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Biology

में आरएनएआई उत्प्रेरक प्रसव Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53738

Introduction

मलेरिया एक मच्छर जनित संक्रामक रोग हर साल व्यक्तियों के कई लाखों लोगों को प्रभावित करता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की रिपोर्ट है कि 2013 में मलेरिया के कारण लगभग 584000 लोगों की मृत्यु, 78 प्रतिशत, जिनमें से पांच साल 1 से कम आयु के बच्चों में हुई थी। रोगज़नक़ों कि मानव में मलेरिया का कारण प्लाज्मोडियम जीनस के भीतर apicomplexan परजीवी हैं और महिला एनोफ़ेलीज़ मच्छरों द्वारा उनके मानव मेजबान के बीच प्रेषित कर रहे हैं। ट्रांसमिशन तब होता है जब मच्छर एक रक्त भोजन एक व्यक्ति जो संक्रमित है से जमा संक्रामक परजीवी एक असंक्रमित व्यक्ति में एक बाद रक्त भोजन में ले जाता है, और उसके बाद। जीनस एनोफ़ेलीज़ के भीतर, एनोफ़ेलीज़ gambiae सबसे बड़ी vectorial क्षमता के साथ प्रजाति है और उप-सहारा अफ्रीका 1-3 में सबसे प्रमुख मलेरिया वेक्टर है।

वर्तमान में, कीटनाशकों की तैनाती से मच्छर वेक्टर नियंत्रण ख के लिए जारी हैप्रमुख विधि मानव मलेरिया के बोझ को कम करने के लिए कार्यरत ई। हालांकि 1960 के दशक के बाद से कीटनाशकों का उपयोग अत्यंत सफल साबित हो गया है, कीटनाशक प्रतिरोध का उदय उपन्यास कीटनाशकों और वैकल्पिक वेक्टर नियंत्रण रणनीति 4-7 के विकास के लिए एक की जरूरत को प्रेरित किया है। 2010 के दौरान 63 में से 49 देशों के लिए रिपोर्टिंग की कुल मलेरिया वैक्टर 1 में कीटनाशक प्रतिरोध की घटना का संकेत दिया। इसके अतिरिक्त, आईआर मैपर उपकरण है, जो सहकर्मी की समीक्षा की साहित्य Afrotropical क्षेत्रों में प्रतिरोध डेटा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल करता है, रिपोर्ट है कि 2001 और 2012 के बीच वहां pyrethroids और dichlorodiphenyltrichloroethane (डीडीटी) के विरोध में 46% और 27% बढ़ जाती है, क्रमश: 7 थे।

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक तकनीक है कि गहरे नीले रंग संयंत्र 8,9 में और कवक Neurospora घोर 9,10 में जीन को निष्क्रिय करने के लिए नियोजित किया जा सकता है के रूप में 1990 के दशक में पहचान की थी। उसके थोड़ी ही देर बाद,1998 में, आरएनएआई पहले इंजेक्शन या खिलाने के तरीकों के माध्यम से 9,11 antisense या डबल कतरा शाही सेना (dsRNA) के लागू होने से एक पशु मॉडल में जीन की अभिव्यक्ति को कम करने का एक साधन के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस में लिखा गया था। इसकी खोज के बाद से, आरएनएआई शोधकर्ताओं रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग करने के लिए तेजी से एक अत्यधिक चयनात्मक के बाद transcriptional जीन मुंह बंद तंत्र के माध्यम से ब्याज की जीन की कार्यात्मक भूमिका की जांच करने की अनुमति देकर कार्यात्मक जीनोमिक्स का पीछा क्रांति ला दी है। ऐसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के रूप में कुछ जीवों में ट्रांसजेनिक जीवों कि आरएनए हस्तक्षेप निर्माणों को अभिव्यक्त के उपयोग के जीन पछाड़ना (केडी) के लिए व्यापक रूप से सफल रहा है। हालांकि एक में ट्रांसजीन का उपयोग करें। आरएनएआई के लिए gambiae उपयोग किया गया है और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है, ट्रांसजेनिक मच्छर उपभेदों की पीढ़ी दोनों श्रम और समय गहन, आम तौर पर दो से तीन महीनों लेने के Generati के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान से जाना हैएक उपयुक्त ट्रांसजेनिक शेयर 12 के पर। वर्तमान में एक जीन में केडी की प्राथमिक विधि। gambiae इंजेक्शन द्वारा hemolymph में, वयस्क अवस्था के दौरान, dsRNA के किसी जीन 12,13 के लिए विशिष्ट है। यह प्रक्रिया आम तौर पर जीन केडी का आकलन करने के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान से जाने के बारे में एक महीने का समय लगता है, बहुत अधिक ट्रांसजेनिक तरीकों की तुलना में तेजी से 12 साबित हो। लार्वा चरण आरएनएआई के लिए हाल ही में एक तरीके में स्थापित किया गया है। gambiae और nanoparticle 14-17 खिला के माध्यम से या के मौखिक वितरण से एडीज एजिप्टी microalgae आधारित dsRNA 18 अणुओं के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण करने के लिए अवसर की पेशकश की। प्रत्यक्ष इंजेक्शन, भोजन, और nanoparticle प्रसव के तरीके में, dsRNA लक्ष्य सेल द्वारा स्वायत्त हाथ में लिया और cleaved एंजाइम पासा खेलनेवाला द्वारा में 21-25 न्यूक्लियोटाइड-लंबे "लघु आरएनए हस्तक्षेप" (siRNAs) 19,20 है। ये siRNAs तो कर रहे हैं incorporमें पैदा आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC), जिसमें से एक कतरा खारिज कर दिया जाएगा, आरएनए बाध्य RISC जटिल करने के लिए बाध्य करने के लिए और लक्ष्य mRNA फोड़ना और इस तरह अपने स्तर को कम करने और इसके अनुवाद 19,20 बाधित की इजाजत दी।

बुनियादी मच्छर जीव विज्ञान के कई आंतरिक सुविधाओं मेजबान वरीयता (जैसे, गंध, स्वाद), संभोग, प्रजनन और प्रतिरक्षा सहित vectorial क्षमता, व्यवस्थित करना। इन जैविक प्रक्रियाओं के महत्व को देखते हुए यह जरूरी है कि एक आनुवंशिक या औषधीय स्तर पर उनके मॉडुलन वेक्टर नियंत्रण के लिए नए अवसरों, कीटनाशक प्रतिरोध की तरक़ीब सहित पेशकश करेगा, और वेक्टर प्रबंधन के लिए अधिक मोटे तौर पर एकीकृत दृष्टिकोण के लिए नए उपकरण उपलब्ध कराने की संभावना है। कार्यात्मक जीनोमिक्स के उपयोग इन आंतरिक जैविक सुविधाओं अंतर्निहित जीन की भूमिका का आकलन करने के लिए नए लक्ष्य की पहचान सकें और हम कैसे प्रभावी ढंग से नए, अधिक प्रभावी नियंत्रण रणनीति बना सकते में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगाएँ। हम एक से पोटा संबंधी चरण के दौरान आरएनएआई की शुरुआत के लिए विकास और एक तेजी से इंजेक्शन विधि के प्रयोग का वर्णन है। gambiae। हम पालन कि एक आरएनएआई ट्रिगर की पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन प्रारंभिक चरण वयस्कों में परिणामी phenotypes के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है, यानी, जल्दी से यदि पछाड़ना जीन वयस्कों में शुरू किए गए के बाद उद्भव मनाया जाएगा उद्भव के बाद। यह तरीकों जीन पछाड़ना पोटा संबंधी विकास के अंतराल के दौरान शुरुआत और वयस्क चरणों, कि इस तरह के जीन पछाड़ना पोटा संबंधी विकास के दौरान शुरू की जारी रहती है और प्रभावित कर सकते हैं जल्दी वयस्क hemolymph-सुलभ प्रकार की कोशिकाओं, साथ ही प्रकार की कोशिकाओं में विस्तार के लिए सक्षम बनाता है कि कायापलट के दौरान और अधिक hemolymph-सुलभ हैं इस तरह के उद्भव के बाद वयस्क उपांग में पाया संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में वयस्क, की तुलना में।

Protocol

1. संश्लेषण और तैयारी dsRNA

  1. एक 200-800 बीपी पछाड़ना क्षेत्र (इसी dsRNA उत्पन्न करने के लिए) को पहचानें ब्याज की जीन है कि कोई पहचान बंद लक्ष्य प्रभाव है की भविष्यवाणी की है के भीतर (जैसे, एक और जीन के भीतर कोई अनुक्रम अनुरूपता ≥18 बीपी) और एक नकारात्मक नियंत्रण (जैसे , एक heterologous दृश्य है कि इस तरह के कोलाई lacZ जीन के रूप में लक्ष्य कीट जीनोम के भीतर मौजूद नहीं है, (GenBank जीन आईडी: 945,006)। वैकल्पिक रूप से, एक सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, जो इस तरह के SRPN2 21,22 के रूप में एक आसानी से मनाया phenotype पैदावार, का उपयोग , GenBank जीन आईडी:। 1270169) dsRNA को निशाना SRPN2 के अनुक्रम मिशेल एट अल में परिभाषित किया गया है (2005) 21।।
    नोट: ई-आरएनएआई एक खुला स्रोत bioinformatic संसाधन है कि ऐसे क्षेत्रों की पहचान के लिए और oligonucleotide प्राइमरों 23 तैयार करने की प्रक्रिया के लिए उपयोगी है।
  2. एस प्रदर्शन करनाtandard पीसीआर प्रवर्धन (यानी, Taq डीएनए पोलीमरेज़ 30-35 चक्र का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन) (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') एक T7 प्रमोटर अनुक्रम से घिरे dsRNA संश्लेषण टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए एक जीनोमिक डीएनए या सीडीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर और dsRNA तैयारी के साथ आगे बढ़ना है और साफ-अप निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक इन विट्रो प्रतिलेखन किट का उपयोग। उपयोग SRPN2 पीसीआर प्रवर्धन की स्थिति और एक एट अल में प्रस्तुत के रूप में प्राइमर जानकारी। (2011) 22।
  3. 260 एनएम के तरंग दैर्ध्य में पराबैंगनी absorbance स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध शाही सेना amplicon पैदावार यों और RNase मुक्त पानी में वांछित एकाग्रता (जैसे, 3 माइक्रोग्राम / μl) को समायोजित करें।
    1. कम शाही सेना सांद्रता समस्या निवारण के लिए, नमूने कमरे के तापमान पर एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में नीचे कताई द्वारा या नमूने lyophilizing और पानी की छोटी मात्रा में पुनर्गठन से तरल की मात्रा को कम। समय नमूना lyophilization के लिए आवश्यक आधार पर अलग अलग होंगेप्रारंभिक नमूना मात्रा और dsRNA सांद्रता पर।
  4. एक 2% agarose 1x TBE या TAE के साथ तैयार जेल पर गुणवत्ता और dsRNA की लंबाई की जांच बफर और, ethidium ब्रोमाइड (EtBr) के साथ दाग टेम्पलेट प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया डीएनए के साथ। dsRNA टेम्पलेट डीएनए की तुलना में अधिक धीरे पलायन होगा। गुणवत्ता और लंबाई आश्वस्त कोई गैर विशिष्ट dsRNA उत्पादों से देखते हैं और क्रमश: एक मानक डीएनए मार्कर के साथ उत्पादों की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।
    नोट: EtBr एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है और उसके अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    नोट: 3 माइक्रोग्राम / μl की एक dsRNA एकाग्रता में, नमूना के 0.5 μl EtBr से सना हुआ agarose जेल पर दृश्य के लिए पर्याप्त से अधिक है।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर dsRNA स्टोर जब तक जरूरत है। एकाधिक / फ्रीज पिघलना चक्र, गिरावट का कारण हो सकता इसलिए aliquots dsRNA की बड़ी मात्रा के लिए तैयार रहना चाहिए।

2. तैयार फास्ट ग्रीन FCF डाई (FGD) ट्यूबों

  1. पतला फास्ट ग्रीन FCF डाईRNase मुक्त पानी में 0.1% (वी / वी) (काम कर समाधान) के लिए शेयर समाधान (≥85% डाई सामग्री) से।
  2. पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे में डाई के 1 μl।
  3. लगभग 3 घंटे के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में रखें नलियों में कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर तरल, तो जगह ट्यूबों के लिए लुप्त हो जाना, उपयोग करने से पहले शांत करने के लिए। इस सूखी ठोस डाई dsRNA मेजबान समाधान में पुनर्गठित किया जाएगा।

3. खींचो इंजेक्शन सुई

  1. 10-30 माइक्रोन के एक टिप व्यास को एक गर्म सुई खींचने का उपयोग borosilicate ग्लास सुइयों खींचो। सेटिंग्स खींचो के अनुरूप: हीटर समायोजन नहीं। 1 = 100, हीटर समायोजन नहीं। 2 = 70।
  2. सुई की नोक ठीक करने के लिए क्षति से बचने के लिए, मोल्डिंग पोटीन की एक पट्टी पर एक पेट्री डिश में क्षैतिज सभी खींच सुइयों जगह है।
    नोट: केशिका सुई तरीकों खींच लिए अतिरिक्त जानकारी मलेरिया अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक संसाधन केंद्र एम में आगे विस्तार में पाया जा सकता हैR4 मैनुअल 24।

4. इंजेक्शन स्टेशन तैयार

  1. आवश्यक सामग्री ले लीजिए: कांच microcapillary सुई ठीक टिप, microinjector, पतली फिल्टर पेपर और मोटी फिल्टर पेपर, पेट्री डिश, हस्तांतरण pipettes, पेंट ब्रश और विदारक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए खींच लिया।
  2. के रूप में microinjector मैनुअल में निर्देश दिए microinjector तैयार है, और नाड़ी प्रति वांछित मात्रा (जैसे, नाड़ी प्रति 69 nl की अधिकतम) के लिए इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित किया है।
  3. एक मंच एक खुर्दबीन के नीचे पैंतरेबाज़ी करने के लिए आसान है पर (जैसे, एक स्टायरोफोम ट्यूब रैक के फ्लैट की ओर), दो फिल्टर पेपर शीट शीर्ष पर पतली फिल्टर पेपर के साथ हो चुकी है, और किनारों के आसपास टेप के साथ सुरक्षित।
  4. अलग रंग की डाई ट्यूबों में प्रत्येक dsRNA समाधान है, और बर्फ पर जगह के 10 μl Resuspend।

5. इंजेक्शन के लिए Pupae लीजिए

  1. भरें एक छोटे से 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री विआयनीकृत पानी की 10 मिलीलीटर, और इकट्ठा ~ 50 पीला pupae (Duri के साथ पकवानएनजी पहले 24 एक insectary ट्रे एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने से pupation के बाद मानव संसाधन)।
  2. किसी भी pupae है कि अंधेरे छल्ली कमाना से मध्यम निकालें।
    नोट: एक बार छल्ली तन को शुरू होता है, यह बहुत अधिक मारक में छल्ली, और इंजेक्शन परिणाम घुसना करने के लिए और अधिक कठिन हो जाता है।

6. dsRNA इंजेक्शन

  1. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ इंजेक्शन सुई के बाहर का सिरे से टूट गया।
  2. खनिज तेल के साथ सुई (एक 3 इंच, 30 गेज सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग) backfilling, और microinjector के साथ अतिरिक्त तेल को खदेड़ने द्वारा इंजेक्शन सुई तैयार करें।
  3. मोर्चा dsRNA की अधिकतम राशि के साथ इंजेक्शन सुई को भरने, और माइक्रोस्कोप के नीचे एक नाड़ी बेदखल तरल का वितरण सुनिश्चित करने के लिए। घटना है कि कोई तरल हाथ में लिया और / या निष्कासित कर दिया है, किसी भी रुकावट के लिए सुई की नोक के बाहर की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि सुई मजबूती microinjecto में सुरक्षित हैआर।
  4. 1-3 pupae उठाओ, और उन्हें फिल्टर पेपर पर रखें।
  5. तूलिका का प्रयोग, पृष्ठीय छल्ली सुलभ के साथ फिल्टर पेपर पर pupae की स्थिति, और फिल्टर पेपर पर धक्का और किसी भी अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने की तूलिका का उपयोग करें।
  6. तूलिका की नोक के साथ प्यूपा स्थिर है, और प्यूपा के पृष्ठीय सतह के संबंध में लगभग 30 डिग्री के कोण पर छाती और पेट के बीच पृष्ठीय छल्ली में सुई डालने। इंजेक्शन प्यूपा और सुई के पीछे के अंत की ओर निर्देशित किया जाना चाहिए एक पूर्वकाल के लिए पीछे दिशा में ले जाया जाना चाहिए।
  7. hemolymph में 3 माइक्रोग्राम / μl dsRNA समाधान के दो दालों (नाड़ी प्रति 69 nl) इंजेक्षन, और पूरे शरीर में रंग के वितरण के लिए जाँच करें। कोई रंग की पहचान की है, तो रुकावट से टिप स्पष्ट करने के लिए थोड़ा इंजेक्शन सुई की स्थिति पारी और तरल वितरण दोहराएँ।
  8. गीला तूलिका का प्रयोग धीरे संवर्धन के लिए पानी में सुई से प्यूपा स्थानांतरित करने के लिए। टीवह प्यूपा प्रकाश संपर्क पर तूलिका के लिए रहना चाहिए।

7. बाद इंजेक्शन शर्तें

  1. उपयुक्त airflow (जैसे, जाल या जाल पिंजरे ढक्कन के साथ कंटेनर) के साथ एक मच्छर पिंजरे में इंजेक्शन pupae के साथ पेट्री डिश रखें। पोटा संबंधी पालन की स्थिति 27 ± 3 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर लगातार रहना चाहिए, 75 ± 5% आर्द्रता और एक प्रकाश के तहत: 8 घंटा: 16 के अंधेरे चक्र।
  2. एक 10% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज समाधान तैयार है, और मच्छर पिंजरे पर एक समाधान संतृप्त कपास गेंद जगह वयस्क के भोजन के लिए जाल।

8. आकलन पछाड़ना

  1. वांछित समय बिंदु (ओं) पर, नियंत्रण की तुलना में, प्रयोगात्मक dsRNA इंजेक्शन कीड़ों में phenotypes का आकलन करें।
    1. दैनिक आकलन dsSRPN2 और dsLacZ कीड़ों -20 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए वयस्कों के नीचे डरावना, 2 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडा थाली करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने और 15X पर एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किसी भी छद्म ट्यूमर गठन की पहचान के द्वाराbrightfield रोशनी के साथ बढ़ाई। मूल्यांकन के बाद, insectary की स्थिति (27 ± 3 डिग्री सेल्सियस, 75 ± 5% आर्द्रता) करने के लिए वयस्कों वापसी।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में कार्यरत प्रयोगात्मक और नियंत्रण dsRNAs dsSRPN2 और dsLacZ, क्रमशः रहे हैं। वहाँ नियंत्रण के लिए उपयुक्त कई विकल्प हैं; हालांकि, यह सुझाव दिया है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए जो phenotype और / या अभिव्यक्ति आसानी से कल्पना की जाती है और / या मात्रा निर्धारित [जैसे, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT- पीसीआर), पश्चिमी धब्बा] इस्तेमाल किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोपी विदारक द्वारा) जब इस तकनीक। SRPN2 प्रोटीन और पश्चिमी धब्बा और QRT- पीसीआर के माध्यम से प्रतिलिपि मात्रा का ठहराव सीखने, क्रमशः, मिशेल एट अल। (2005), 21 में वर्णित हैं।

Representative Results

जीन केडी पैदावार इष्टतम परिणाम जब इंजेक्शन जल्दी पोटा संबंधी चरण के दौरान किया जाता है, छल्ली कमाना स्तर कम कर रहे हैं जब (चित्रा 1 ए, छोड़ दिया, और 1 बी) के लिए पोटा संबंधी इंजेक्शन। वृद्धि कमाना और छल्ली का सख्त, आम तौर पर 24 घंटे, इंजेक्शन के बाद वृद्धि हुई पोटा संबंधी मौत में परिणाम (चित्रा 1 ए, केंद्र और दाएं) के बाद। पोटा संबंधी विकास की दर insectary की स्थिति और पशु घनत्व 24,25 के आधार पर भिन्न कर सकते हैं; इसलिए, यह नेत्रहीन रंजकता का आकलन करने के लिए सबसे अच्छा है।

इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, केशिका सुई पीछे दिशा (2A चित्रा) के लिए पूर्वकाल में लगभग 30 डिग्री के कोण पर पृष्ठीय छल्ली में डाला जाता है। एक बार सुई डाला जाता है और dsRNA + 0.01% (w / v) FGD तिरस्कृत है, डाई का वितरण स्पष्ट hemolymph भर है (figuफिर 2 बी)।

Pupae के लिए वयस्क उद्भव का आकलन 0.01% (w / v) FGD गैर इंजेक्शन नियंत्रण (चित्रा 3 ए) के 96.7% उद्भव की तुलना में 70% उद्भव की औसत दर से पता चला है के साथ इंजेक्शन। ध्यान से, पोटा संबंधी मामले से आंशिक उद्भव गैर जीवित मच्छरों (चित्रा 3 बी) की एक बड़ी संख्या के लिए मनाया गया। इंजेक्शन पशुओं उद्भव के समय में कोई देरी (चित्रा 4 ए) या ​​या तो लिंग (चित्रा 4 बी) पर पक्षपातपूर्ण प्रभाव दिखा रहे हैं। वयस्क जीवित रहने की अतिरिक्त आकलन दिन तक बाहर किए गए 10 के बाद के उद्भव के बाद के उद्भव वयस्क अस्तित्व (चित्रा 4C) पर कोई स्पष्ट प्रभाव का पता चलता है।

केडी गुणवत्ता के मान्यकरण melanotic छद्म ट्यूमर (अंधेरे में pigmented ऊतक क्लस्टर) phenotype SRPN2 के साथ जुड़े और पछाड़ना के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 21,22 पछाड़ना द्वारा मूल्यांकन किया गया था एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में dsLacZ इंजेक्शन के साथ जुड़े phenotypes के अभाव। एडल्ट मच्छरों कि उभरा दिन 8 के बाद इंजेक्शन (6-7 दिन के बाद उद्भव) में रन बनाए थे। Melanotic छद्म ट्यूमर (चित्रा 5 ए और 5 ब) dsSRPN2 बनाम की 93.5% की छल्ली के माध्यम से मनाया गया DsLacZ वयस्क मच्छरों (चित्रा 6A) के 0%। अंधेरे में melanized ऊतक के समूहों pigmented पैच (चित्रा 5C) के विच्छेदन पर पहचान की गई। छद्म ट्यूमर के रूप में जल्दी 3 दिन के बाद उद्भव के रूप में वयस्क छल्ली पर दिखाई दे रहे थे और यह भी dsSRPN2 hemolymph और पेट के ऊतकों की एक सबसेट में उपस्थित थे (डेटा) नहीं दिखाया। 5 के बाद इंजेक्शन (प्रारंभिक वयस्क अवस्था) में काफी dsSRPN2 में SRPN2 का स्तर कम है, लेकिन dsLacZ या गैर इंजेक्शन hemolymph प्रोटीन आइसोलेट्स नहीं मनाया गया (चित्रा 6B)।

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चित्रा 1: पोटा संबंधी dsRNA इंजेक्शन के लिए विकासात्मक मचान वयस्क अवस्था में इष्टतम अस्तित्व और प्रगति में dsRNA परिणामों के प्रारंभिक पोटा संबंधी इंजेक्शन।। छल्ली रंजकता के निम्न स्तर (ए, छोड़ दिया, और बी) के पहले 0-24 मानव संसाधन निम्नलिखित pupation भीतर देखा जा सकता है। पोटा संबंधी छल्ली पूर्ववर्ती इंजेक्शन गरीब अस्तित्व के लिए मध्यम में (ए, केंद्र और सही) परिणामों की टेनिंग।

चित्र 2
चित्रा 2:। इंजेक्शन स्थिति और पृष्ठीय छल्ली में डाई लेबल dsRNA की डाई लेबल dsRNA (ए) केशिका सुई इंजेक्शन के वितरण के लगभग 30 डिग्री के कोण पर, पूर्वकाल में दिशा पीछे। (बी) डाई दिख पोटा संबंधी hemolymph में वितरित किया जाता है। 138 nl की dsRNA इंजेक्शन की मात्रा 0.01% एफ के साथ लेबलजीडी (डब्ल्यू / वी)।

चित्र तीन
चित्रा 3:। के बाद इंजेक्शन वयस्क उद्भव (ए) pupae के 70% गैर इंजेक्शन नियंत्रण (एन = 60) की 96.7% की तुलना में 0.01% FGD के साथ इंजेक्शन (डब्ल्यू / वी) सफलतापूर्वक उभरा (एन 60 =)। तीन जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया। (बी) पोटा संबंधी मामले से आंशिक उद्भव गैर जीवित मच्छरों की एक बड़ी संख्या के लिए मनाया गया। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4: उभार दर, सेक्स आकलन और वयस्क अस्तित्व (ए) गैर इंजेक्शन pupae की तुलना में तुलनात्मक उद्भव बार, 0.01% FGD (24 घंटा = 80% और 48 घंटा = 20%) के साथ पोटा संबंधी इंजेक्शन के बाद मनाया गया (24। मानव संसाधन = 83% और 48 घंटा = 17%)। (बी (सी) जीवन रक्षा विश्लेषण से पता चलता है कि 0.01% FGD के साथ इंजेक्शन वयस्क अस्तित्व को प्रभावित नहीं करता, दिन 10 के बाद के उद्भव के लिए ऊपर का आकलन किया। परिणाम इंजेक्शन 0.01% FGD के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 60) और गैर इंजेक्शन (एन = 60) pupae (पुरुषों और महिलाओं की बराबर संख्या) के आंकड़ों का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5: छद्म ट्यूमर सकारात्मक नियंत्रण phenotype सफल पछाड़ना दर्शाता छद्म ट्यूमर (ए) के पेट और (बी) dsSRPN2 के वक्ष छल्ली -injected पर मनाया गया, लेकिन दिन 8 के बाद इंजेक्शन पर -injected वयस्क मच्छर dsLacZ नहीं।।(सी) उच्च आवर्धन (400X) इमेजिंग (क) छल्ली और pigmented पैच के विच्छेदन की (ख) अंधेरे में melanized कोशिकाओं के समूहों का पता चलता है।

चित्रा 6
चित्रा 6: छद्म ट्यूमर गठन की मात्रा और SRPN2 प्रोटीन का स्तर कम किया है (ए) पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन dsSRPN2 वयस्कों के 93.5% में छद्म ट्यूमर गठन में परिणाम (एन 21 =) dsLacZ नियंत्रण के 0% (एन = 19) की तुलना में। । परिणाम 8 दिन बाद इंजेक्शन प्राप्त की। (बी) के पश्चिमी धब्बा (बाएं) से पता चलता है SRPN2 स्तरों dsSRPN2 में कमी आई है, लेकिन नहीं dsLacZ या गैर इंजेक्शन hemolymph प्रोटीन आइसोलेट्स (5 दिन बाद इंजेक्शन)। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के आधार पर। 1000 और 1: 2,000 क्रमश: एंटी SRPN2 21 और विरोधी SRPN3 26 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया dilutions 1 थे। बकरी विरोधी Ra5000: bbit आईजीजी एचआरपी (उत्पाद SC-2004, सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी, डलास TX) 1 में इस्तेमाल किया गया था। सभी प्रोटीन का स्तर SRPN3 करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया (दाएं) बैंड तीव्रता (ImageJ सॉफ्टवेयर, एनआईएच, बेथेस्डा, एमडी), सामान्यीकृत द्वारा, और सांख्यिकीय unpaired टी परीक्षण के द्वारा की तुलना में। पी <0.05: *, पी ≥0.05: एनएस (महत्वपूर्ण) नहीं है। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

मच्छरों में गैर ट्रांसजेनिक आरएनएआई उत्प्रेरण के लिए मौजूदा तरीकों वयस्क hemocoel 12,13 या आरएनएआई ट्रिगर लेपित नैनोकणों 14-17 या microalgae आधारित अणुओं dsRNA 18 के लार्वा खिला में dsRNA के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है। वयस्क मच्छर लक्ष्य निर्धारण, जबकि अत्यंत मूल्यवान, जीन है कि पहले विकास की अवधि के दौरान कार्य की एक बड़ी संख्या को बाहर कर सकते हैं। लार्वा खिला द्वारा शुरू पछाड़ना असंगत phenotypes कारण वयस्क अवस्था के दौरान भाग में, चर प्रोटीन हठ की क्षमता के लिए पोटा संबंधी मंच के माध्यम से उपज हो सकती है। इसलिए, एक अतिरिक्त तरीका है कि पोटा संबंधी विकास के दौरान आरएनएआई की शुरुआत और पूरी तरह से पूर्व वयस्क विकास के चरणों के दौरान जीन काम करता है, साथ ही बढ़ाया क्षमताओं का आकलन करने के लिए वयस्क चरणों के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक साधन प्रदान करेगा पर विशेष रूप से शुरू करने के उद्देश्य से है। जीन पछाड़ना dsRNA इंजेक्शन या अभिव्यक्ति, जीन के हठ पछाड़ना पर आधारित दृष्टिकोण के साथ के रूप मेंभविष्यवाणी नहीं की जा सकती है। इसलिए, प्रतिलिपि या प्रोटीन का स्तर हित के विकास की अवधि के दौरान ब्याज की जीन के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। हालांकि हम एक निरंतरता का निरीक्षण SRPN2 dsRNA इंजेक्शन पशुओं में SRPN2 के लिए 5 दिन के बाद इंजेक्शन में प्रोटीन का स्तर कम है, इस तरह के प्रोटीन कारोबार और आधा जीवन जैसे कारकों विभिन्न लक्ष्यों के लिए अलग कर सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित किया है कि dsRNA इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और एक agarose जेल पर बरकरार प्रकट होता है। हम अनुशंसा करते हैं प्रयोगकर्ताओं इन कारकों पुनर्मूल्यांकन यदि पछाड़ना परिणामों के लिए पर्याप्त नहीं हैं, और dsRNA के संबंधित सांद्रता विशिष्ट जीन लक्ष्य के लिए अनुभव से परीक्षण किया जाना पड़ सकता है।

हम एक से पोटा संबंधी चरण के दौरान शाही सेना के हस्तक्षेप की दीक्षा के लिए एक विधि का वर्णन है। gambiae विकास। इस विधि dsRNA के microinjection के माध्यम से परिचय सीधे जल्दी pupae के hemocoel में पर निर्भर करता है और इंजेक्शन द्वारा गुणवत्ता के आकलन के लिए अनुमति देता हैडाई लेबल dsRNA का उपयोग करें। इंजेक्शन गुणवत्ता कल्पना करने की क्षमता सफल पछाड़ना सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि का गठन किया और इंजेक्शन आधारित जीन पछाड़ना है कि सबसे पहले की रिपोर्ट dsRNA आधारित प्रोटोकॉल वयस्क अवस्था पर ध्यान केंद्रित में विचार नहीं किया गया है का एक पहलू का गठन किया। इस विकास की अवधि, जीन है कि इस महत्वपूर्ण विकास अंतराल के दौरान एक भूमिका निभा सकता है की शुरुआत में प्यूपा को लक्षित करके, या वयस्कता के प्रारंभिक दौर में कार्यात्मक रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। साथ ही, इस विधि कोशिकाओं है कि कायापलट के दौरान पहुंच रहे हैं में कोशिकाओं को dsRNA वितरण, और शाही सेना के हस्तक्षेप की स्थापना के लिए सक्षम हो सकता है, लेकिन पूरी तरह से बनाई वयस्क मच्छरों में कम से सुलभ है।

हार्कर एट अल द्वारा हाल ही में माइक्रोएरे विश्लेषण। (2012) 560 एक की पहचान की। gambiae टेप कि विनियमित रहे थे या अलग विकास के चरणों के दौरान कम से कम 4 गुना से नीचे विनियमित, भ्रूण से वयस्क को लेकर। 56 की0 टेप पहचान, 309 का एक सेट पोटा संबंधी विकास के दौरान 27 विनियमित किया गया था। इन निष्कर्षों को सुझाव है कि उन लोगों पोटा संबंधी चरण के दौरान पाए जाते हैं, एक अंतराल के दौरान जो जीव कायापलट की प्रक्रिया से गुजरते सहित मच्छर विकास में अंतर जीन अभिव्यक्ति के लिए कई आवश्यकताओं, देखते हैं कि। एक सहित कई कीट प्रजातियों में। gambiae, इस तरह के विकास (यानी, पोटा संबंधी चर्म संबंधी और काइटिन बाध्यकारी प्रोटीन) के रूप में की प्रक्रिया में शामिल जीन 27-31 और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (यानी, टोल रिसेप्टर की तरह प्रोटीन) 27,32-34 अत्यधिक पोटा संबंधी चरण के दौरान व्यक्त कर रहे हैं। एक बार एक पूरी तरह से बनाई वयस्क उभरा है, वहाँ पर्यावरण और शारीरिक परिवर्तनों से 35 के जवाब में जीन अभिव्यक्ति जारी रखा है। विशेष रूप से, जल्दी वयस्क विकास के दौरान, वहां विकास जीन (यानी, वयस्क चर्म संबंधी और sarcoplasmic प्रोटीन) 36, की अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ-साथ अन्य प्रमुख जीन है (यानी 27,36।

सकारात्मक इस प्रोटोकॉल, SRPN2 के विकास में इस्तेमाल नियंत्रण, एक एक है। gambiae सेरीन protease अवरोध (serpin)। SRPN2 कीट melanization, कीड़े 21,22 में एक व्यापक स्पेक्ट्रम सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नकारात्मक नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। छद्म ट्यूमर गठन 21,22, एक phenotype है कि आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के द्वारा मनाया जाता है में वयस्क मच्छरों परिणामों में SRPN2 की पछाड़ना। यह देखते हुए कि यह अलग phenotype आसानी से लाइव कीड़ों में रन बनाए जा सकते हैं, हम प्रारंभिक पोटा संबंधी चरण आरएनएआई इंजेक्शन के लिए SRPN2 इस्तेमाल किया। इसके अलावा, सभी SRPN2 विकास के चरणों 37 के दौरान व्यक्त किया जाता है, जिससे जल्दी वयस्क में पोटा संबंधी चरण आरएनएआई इंजेक्शन और समारोह के आकलन के लिए एक अच्छा लक्ष्य प्रदान करते हैं। हम जानते हैं कि विधि हम विकसित किया है उत्प्रेरण समान वयस्क melanotic pseud में सक्षम है का प्रदर्शन विकास की पोटा संबंधी चरण के दौरान प्रदर्शन किया dsRNA इंजेक्शन का एक परिणाम के रूप में ओ-ट्यूमर गठन। इस प्रोटोकॉल के विकास में, हम जल्दी पोटा संबंधी विकास के दौरान कहा कि इंजेक्शन मनाया है (यानी, लार्वा-पोटा संबंधी गिरना के बाद पहली बार 24 घंटे) इष्टतम वयस्क उद्भव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। घटना है कि गरीब उद्भव के बाद इंजेक्शन प्राप्त की है में, हम अधिक से अधिक सटीकता के साथ लार्वा मंचन सलाह देते हैं, कम व्यापक छल्ली सख्त से pupae प्राप्त करने और विश्वास दिलाता हूं जल्दी पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन करने के लिए हासिल की है। इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान इष्टतम उद्भव दरों में छल्ली परिणामों को होने वाले नुकसान को कम करने और बढ़ती बढ़ाई सुनिश्चित करना है कि पशु का केवल इरादा क्षेत्र की हवा निकाल दी है कर सकते हैं। यदि सुई उदर छल्ली के माध्यम से पंचर चाहिए, डाई लेबल तरल की पूलिंग प्यूपा के बाहरी पर स्पष्ट हो जाएगा या फिल्टर पेपर तर जाएगा। यह अत्यधिक किसी भी pupae एक से अधिक छल्ली पंचर है कि त्यागने के लिए सिफारिश की है।

jove_content "> वयस्क मच्छर इंजेक्शन के प्रदर्शन के साथ कई प्रयोगशालाओं का व्यापक अनुभव के साथ, पहले से पहचान microinjection दृष्टिकोण पोटा संबंधी आरएनएआई प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए सरल प्रोटोकॉल संशोधनों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि के लक्ष्य के शोधकर्ताओं की क्षमता प्रदान करने के लिए है समय सीमा के दौरान जो रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण करती है, किया जा सकता है और अधिक अनुसंधान कि उपन्यास वेक्टर नियंत्रण रणनीति के विकास का समर्थन करेंगे सक्षम करने के लिए विस्तार। दिलचस्प है, इस तरह के Rhodnius prolixus और स्पोडोप्टेरा frugiperda के रूप में अन्य प्रजातियों में प्रयोगों, कि जीन मुंह बंद प्रभाव ज्यादा हो जाते हैं पता चलता है अधिक से अधिक जब पूर्व वयस्क के दौरान शुरू 38,39 चरणों। विकास के सभी चरणों के दौरान, आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना जीन तेज़ी और जीन मुंह बंद करने के हठ, और लक्षित जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन की स्थिरता के बारे में विचार करने का विषय है। आदर्श आरएनएआई लक्ष्य जीन उन है कि एक protei सांकेतिक शब्दों में बदलना हो जाते हैंn या आरएनए एक कम आधा जीवन और उच्च कारोबार दर 11,40 है।

ट्रांसजेनिक आरएनएआई रणनीतियों भी पूर्व वयस्क चरणों के दौरान तेज़ी और आरएनएआई के हठ के बारे में विचार कर समाधान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, ट्रांसजेनिक तकनीक में कई कमियां (जैसे, ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक समय, प्रयोगात्मक मच्छर matings कीड़े उत्पन्न करने के लिए समय-फ्रेम है विनियमित dsRNA अभिव्यक्ति, और ट्रांसजेनिक शेयरों के रखरखाव) के साथ। इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल पोटा संबंधी विकास के दौरान और सेल प्रकार है कि आरंभ और कायापलट दौरान सुलभ हैं, लेकिन वयस्कों में कम पहुंच रहे हैं में जीन पछाड़ना शुरू करने के लिए एक आसान और तेजी से विधि देता है। डाई लेबल dsRNA निलंबन के उपयोग के इंजेक्शन की सफलता का आकलन आसान और pupae के भीतर शुरू की सामग्री के प्रसार के लिए अनुमति देता है। पोटा संबंधी इंजेक्शन वयस्कों में ट्यूमर गठन की शुरुआत पर हमारे डेटा, वयस्कों के रूप में इंजेक्शन पशुओं, की तुलना में init के अनुरूप हैपोटा संबंधी चरण के दौरान की iation आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना। हमारे जी 3 मच्छर लाइन का उपयोग करना है और हमारे insectary परिस्थितियों में, हम वयस्क melanotic छद्म ट्यूमर गठन के रूप में जल्दी के रूप में 10 दिनों वयस्कों के बाद इंजेक्शन तीन से पाँच दिनों इंजेक्शन के बाद उद्भव निरीक्षण करते हैं। जल्दी पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन प्रदर्शन करके, हम के रूप में जल्दी से पांच दिनों के बाद इंजेक्शन (यानी, तीन से चार दिनों के बाद उद्भव) के रूप में दिखाई दे melanotic छद्म ट्यूमर गठन निरीक्षण करते हैं। इन आंकड़ों का मतलब यह है कि इस विधि के तहत एक पहले से अध्ययन विकासात्मक अवधि (यानी, पोटा संबंधी विकास) के दौरान जीन पछाड़ना की दीक्षा सक्षम बनाता है। हमारे डाई लेबलिंग विधि भी सभी लार्वा instars दौरान छल्ली की पारदर्शी प्रकृति के कारण, नए लार्वा इंजेक्शन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल नियंत्रण एक पछाड़ना phenotype प्रदर्शित करने के लिए वयस्क अवस्था में प्रगति की आवश्यकता है, वहीं भविष्य प्रयोगों जल्दी pupae के इंजेक्शन प्रदान करेगा निम्नलिखित पोटा संबंधी चरण-विशिष्ट phenotypes आकलन करने के लिएअतिरिक्त विकासात्मक अवधियों में इस विधि के विस्तार के बारे में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि इस तरह देर से पोटा संबंधी विकास के रूप में। सारांश में, इस विधि आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना की पोटा संबंधी चरण दीक्षा के लिए एक मूल्यवान आरएनएआई प्रोटोकॉल प्रदान करता है और कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण वेक्टर कीट अनुसंधान समुदाय के भीतर उपयोग के लिए उपलब्ध फैलता है।

Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript RNAi kit Ambion AM1626
Nanoject II injector Drummond 3-000-204
Nanoject II foot switch Drummond 3-000-026
Borosilicate glass capillaries Drummond 3-000-203-G/X
Glass micropipette puller Narishigne PB-7
Fast Green FCF dye Sigma F7258 Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes Thermo Scientific 1371150 ¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper  GE Healthcare 1001-090 This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper BioRad 107-3931 This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Paint brush (size 0) Michael’s Art 10474940 Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope  ----  ----- This can vary based on availability and user preference.

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References

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में आरएनएआई उत्प्रेरक प्रसव<em&gt; एनोफ़ेलीज़ gambiae</em&gt; Pupae
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Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).More

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).

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