevnad (A) Jämförbara uppkomst gånger observerades efter PUPP injektion med 0,01% FGD (24 h = 80% och 48 h = 20%), jämfört med icke-injicerade puppor (24. hr = 83% och 48 h = 17%). (B (C) Överlevnadsanalys avslöjar att injektion med 0,01% FGD inte påverkar vuxen överlevnad, utvärderas upp till dag 10 efter uppkomsten. Resultaten representerar data från tre oberoende experiment med 0,01% FGD injiceras (n = 60) och icke-injicerade (n = 60) puppor (lika många män och kvinnor). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM).

figur 5
Figur 5: Pseudo-tumör positiv kontroll fenotyp reflekterar framgångsrik knockdown Pseudo tumörer observerades på (A) abdominal och (B) bröstkorg nagelband av dsSRPN2 -inmatade, men inte dsLacZ -inmatade vuxna myggor vid dag 8 efter injektion..(C) Högre förstoring (400X) imaging (a) i nagelband och dissekering av pigmenterade fläckar (b) visar kluster av mörkt melanized celler.

figur 6
Figur 6: Kvantifiering av pseudo-tumörbildning och minskad SRPN2 proteinnivåer (A) puppstadium injektioner resulterar i pseudo-tumörbildning hos 93,5% av dsSRPN2 vuxna (n = 21) jämfört med 0% av dsLacZ kontroller (n = 19). . Resultat erhållna dag 8 efter injektion. (B) Western blot (vänster) visar minskade SRPN2 nivåer i dsSRPN2, men inte dsLacZ eller icke-injicerade hemolymfa proteinisolat (dag 5 efter injektion). Resultaten baseras på tre oberoende experiment. Anti-SRPN2 21 och anti-SRPN3 späd 26 antikropp som användes var 1: 1000 och 1: 2000, respektive. Get-anti-raBBIT IgG-HRP (Product sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) användes vid 1: 5000. Alla proteinnivåer kvantifierades (höger) genom bandintensitet (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normaliserad till SRPN3, och statistiskt jämfördes genom oparade t-test. P <0,05: *, P ≥0.05: ns (ej signifikant). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM).

Discussion

Nuvarande metoder för att inducera icke-transgena RNAi i myggor innebär direkt injektion av dsRNA i vuxen hemocoel 12,13 eller larv utfodring av RNAi skjut belagda nanopartiklar 14-17 eller mikroalger baserade dsRNA molekyler 18. Inriktning vuxen mygga, medan extremt värdefull, kan utesluta ett stort antal gener som fungerar under tidigare utvecklingsperioder. Knockdown initierades av larver utfodring kan ge motsägande fenotyper under vuxenstadiet beror delvis på den potential som variabla protein uthållighet genom puppstadium. Därför införa ytterligare en metod som riktar sig specifikt till att inleda RNAi under PUPP utveckling kommer att ge en möjlighet att mer fullständigt bedöma genfunktioner under pre-vuxna utvecklingsstadier, liksom förbättrade förmåga att bedöma geners funktion under vuxenstadier. Som med gen knockdown strategi som bygger på dsRNA injektion eller uttryck, ihållande gen knockdownkan inte förutsägas. Därför bör transkript eller proteinnivåer bedömas för genen av intresse under utvecklingsperioder av intresse. Även om vi ser en fortsatt minskad proteinnivåer vid dag 5 efter injektion för SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injicerade djur, kan faktorer såsom proteinomsättningen och halveringstid skiljer sig för olika mål. Det är kritiskt för att säkerställa, liksom, att dsRNA som skall användas för injektion är väl koncentrerat och verkar intakt på en agarosgel. Vi rekommenderar experimentatorerna omvärdera dessa faktorer, om knockdown resultaten är inte tillräckliga, och respektive koncentrationer av dsRNA kan behöva testas empiriskt för specifika genmål.

Vi beskriver en metod för initiering av RNA-interferens under puppstadium av An. gambiae utveckling. Denna metod förlitar sig på att införa via mikroinjektion av dsRNA direkt i hemocoel tidiga puppor och möjliggör en bedömning av injektionskvalitet avanvändning av färgämnesmärkt dsRNA. Förmågan att visualisera injektion kvalitet utgör en kritisk förbättring för att säkerställa framgångsrik knockdown och utgör en del av injektionsbaserade gen knockdown som inte har beaktats i de flesta tidigare rapporterade dsRNA-baserade protokoll som fokuserar på den vuxna scenen. Genom att rikta puppan i början av denna utvecklingsperiod, gener som kan spela en roll under denna kritiska utvecklings intervall, eller under de tidiga stadierna av vuxenlivet kan utvärderas funktionellt. Dessutom kan denna metod gör det möjligt dsRNA leverans till celler, och etablering av RNA-interferens i celler som är tillgängliga under metamorfos, men mindre tillgängliga i fullt bildade vuxna myggor.

En ny microarray analys av Harker et al. (2012) identifierade 560 An. gambiae transkript som var upp-reglerade eller nedregleras av åtminstone fyra gånger under olika utvecklingsstadier, från embryot till en vuxen. Av de 560 transkript identifierats, en uppsättning av 309 var upp-regleras under PUPP utveckling 27. Dessa fynd tyder på att det finns många krav på differentiell genuttryck hela mygga utveckling, inklusive de som inträffar under puppstadium, ett intervall under vilket organismen genomgår metamorfos. I många insektsarter, inklusive An. gambiae, gener som är involverade i processer såsom utveckling (dvs pupal cuticular och kitin-bindande proteiner) 27-31 och immunsvar (dvs Toll receptorliknande proteiner) 27,32-34 är starkt uttryckt under puppstadium. När väl en helt formad vuxen har uppstått, finns en fortsatt genuttryck som svar på miljö- och fysiologiska förändringar 35. Noterbart är under tidig vuxen utveckling, det är en ökning i uttrycket av utvecklingsgener (dvs vuxna cuticular och sarkoplasmiska proteiner) 36, samt andra nyckelgener (dvs. 27,36.

Den positiva kontrollen används i utvecklingen av detta protokoll, SRPN2, är en An. gambiae serinproteasinhibitor (serpin). SRPN2 spelar en viktig roll vid den negativa regleringen av insektsmelanin, ett brett spektrum medfödda immunsvar hos insekter 21,22. Knockdown av SRPN2 hos vuxna myggor resulterar i pseudo-tumörbildning 21,22, en fenotyp som är lätt observeras med användning av ljusmikroskop. Med tanke på att denna distinkta fenotyp kan lätt görs i levande insekter, använde vi SRPN2 för första puppstadium RNAi injektioner. Dessutom är SRPN2 uttrycks under alla utvecklingsstadier 37, varigenom åstadkommes ett bra mål för puppstadium RNAi injektion och bedömning av funktion i tidig vuxen. Vi demonstrerar att metoden vi har utvecklat är i stånd att inducera liknande vuxen melanotiska pseud o-tumörbildning som en följd av dsRNA injektioner utförts under puppstadium i utvecklingen. Vid utvecklingen av detta protokoll, har vi observerat att injektion under tidig puppa utveckling (dvs de första 24 h efter larver-PUPP molt) är kritisk för att erhålla optimal vuxen uppkomst. I händelse av att dålig uppkomst erhålles efter injektion, rekommenderar vi staging larver med större noggrannhet, för att erhålla puppor med mindre omfattande nagelband härdning och försäkra tidig puppstadium injektion uppnås. Dessutom kan minimera skador på nagelbanden ger optimal uppkomst priser och ökande förstoring under injektion bidra till att endast den avsedda regionen djuret punkterad. Om nålen skall punktera igenom till den ventrala nagelband, kommer poolning av färgämnesmärkt vätskan vara uppenbart på det yttre av puppan eller kommer att mätta filterpapperet. Det rekommenderas att göra någon puppor som har mer än en nagelband punktering.

jove_content "> Med de omfattande erfarenheter av många laboratorier med utförandet av vuxna mygga injektioner, kan tidigare identifierade mikroinjektion metoder anpassas med enkla protokoll modifieringar för användning i PUPP RNAi-experiment. Totalt sett är målet med denna metod för att ge forskare möjlighet att expandera den tidsram under vilken omvända genetiska analyser kan utföras, ytterligare möjliggör forskning som kommer att stödja utvecklingen av nya strategier vektorkontroll. Intressant experiment i andra arter, såsom Rhodnius prolixus och Spodoptera frugiperda, visar att tysta gener effekter tenderar att vara mycket större när inleddes under pre-vuxen stegen 38,39. under alla stadier av utveckling, är föremål för överväganden när det gäller snabbhet och uthållighet av geners uttryck, och stabiliteten hos proteiner som kodas av riktade gener RNAi-medierad gen knockdown. den idealiska RNAi mål gener tenderar att vara de som kodar för en protein eller RNA som har en kort halveringstid och hög omsättningshastighet 11,40.

Även transgena RNAi strategier också kan användas för att ta itu med överväganden om snabbhet och uthållighet av RNAi under pre-vuxenstadier, transgena tekniker har många nackdelar (t.ex. tid som krävs för generering av transgena linjer, experimentella tidsramar för mygga parningar att generera insekter med reglerad dsRNA uttryck och underhåll av transgena bestånd). Däremot ger våra protokoll en enklare och snabbare metod för att initiera gen knockdown under PUPP utveckling och celltyper som har sitt ursprung och är tillgängliga under metamorfos men är mindre tillgängliga hos vuxna. Användningen av färgämnesmärkta dsRNA suspensioner möjliggör enkel bedömning av injektions framgång och spridning av infört material inom puppor. Våra data om uppkomsten av tumörbildning i PUPP-injicerade vuxna, jämfört med djur som injicerats som vuxna, är förenlig med initiation av RNAi-medierad knockdown under puppstadium. Med vår G3 mygga linje och under våra insectary förhållanden, vi observera vuxna melanotiska pseudo-tumörbildning så tidigt som 10 dagar efter injektion av vuxna injiceras tre till fem dagar efter uppkomst. Genom att utföra tidig pupal stegs injektion, observerar vi synliga melanotiska pseudo-tumörbildning så tidigt som fem dagar efter injektion (dvs tre till fyra dagar efter uppkomst). Dessa data antyder att denna metod möjliggör initiering av genen knockdown under ett tidigare under studerade utvecklingsperiod (dvs pupal utveckling). Vår färgämnesmärkningsmetoden kan även visa sig vara användbar för utveckling av nya larvinjektionsprotokoll, på grund av den genomskinliga naturen av nagelband under alla larver instars. Medan kontrollen användes i denna studie kräver progression i vuxen skede för att visa en knockdown fenotyp, till framtida experiment bedöma puppstadium specifika fenotyper efter injektion av tidig puppor kommer att gevärdefulla insikter om utbyggnad av denna metod i ytterligare utvecklingsperioder som sen PUPP utveckling. Sammanfattningsvis ger denna metod en värdefull RNAi protokoll för puppstadium initiering av RNAi-medierad gen knockdown och expanderar de funktionella genomiska verktyg för användning i vektorn insekt forskarsamhället.

Disclosures

Open Access för denna video-artikeln betalas av Biogen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript RNAi kit Ambion AM1626
Nanoject II injector Drummond 3-000-204
Nanoject II foot switch Drummond 3-000-026
Borosilicate glass capillaries Drummond 3-000-203-G/X
Glass micropipette puller Narishigne PB-7
Fast Green FCF dye Sigma F7258 Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes Thermo Scientific 1371150 ¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper  GE Healthcare 1001-090 This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper BioRad 107-3931 This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Paint brush (size 0) Michael’s Art 10474940 Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope  ----  ----- This can vary based on availability and user preference.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Tags

Infektion Mosquito puppa malaria gambiae vektor injektion dsRNA RNA-interferens RNAi omvänd genetik funktionell genomik
RNAi Trigger Delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Puppor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse,… More

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter