Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi Trigger Levering ind Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53738
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

Introduction

Malaria er en myg-bårne smitsom sygdom, der påvirker mange millioner individer hvert år. World Health Organization (WHO) rapporterer, at i 2013 var der cirka 584 tusind dødsfald som følge af malaria, 78 procent, der fandt sted i børn under fem år 1. De patogener, der forårsager menneskelig malaria er Apicomplexan parasitter inden for slægten Plasmodium og overføres mellem deres menneskelige værter af kvindelige Anopheles myg. Transmission opstår, når myg tager en blodmel fra en person, der er inficeret, og derefter indskud infektiøse parasitter i en ikke-inficerede individ i en efterfølgende blod måltid. Inden for slægten Anopheles, malariamyg er arten med størst vektorielt kapacitet og er den mest fremtrædende malaria vektor i Afrika syd for Sahara 1-3.

I øjeblikket myg vektor kontrol indsættelse af insekticider fortsætter med at be den største metode anvendt til at mindske byrden af ​​menneskelige malaria. Selv om anvendelsen af insekticider siden 1960'erne har vist sig at være yderst vellykket, har fremkomsten af insekticid resistens drevet et behov for udvikling af nye insekticider og alternativ vektor styringsstrategier 4-7. I løbet af 2010 er angivet i alt 49 af 63 lande, der indberettede til WHO forekomsten af insekticidresistens i malaria vektorer 1. Derudover IR Mapper værktøj, som udnytter peer-reviewed litteratur for at vurdere resistens data i Afrotropical regioner, rapporterer, at mellem 2001 og 2012 var der 46% og 27% stigninger i modstand mod pyrethroider og dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), henholdsvis 7.

RNA-interferens (RNAi) blev identificeret i begyndelsen af 1990'erne som en teknik, der kan anvendes til at inaktivere gener i Petunia plante 8,9 og i svampen Neurospora crassa 9,10. Kort tid derefter,i 1998 blev RNAi først dokumenteret i Caenorhabditis elegans som et middel til at reducere genekspression i en dyremodel ved indføring af antisense eller dobbelt-strenget RNA (dsRNA) via injektion eller fodring metoder 9,11. Siden opdagelsen har RNAi revolutioneret udøvelse af funktionel genomforskning ved at give forskere til at udnytte revers genetik til hurtigt at undersøge de funktionelle roller gener af interesse via en meget selektiv post-transkriptionel gendæmpning mekanisme. I nogle organismer, såsom Drosophila melanogaster, har anvendelsen af transgene organismer, som udtrykker interfererende RNA-konstruktioner været bredt vellykket for gen knockdown (KD). Selv om anvendelsen af transgener i An. gambiae for RNAi er blevet udnyttet, og kan vise sig nyttig til store skærme, frembringelsen af transgene myg stammer er både arbejds- og tidskrævende, generelt tage to til tre måneder at gå fra identifikation af et gen af interesse for Generatipå en passende transgen lager 12. I øjeblikket er den primære metode til gen KD i An. gambiae er ved injektion i hæmolymfe, under voksne stadium, af dsRNA er specifik for et givet gen 12,13. Denne proces tager typisk omkring en måned at gå fra identifikation af et gen af interesse til vurdering af gen KD, viser sig at være langt hurtigere end transgene metoder 12. Fremgangsmåder til larvestadiet-fase RNAi er blevet etableret for nylig i An. gambiae og Aedes aegypti via nanopartikel fodring 14-17 eller ved oral levering af mikroalger-baserede dsRNA molekyler 18, som giver mulighed for at udføre funktionel genomisk analyse i tidlige stadier af udvikling. I direkte indsprøjtning, fodring, og nanopartikler formidlingsmetoder, er dsRNA taget op autonomt af målcellen og spaltes af enzymet Dicer i 21-25 nukleotider lange "kort interfererende RNA" (siRNAs) 19,20. Disse siRNA'er derefter incorporated ind i RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), hvorfra en streng vil blive kasseret, hvilket tillader RNA-bundne RISC-komplekset at binde til og spalte mål-mRNA og derved reducere dens niveau og inhibere dets oversættelse 19,20.

Mange iboende træk ved grundlæggende myg biologi modulere vektorielt kapacitet, herunder vært præference (f.eks lugtesansen, gustation), parring, reproduktion og immunitet. I betragtning af betydningen af ​​disse biologiske processer, er det sandsynligt, at deres modulation på en genetisk eller farmakologisk niveau vil give nye muligheder for vektorstyring, herunder omgåelse af insekticidresistens, og give nye værktøjer til mere bredt integrerede tilgange til vektor management. Brugen af ​​funktionel genomforskning at vurdere roller gener bag disse iboende biologiske funktioner vil gøre det muligt at identificere nye mål og give ny indsigt i, hvordan vi effektivt kan skabe nye, mere effektiv kontrol strategerne. Vi beskriver udviklingen og anvendelsen af en hurtig injektion metode til initiering RNAi under puppestadiet af An. gambiae. Vi observerer, at puppestadiet injektion af en RNAi trigger muliggør observation af de resulterende fænotyper i fase voksne tidlige, dvs. hurtigere efter fremkomsten end man ville observeres, hvis gen knockdown blev påbegyndt hos voksne efter fremkomst. Denne metoder muliggør gen knockdown der begynder i puppe udviklingsmæssige interval og strækker sig ind voksne stadier, således at gen knockdown påbegyndt i puppe udvikling kan vare og påvirke tidligt voksne hemolymph-tilgængelige celletyper, samt celletyper, der er mere hemolymph-tilgængelige under forvandling end i den voksne, såsom sensoriske neuroner findes i voksent vedhæng følgende fremkomst.

Protocol

1. Syntese og Fremstilling dsRNA

  1. Identificere en 200-800 bp knockdown region (for at generere den tilsvarende dsRNA) inden for genet af interesse, som forventes at have nogen identificerbare ikke-tilsigtede virkninger (f.eks, ingen sekvenshomologi ≥18 bp inden andet gen) og en negativ kontrol (f.eks , en heterolog sekvens, som ikke findes inden for målet insekt-genomet, såsom Escherichia coli lacZ-genet (GenBank Gene ID: 945.006). Alternativt bruge en positiv kontrol (f.eks, hvilket giver en let observeret fænotype, såsom SRPN2 21,22 GenBank Gene ID:. 1270169) sekvensen af det målsøgende SRPN2 dsRNA er defineret i Michel et al (2005) 21..
    Bemærk: E-RNAi er et open-source bioinformatik ressource, der er nyttigt til identifikation af sådanne regioner og for processen med at designe oligonucleotidprimere 23.
  2. Udfør standard PCR-amplifikation (dvs. udført med Taq-DNA-polymerase under anvendelse af 30-35 cyklusser) ved anvendelse af et genomisk DNA eller cDNA-skabelon til opnåelse dsRNA syntese skabelon flankeret af en T7-promotorsekvens (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') og fortsæt med dsRNA forberedelse og oprydning anvendelse af et kommercielt in vitro transcription kit i henhold til producentens anvisninger. Brug SRPN2 PCR amplifikationsbetingelserne og primer information, som præsenteres i An et al. (2011) 22.
  3. Kvantificere oprensede RNA amplicon udbytter ved ultraviolet absorbans spektroskopi ved en bølgelængde på 260 nm og juster til den ønskede koncentration (f.eks 3 pg / pl) i RNase-frit vand.
    1. For fejlfinding lave RNA koncentrationer, reducere væskevolumen ved spinning prøver ned i et vakuum centrifuge ved stuetemperatur eller ved lyofilisering prøver og rekonstituering i mindre mængder vand. Den nødvendige tid til prøve lyofilisering vil variere afhængigtvedrørende oprindelige prøvevolumener og dsRNA koncentrationer.
  4. Kontrollere kvaliteten og længden af ​​dsRNA'et på en 2% agarosegel fremstillet med 1x TBE eller TAE buffer og farvet med ethidiumbromid (EtBr), sammen med skabelon-DNA anvendes til transkriptionsreaktion. DsRNA'et vil migrere langsommere end skabelon-DNA. Kvalitet og længde kan vurderes ved at sikre at der ikke er nogen ikke-specifikke dsRNA produkter og ved at sammenligne produkter med en standard DNA-markør, hhv.
    Bemærk: EtBr er en potent mutagen og skal behandles i overensstemmelse hermed.
    Bemærk: Ved en dsRNA koncentration på 3 pg / pl, 0,5 pi af prøven er mere end tilstrækkelig til visualisering på EtBr-farvede agarosegel.
  5. Opbevar dsRNA ved -20 ° C indtil brug. Flere fryse / tø cykler, kan medføre nedbrydning, så prøver bør være forberedt på store mængder af dsRNA.

2. Forbered Fast Green FCF Dye (FGD) Rør

  1. Fortynd Fast Green FCF-farvestoffra stamopløsning (≥85% farvestof indhold) til 0,1% (v / v) (arbejdsopløsning) i RNase-frit vand.
  2. Pipetter 1 ml af farvestof i bunden af ​​et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Rørene anbringes i en 65 ° C varmeblok i ca. 3 timer at fordampe flydende, og derefter placere rør ved stuetemperatur i mindst 30 min, til afkøling før brug. Denne tørre faste farvestof vil rekonstruere i dsRNA resuspension opløsning.

3. Træk kanyler

  1. Træk borsilicat glas nåle ved hjælp af en opvarmet nål aftrækker til en spids diameter på 10-30 um. Træk indstillinger svarer til: Heater justering nej. 1 = 100, Heater justering no. 2 = 70.
  2. For at undgå beskadigelse af fine spidsen af ​​nålen, placere alle trukket nåle vandret i en petriskål på en strimmel til støbning af kit.
    Bemærk: Yderligere oplysninger til kapillær nål trække metoder kan findes i yderligere detaljer i Malaria Research og reference Reagent Resource Center MR4 manual 24.

4. Forbered Injection Station

  1. Saml nødvendige materialer: glas mikrokapillære nåle trukket til fin spids, mikroinjektor, tyndt filtrerpapir og tykt filtrerpapir, petriskåle, overførselspipetter, malerpensel og dissekere lysmikroskop.
  2. Forbered mikroinjektor som anvist i mikroinjektor manual, og sæt injektion volumen til ønsket volumen pr puls (f.eks maksimalt 69 nl pr puls).
  3. På en platform, der er let at manøvrere under et mikroskop (f.eks flade side af en Styrofoam rør rack), stable to filter papirark med det tynde filtrerpapir på toppen, og sikres med tape rundt om kanterne.
  4. Resuspender 10 pi af hver dsRNA opløsning i separate farvede farverørene, og anbring på is.

5. Saml Pupper til injektion

  1. Fyld en lille 60 mm x 15 mm petriskål med 10 ml deioniseret vand, og indsamle ~ 50 bleg pupper (During de første 24 timer efter pupation) fra en insektbetingelser bakke ved hjælp af en engangs plastik overførsel pipette.
  2. Fjern eventuelle pupper, der har medium til mørk neglebånd garvning.
    Bemærk: Når kutikula begynder at tan, bliver det vanskeligere at trænge kutikula, og injektion resulterer i meget højere dødelighed.

6. dsRNA Injection

  1. Under dissektionsmikroskop, afbryde den distale spids af kanylen med et par fine tænger.
  2. Forbered kanylen ved opfyldning nålen med mineralsk olie (ved hjælp af en sprøjte med en 3 tommer, 30 gauge kanyle), og udvise overskydende olie med mikroinjektor.
  3. Frem fylde kanyle med maksimale dsRNA, og udstøde en puls under mikroskop for at sikre dispensering af væske. I tilfælde af at ingen væske optages og / eller udvises, kontrollere den distale spids af nålen til enhver blokering og sikre, at nålen sidder godt fast i microinjector.
  4. Pick 1-3 pupper, og placere dem på filtrerpapir.
  5. Ved hjælp af pensel, placere pupper på filtrerpapiret med dorsal neglebånd tilgængelige, og bruge pensel til at skubbe på filterpapir og absorbere af overskydende vand.
  6. Stabiliser puppe med spidsen af ​​malerpenslen, og indfør nålen i den dorsale kutikula mellem thorax og abdomen i en vinkel på ca. 30 ° i forhold til den dorsale overflade af puppe. Injektion skal rettes mod den bageste ende af puppe og kanylen må bevæges i en anterior-til-posterior retning.
  7. Sprøjt to pulser (69 nl pr puls) på 3 ug / ul dsRNA opløsningen i hemolymph, og tjek for distribution af farve i hele kroppen. Hvis ingen farve er identificeret, flytte kanylen position lidt at rydde tip fra obstruktion og gentag flydende levering.
  8. Brug fugtet pensel til forsigtigt at flytte puppe fra nålen i vand til dyrkning. Than puppe bør holde sig til malerpenslen på let kontakt.

7. Post-injektion Betingelser

  1. Placer petriskål med indsprøjtet pupper i en myg bur med passende luftstrøm (fx mesh bur eller container med mesh låg). Puppe opdrætsforhold bør forblive konsekvent på 27 ± 3 ° C temperatur, 75 ± 5% fugtighed og være under et lys: mørke cyklus på 16: 8 t.
  2. Forbered en 10% (w / v) glucoseopløsning, og placere en løsningsorienteret mættet vat på myg buret maske for voksne fodring.

8. Vurdere Knockdown

  1. På ønskede tid-(er), vurderer fænotyper i eksperimentelle dsRNA-injicerede insekter, sammenlignet med kontrolgruppen.
    1. Vurdere dsSRPN2 og dsLacZ insekter dagligt ved nedkøling ned voksne i ca. 2-3 min ved -20 ° C, overføre dem til en kold plade ved 2 ° C og identificere enhver pseudo-tumordannelse ved udnyttelse af et dissektionsmikroskop ved 15Xforstørrelse med lysfelt belysning. Efter vurdering, returnere voksne til insektbetingelser (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% luftfugtighed).
      Bemærk: De eksperimentelle og kontrol dsRNA'er ansat i denne protokol er dsSRPN2 og dsLacZ hhv. Der er mange muligheder, der er egnede til kontrol; imidlertid er det foreslået, at en positiv kontrol for hvilken fænotype og / eller ekspression er let visualiseres (fx ved at dissekere mikroskopi) og / eller kvantificeres [f.eks kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), Western blot], anvendes når læring denne teknik. SRPN2 protein og transcript kvantificering via Western blot og QRT-PCR henholdsvis er beskrevet i Michel et al. (2005) 21.

Representative Results

Puppe injektion for gen KD udbytter optimale resultater, når injektion udføres i den tidlige puppestadiet, når neglebånd garvning er lavt (figur 1A, venstre, og 1B). Øget garvning og hærdning af neglebånd, generelt efter 24 timer, resulterer i øget puppe død efter injektion (figur 1A, center og højre). Hastigheden af puppe udvikling kan variere afhængigt af insektbetingelser og belægningsgrad 24,25; Derfor er det bedst at vurdere pigmentering visuelt.

Under injektionsprocessen, er det kapillære nål indsat i den dorsale kutikula i en vinkel på ca. 30 ° i den forreste til bageste retning (figur 2A). Når nålen er indsat og dsRNA'et + 0,01% (vægt / volumen) FGD dispenseres, fordelingen af farvestoffet er til stede gennem hele hæmolymfe (Figure 2B).

Vurdering af voksne fremkomsten til pupper injiceret med 0,01% (w / v) FGD afslørede et gennemsnit på 70% fremkomst, sammenlignet med 96,7% fremkomsten af ikke-injicerede kontroller (figur 3A). Notatet blev delvis fremkomst fra puppe tilfælde observeret for et stort antal ikke-overlevende myg (figur 3B). Injicerede dyr udviser ingen forsinkelser i fremkomsten tid (figur 4A) eller partiske indvirkning på begge køn (figur 4B). Yderligere vurdering af voksne overlevelse udført op til dag 10 postemergent afslører ingen tydelig effekt på postemergent voksen overlevelse (figur 4C).

Validering af KD kvalitet blev vurderet af melanotiske pseudo-tumor (mørkt pigmenteret væv klynge) fænotype forbundet med SRPN2 knockdown 21,22 som en positiv kontrol for knockdown og fravær af fænotyper associeret med dsLacZ injektion som en negativ kontrol. Voksne myg, der opstod blev scoret på dag 8 efter injektion (dag 6-7 efter fremspiring). Melanotiske pseudo-tumorer (figur 5A og 5B) blev observeret gennem kutikula af 93,5% af dsSRPN2 vs. 0% af dsLacZ voksne myg (figur 6A). Klynger af mørkt melanized væv blev identificeret ved dissektion af pigmenterede pletter (figur 5C). Pseudo-tumorer var synlige på den voksne kutikula så tidligt som dag 3 efter fremspiring og var også til stede i en undergruppe af dsSRPN2 hæmolymfe og tarmvæv (data ikke vist). Ved 5 efter injektion (tidlig voksen stadie), faldt betydeligt SRPN2 niveauer i dsSRPN2, men blev observeret ikke dsLacZ eller ikke-injicerede hemolymph protein isolater (figur 6B).

ftp_upload / 53.738 / 53738fig1.jpg "/>
Figur 1: Developmental iscenesættelse til puppe dsRNA injektion Tidlig puppe injektion af dsRNA resultater i optimal overlevelse og progression i voksen stadie.. Lave niveauer af neglebånd pigmentering (A, til venstre, og B) kan observeres inden for de første 0-24 timer efter pupation. Garvning af puppe neglebånd foregående injektion (A, center og højre) resultater i moderat til dårlig overlevelse.

Figur 2
Figur 2:. Injection stilling og distribution af farvestof-mærket dsRNA (A) Kapillær nål injektion af farvestof-mærket dsRNA i den dorsale kutikula i en vinkel på ca. 30 °, i anterior til posterior retning. (B) Farvestoffet synligt fordelt i puppe hæmolymfe. dsRNA injektionsvolumen på 138 nl, mærket med 0,01% FGD (vægt / volumen).

Figur 3
Figur 3:. Post-injektion voksen fremkomsten (A) 70% af pupper injiceret med 0,01% FGD (vægt / volumen) med succes opstod (n = 60) sammenlignet med 96,7% af ikke-injicerede kontroller (n = 60). Tre biologiske replikater blev udført. Blev observeret (B) Delvis fremkomst fra puppe tilfældet for et stort antal ikke-overlevende myg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM).

Figur 4
Figur 4: Emergence sats, sex vurdering og voksne overlevelse (A) gav sammenlignelige fremspiring tidspunkter efter puppe injektion med 0,01% FGD (24 timer = 80% og 48 h = 20%), sammenlignet med ikke-injicerede pupper (24. HR = 83% og 48 h = 17%). (B (C) Overlevelse analyse afslører, at injektion med 0,01% FGD ikke påvirker voksne overlevelse, vurderes op til dag 10 efter fremkomst. Resultaterne repræsenterer data fra tre uafhængige forsøg med 0,01% FGD injiceret (n = 60) og ikke-injiceret (n = 60) pupper (lige mange hanner og hunner). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM).

Figur 5
Figur 5: Pseudo-tumor positiv kontrol fænotype afspejler vellykket knockdown Pseudo-tumorer blev observeret på (A) abdominal og (B) thorax neglebånd af dsSRPN2 -injiceret, men ikke dsLacZ -injiceret voksne myg på dag 8 efter injektion..(C) Højere forstørrelse (400X) afbildning (a), i kutikula og dissektion af pigmentpletter (b) afslører klynger af mørkt melanized celler.

Figur 6
Figur 6: Kvantificering af pseudo-tumor-dannelse og reduceret SRPN2 proteinniveauer (A) puppestadiet injektioner resulterer i pseudo-tumordannelse i 93,5% af dsSRPN2 voksne (n = 21) sammenlignet med 0% af dsLacZ kontroller (n = 19). . Resultater opnået dag 8 efter injektion. (B) Western blot (til venstre) viser faldt SRPN2 niveauer i dsSRPN2, men ikke dsLacZ eller ikke-injicerede hemolymph protein isolater (dag 5 efter injektion). Resultater baseret på tre uafhængige forsøg. Anti-SRPN2 21 og anti-SRPN3 26 antistof fortyndinger blev anvendt, var 1: 1000 og 1: 2000, hhv. Gede-anti-raBBIT IgG-HRP (Product sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) blev anvendt ved 1: 5000. Alle proteinniveauer blev kvantificeret (højre) ved båndintensitet (ImageJ software, NIH, Bethesda, MD), normaliseret til SRPN3, og statistisk sammenlignet ved uparret t-test. P <0,05: *, P ≥0.05: ns (ikke signifikant). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM).

Discussion

Aktuelle metoder til at fremkalde ikke-transgen RNAi i myg involverer direkte injektion af dsRNA i den voksne hemocoel 12,13 eller larver fodring af RNAi trigger-coatede nanopartikler 14-17 eller mikroalger-baserede dsRNA molekyler 18. Målretning den voksne myg, mens yderst værdifuld, kan udelukke et stort antal gener, der fungerer under tidligere udviklingsmæssige perioder. Knockdown initieret af larvernes fodring kan give inkonsistente fænotyper i voksne stadium skyldes til dels, at potentialet i variable protein persistens gennem puppestadiet. Derfor indfører en ekstra metode, der specifikt tager sigte på at indlede RNAi i puppe udvikling vil give et middel til mere fuldt ud at vurdere gen funktioner under pre-voksne udviklingsstadier samt forbedrede evner til at vurdere gen funktion under voksne stadier. Som med gen knockdown tilgang baseret på dsRNA injektion eller udtryk, den fortsatte gen knockdownkan ikke forudsiges. Derfor bør udskrift eller protein niveauer vurderes for genet af interesse under udviklingsmæssige perioder af interesse. Selvom vi observere en fortsættelse af nedsat protein niveauer på dag 5 efter injektion for SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injicerede dyr, kan faktorer såsom protein omsætning og halveringstid er forskellige for forskellige mål. Det er afgørende for at sikre, så godt, at dsRNA'et skal anvendes til injektion er godt koncentreret og fremstår intakt på en agarosegel. Vi anbefaler eksperimentatorer revurdere disse faktorer, hvis knockdown resultater ikke er tilstrækkelige, og de respektive koncentrationer af dsRNA kan skal testes empirisk for specifikke genmål.

Vi beskriver en fremgangsmåde til initiering af RNA-interferens under puppestadiet af An. gambiae udvikling. Denne metode bygger på introduktion via mikroinjektion af dsRNA direkte i hemocoel af tidlig pupper og muliggør vurdering af injektion kvaliteten afbrug af farvestof-mærket dsRNA. Evnen til at visualisere injektion kvalitet udgør en kritisk ekstraudstyr for at sikre en vellykket knockdown og udgør et aspekt af injektion-baserede gen knockdown, der ikke er behandlet i de fleste tidligere rapporterede dsRNA-baserede protokoller med fokus på voksne stadium. Ved at målrette puppe ved starten af ​​denne udviklingsperiode, gener, der kunne spille en rolle i denne kritiske udviklingsmæssige interval, eller under de tidlige stadier af voksenalderen kan evalueres funktionelt. Derudover kan denne fremgangsmåde gøre det muligt dsRNA levering til celler og etablering af RNA-interferens i celler, der er tilgængelige under metamorfose, men mindre tilgængelig i fuldt dannet voksne myg.

En nylig microarray analyse af Harker et al. (2012) identificerede 560 An. gambiae transkripter, der blev opreguleret eller nedreguleret med mindst 4 gange i løbet af distinkte udviklingsstadier, lige fra embryoet til voksen. Af de 560 udskrifter identificeret, et sæt af 309 blev opreguleret i puppe udvikling 27. Disse resultater antyder, at der er mange krav til differentiel genekspression hele mosquito udvikling, herunder dem, der optræder under puppestadiet, et interval, hvorunder organismen undergår metamorfose. I mange insektarter, herunder en. gambiae, gener involveret i processer som udvikling (dvs. puppe kutikulære og chitin-bindende proteiner) 27-31 og immunrespons (dvs. Toll-receptor-lignende proteiner) 27,32-34 er stærkt til udtryk under puppestadiet. Når et fuldt dannet voksen er opstået, er der fortsat genekspression som reaktion på miljømæssige og fysiologiske ændringer 35. Især under tidlig voksen udvikling, er der en stigning i ekspressionen af udviklingsmæssige gener (dvs. voksne kutikulære og sarkoplasmiske proteiner) 36, samt andre vigtige gener (dvs. 27,36.

Den positive kontrol anvendes i udviklingen af denne protokol, SRPN2, er en An. gambiae serinproteaseinhibitor (serpin). SRPN2 spiller en vigtig rolle i den negative regulering af insekt melanin, et bredt spektrum medfødte immunreaktion i insekter 21,22. Knockdown af SRPN2 i voksne myg resulterer i pseudo-tumordannelse 21,22, en fænotype, der er let observeres ved brug af lysmikroskopi. I betragtning af, at dette særskilte fænotype kan let scoret i levende insekter, vi brugte SRPN2 til indledende puppestadiet RNAi injektioner. Desuden er SRPN2 udtrykt under alle udviklingsstadier 37, hvorved der tilvejebringes et godt mål for puppestadiet RNAi injektion og vurdering af funktion i de tidlige voksen. Vi viser, at den metode, vi har udviklet, er i stand til at inducere tilsvarende voksen melanotiske pseud o-tumordannelse som følge af dsRNA injektioner udført i puppe udviklingstrin. Ved udviklingen af denne protokol, har vi observeret, at injektion i den tidlige puppe udvikling (dvs. de første 24 timer efter den larvestadiet-puppe molt) er kritisk for at opnå optimal voksen fremkomsten. I tilfælde af, at dårlig fremkomsten opnås efter injektion, anbefaler vi iscenesættelse larver med større nøjagtighed, for at opnå pupper med mindre omfattende neglebånd hærdning og forsikre opnås tidligt puppestadiet injektion. Endvidere kan minimere skader på kutikula resulterer i optimale fremspiring satser og øge forstørrelsen under injektion at sikre, at kun den planlagte region af dyret er punkteret. Hvis nålen skal punktere igennem til den ventrale kutikula, vil samling af farvestof-mærkede væske være indlysende på ydersiden af ​​puppe eller vil mætte filtrerpapir. Det anbefales stærkt at kassere pupper, der har mere end én neglebånd punktering.

jove_content "> Med de omfattende erfaringer fra mange laboratorier med udførelsen af ​​voksne myg injektioner, kan tidligere identificerede mikroinjektion tilgange tilpasses med enkle protokol modifikationer til brug i puppe RNAi eksperimenter. Samlet er målet med denne metode er at give forskerne mulighed for at udvide tidsrammen hvorunder omvendt kan udføres genetiske analyser, yderligere muliggør forskning, som vil støtte udviklingen af nye vektor bekæmpelsesstrategier. Interessant eksperimenter i andre arter, såsom Rhodnius prolixus og Spodoptera frugiperda, afslører, at genet dæmpende virkninger tendens til at være meget større, når påbegyndt i pre-voksen iscenesætter 38,39. under alle udviklingsstadier, RNAi-medieret gen knockdown er underlagt overvejelser om hurtighed og persistens af gen-lyddæmpning, og stabiliteten af proteiner kodet af målrettede gener. den ideelle RNAi mål gener tendens til at være dem, der koder en Protein eller RNA, der har en kort halveringstid og høj omsætningshastighed 11,40.

Mens transgene RNAi strategier også kan anvendes til at løse overvejelser om hurtighed og persistens af RNAi i præ-voksne stadier, transgene teknikker har mange ulemper (f.eks tid, der kræves til produktion af transgene linjer, eksperimentelle tidsrammer for myg parringer til at generere insekter med reguleret dsRNA udtryk, og vedligeholdelse af transgene lagre). Derimod vores protokol giver en lettere og hurtigere metode til at igangsætte gen knockdown under puppe udvikling og celletyper, der stammer og er tilgængelige under metamorfose, men er mindre tilgængelige hos voksne. Anvendelsen af ​​farvestofmærkede dsRNA suspensioner tillader nem vurdering af injektion succes og spredning af indførte materiale inden pupper. Vore data om indtræden af ​​tumordannelse i puppe-injicerede voksne, sammenlignet med dyr injiceret som voksne, er i overensstemmelse med initiation af RNAi-medieret knockdown under puppestadiet. Ved hjælp af vores G3 myg linje og under vores insektbetingelser, vi observere voksne melanotiske pseudo-tumordannelse så tidligt som 10 dage efter injektion af voksne injiceret tre til fem dage efter fremspiring. Ved at udføre puppe-stadium injektion tidligt, vi observerer synlige melanotiske pseudo-tumordannelse så tidligt som fem dage efter injektion (dvs. tre til fire dage efter fremkomsten). Disse data indebærer, at denne fremgangsmåde muliggør initiering af gen knockdown under en tidligere under-undersøgt udviklingsperiode (dvs. puppe udvikling). Vores mærkning farvestof Fremgangsmåden kan også være nyttigt for udviklingen af ​​nye larvestadium injektionsprotokoller, på grund af det gennemskinnelige natur af kutikulaen under alle larval instars. Mens kontrolgruppen anvendt i denne undersøgelse kræver progression i voksne stadium for at vise en knockdown fænotype, at fremtidige eksperimenter vurdere puppestadiet-specifikke fænotyper efter injektion af tidlig pupper vil giveværdifuld indsigt om udvidelse af denne metode i yderligere udviklingsmæssige perioder såsom sent puppe udvikling. Sammenfattende denne metode giver en værdifuld RNAi protokol for puppestadiet initiering af RNAi-medieret gen knockdown og udvider de funktionelle genomiske værktøjer til rådighed til brug inden for vektor insekt forskningsverdenen.

Disclosures

Open Access for denne video-artikel er betalt af Biogen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript RNAi kit Ambion AM1626
Nanoject II injector Drummond 3-000-204
Nanoject II foot switch Drummond 3-000-026
Borosilicate glass capillaries Drummond 3-000-203-G/X
Glass micropipette puller Narishigne PB-7
Fast Green FCF dye Sigma F7258 Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes Thermo Scientific 1371150 ¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper  GE Healthcare 1001-090 This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper BioRad 107-3931 This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Paint brush (size 0) Michael’s Art 10474940 Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope  ----  ----- This can vary based on availability and user preference.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Tags

Infektion Mosquito puppe malaria gambiae vektor injektion dsRNA RNA-interferens RNAi reverse genetik funktionel genomforskning
RNAi Trigger Levering ind<em&gt; Malariamyg</em&gt; Pupper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse,… More

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter