Summary
Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.
Abstract
Metastase is een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit. Metastase is een multi-step proces en als gevolg van de complexiteit, de precieze cellulaire en moleculaire processen die metastatische verspreiding en groei regeren zijn nog steeds ongrijpbaar. Levende beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische en ruimtelijke interactie van cellen en hun micromilieu. Vaste tumoren vaak uitzaaien naar de longen. De anatomische locatie van de longen vormt een uitdaging voor intravitale beeldvorming. Dit protocol verschaft een relatief eenvoudige en snelle werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende de dynamische interacties tussen tumorcellen en de omliggende stroma binnen longmetastasen. Door deze methode kan de beweeglijkheid van kankercellen en interacties tussen kankercellen en stromale cellen in hun micromilieu worden gevisualiseerd in realtime enkele uren. Door het gebruik van transgene fluorescerende reporter muizen, een tl-cellijn, injecteerbare fluorescent gelabeldemoleculen en / of antilichamen, verschillende onderdelen van de long micro kan worden gevisualiseerd, zoals bloedvaten en immuuncellen. Om het beeld verschillende celtypen, is een draaiende schijf confocale microscoop die langdurige continue beeldvorming met een snelle, vier kleuren beeldacquisitie maakt gebruikt. Time-lapse filmpjes samengesteld uit beelden verzameld over meerdere posities en focale vliegtuigen tonen interactie tussen live-metastatische en immuuncellen gedurende ten minste 4 uur. Deze techniek kan verder worden gebruikt voor chemotherapie of gerichte therapie testen. Bovendien kan deze werkwijze worden aangepast voor de studie van andere long-gerelateerde pathologieën die de long micro beïnvloeden.
Protocol
Alle beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Generatie van longmetastasen voor ex vivo Live-Imaging (Transgene of staartader Injection)
OPMERKING: longmetastasen kan worden gegenereerd door gebruik te maken van genetisch gemanipuleerde muismodellen of door intraveneuze (iv) injectie van kankercellen.
- Genereer longmetastasen voor de beeldvorming door het kruisen van een genetisch gemanipuleerde tumor muismodel in een transgene reporter muis, bijvoorbeeld, steek de borstkanker muismodel, muis borsttumor virus lange terminale repeat-polyoma midden T-antigeen (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP muismodel 12.
LET OP: De ACTB-ECFP model tot expressie versterkt cyaan fluorescente eiwit (ECFP) onder de β-actin promotor zodanig dat alle cellen fluoresceren in de blauwe, CFP-kanaal. Maar kankercellen zijn veruit de belangrijkste en verschijnen als een bulk van ECFP-positieve cellen onder de microscoop. De MMTV-PyMT muismodel ontwikkelt progressieve ziekte, waarbij borsttumor groei geassocieerd met de verspreiding van kankercellen naar de omtrek, met name voor de longen. In MMTV-PyMT muizen op de FVB / n achtergrond kan worden waargenomen micrometastasen ongeveer 10-11 weken oud. Over het algemeen zijn deze vooruitgang macrometastases bij ongeveer 14 weken oud 13.
OF - Genereer experimentele metastasen met behulp van primaire cellen of syngene cellijnen. Gebruik in vitro gemanipuleerde primaire tumorcellen of cellijnen (bijv., Transductie) gevolgd door iv injectie 14.
- In het kort, in dit protocol, injecteren een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen (+) MMTV-PyMT cellijn in tl-reporter muizen (ACTB-ECFP) of wild-type muizen. Dan,visualiseren van deze aangeduid als VO-PyMT cellen 15 cellen met behulp van de groene, GFP-kanaal.
LET OP: De originele VO-PyMT cellijn werd afgeleid aan de Vanderbilt Orthopedie in Nashville, TN. VO staat voor Vanderbilt Orthopedie. - Na de injectie van 10 6 cellen (in 200 pl), acht kankercel extravasatie onmiddellijk tot een paar uur na injectie; observeren micrometastasen tussen 1-3 weken na de injectie en op te sporen macrometastases 3 weken na de injectie 15.
OPMERKING: Minder cellen kunnen worden geïnjecteerd en het moment van injectie metastatische groei verlengen.
- In het kort, in dit protocol, injecteren een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen (+) MMTV-PyMT cellijn in tl-reporter muizen (ACTB-ECFP) of wild-type muizen. Dan,visualiseren van deze aangeduid als VO-PyMT cellen 15 cellen met behulp van de groene, GFP-kanaal.
2. Etikettering van componenten van belang in de gemetastaseerde Microenvironment (Transgene en / of Injectables)
OPMERKING: Labeling kan worden bereikt door transgene muizen en / of door verschillende injecties. Zorg ervoor dat u verschillende fluorescerende kleuren te gebruiken voor de etikettering van verschillende celtypen.
- Label onderdelen van de metastatische micro-omgeving met behulp van transgene muizen. Steek de eerder genoemde muizen tumormodel (bijv., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in een transgeen muizenmodel waarin de stromale cellen van belang worden gelabeld door een fluorescerend eiwit dat niet ECFP, bijv., C-fms-EGFP 4,16.
OPMERKING: Naast de visualisatie van kankercellen in de GVB kanaal, dit maakt visualisatie van myeloïde cellen in de GFP kanaal 4.
EN / OF - Label verschillende onderdelen van de metastatische micro via injecties in transgene muizen of fluorescente reporter (niet fluorescerende) wildtype muizen.
OPMERKING: Verschillende verbindingen kunnen worden geïnjecteerd om verschillende onderdelen van de metastatische micro bijvoorbeeld is een AF647-geconjugeerd Gr-1 antilichaam hier gebruikt om neutrofielen label en een aantal monocyten 13 en verschillende moleculaire dextranen worden gebruikt etiketlong haarvaten labelen. Voor de bereiding van deze injecteerbare zie stap 4.
3. Voorbereiding van Materialen Voordat Dissection
- 2% Agarose
- Weeg 0,2 g agarose en toe te voegen aan 10 ml 1 x PBS. Verwarm de oplossing om de agarose op te lossen. Agarose stollen bij kamertemperatuur, zodat handhaven in een 37 ° C waterbad voor inflatie.
- CO 2 en temperatuurregelaar
- Controleer DDH 2 O in de bevochtigingskamer. Bijvullen wanneer nodig. Steek configuratie plaat in temperatuur fase plaat houder (klimaatkamer). Schakel de CO 2 controller set CO 2 bij 5%. Zorg ervoor dat de luchtstroom is vastgesteld op 0,4 Nl / min.
- Open de lucht en de CO 2 kleppen. Zet de temperatuurregelaar. Zorg ervoor dat de temperatuur van de klimaatruimte en het deksel worden ingesteld op 37 ° C.
- Laat de luchtdruk op CO 2 meter. Raadpleeg CO 2 toe, equilibration kan tot 30 min.
- Draaiende schijf confocale microscoop
LET OP: Details van de microscoop set-up zijn eerder beschreven 4,17.- Zet de lasers (argon laser van 488 nm excitatie en het vaste stof 405 nm, 561 nm en 640 nm lasers). Schakel de microscoop, de camera, de draaiende schijf besturingseenheid, de AOTF, de laser besturingseenheid en de camera controller.
- Open de microscoop sluiter, zet de computer waarop de microscoop en de software te openen.
- Voorbereiding van de tools en dissectie platform.
- Schakel de hete kraal sterilisator en laat het bereik 250 ° C. Clean 2 paar chirurgische schaar en pincet met water en zeep. Steriliseer de instrumenten ten minste 30 sec. Laat de instrumenten afkoelen. Gebruik een polystyreen deksel dissectie platform. Bedek het met een stuk van lab soaker.
4. Voorbereiding van de injecties
Opmerking: Afhankelijk van de halfwaardetijd en de gewenste respons, injecteren fluorescerend gemerkte antilichamen en / of fluorescente moleculen hetzij onmiddellijk vóór dieroffer of enkele uren tot dagen voor.
- Aan te Gr1-positieve neutrofielen en monocyten, bereidt een injectiespuit met 7 pl stock AF647-geconjugeerd Gr-1-antilichaam (1 mg / ml) in 100 pl steriel PBS onder de motorkap. Plaats een 27 G ½ naald op de spuit.
- Aan te long- capillairen, stelt een tweede en derde spuit met 100 ui ofwel 70 kD rhodamine geconjugeerde dextran (4 mg / ml) of 10 kD AF647-geconjugeerde dextran (4 mg / ml). Plaats een 27 G ½ naald op de spuiten.
- Spuit de AF647-geconjugeerd antilichaam oplossing iv 5 uur voorafgaand aan de uitsnijding longen '.
- Injecteer één of beide dextranen iv onmiddellijk voorafgaand aan excisie longen.
5. Voorbereiding van de longen voor ex vivo Live-Imaging
OPMERKING: Probeer zo steriel en zorgvuldig mogelijk te werken om onnodige uitdagingen van de immuuncellen in de longen te voorkomen.
- Injecteer de muis intraperitoneale (ip) met een letale overdosis van een verdovingsmiddel toegelaten door het dier protocol IACUC goedgekeurd, bijv., 1 ml 2,5% Avertin. Wacht tot de muis om te stoppen met ademhalen en zijn volledig niet-reagerend op schadelijke stimuli (achterpoot knijpen).
OPMERKING: cervicale dislocatie en kooldioxide euthanasie moet worden vermeden omdat dit nadelig kan beïnvloeden long cellevensvatbaarheid. - Immobiliseren de muis op een dissectie board en steriliseer de muis met 70% ethanol.
- Gebruik chirurgische schaar eerst een dwarse epigastrische incisie door de huid, gevolgd door een vergelijkbare ingesneden buikvlies maken. Houd de dissectie in verticale stand en snijd de dalende aorta, waardoor bloed zich in de buik en niet in de borstholte.
- Ssmoren een kleine opening in het membraan vacuüm op te heffen. Snijden langs de rib 10 en 12 het membraan te snijden en visuele toegang krijgen tot de longen.
- Gebruik chirurgische schaar om de huid tot gesneden om de luchtpijp over de ribbenkast, maar laat de ribbenkast intact. Scheid de huid tegen de ribbenkast. Expose de luchtpijp door het verwijderen van het omringende bindweefsel, zorg dat u de luchtpijp zelf (figuur 1a) niet te beschadigen.
- Knip een kleine opening van ongeveer 1 mm diameter in het belichte trachea evenwijdig aan de kraakbenige ringen zo dicht mogelijk bij het strottenhoofd mogelijk (Figuur 1B). Wees voorzichtig om niet volledig dwars door de luchtpijp.
- Neem een 20 G naald en voorzichtig steek de naald 4-5 mm in de luchtpijp zonder tegenkracht (figuur 1D). Het einde van de naald moet zichtbaar door de luchtpijp (figuur 1C) zijn. Tang om de naald in de luchtpijp te stabiliseren. Alternatief, kan een hechting worden gekoppeld around de luchtpijp om de naald op zijn plaats houden.
OPMERKING: Door het inbrengen te diep, kan de carina getraumatiseerd of slechts één zijde van de longen kan worden opgeblazen. - Vul een spuit met 400 ul van 37 ° C 2% laagsmeltende temperatuur agarose (rechtstreeks uit een bad van constante temperatuur gehouden). Controleer de dissectie bord staat en langzaam wekt de warme agarose door de naald in de longen Gebruik ~ 400 ul naar de longen op te blazen.
LET OP: Let op de longen opblazen in de ribbenkast. Niet over-opblazen van de longen als het zal scheuren. - Zodra de longen worden opgeblazen, vullen ~ ⅔ van de ribbenkast, verwijder de spuit en houd de naald in de luchtpijp om te voorkomen dat agarose lekken.
- Giet ongeveer 50 ml 20 ° C PBS via opgeblazen longen naar de agarose in de longen te richten en vast laten. Verwijder langzaam de naald en sluit de luchtpijp met een tang om te voorkomen dat niet-gestolde agarose lekken. </ Li>
- Expose de longen door het uitvoeren van een sternotomie en vervolgens de longen te snijden. Voor excisie van de longen, vasthouden aan de trachea terwijl snijden door de luchtpijp geheel. Trek de luchtweg, snijd het bindweefsel en de slokdarm verwijderd en trek de longen uit de borstholte totdat de longen wordt gescheiden van de muis (Figuur 1E).
- Dompel de longen in warme RPMI-1640 te wassen excessieve bloed en voorzichtig scheiden de lobben door met een schaar en een tang om de belangrijkste stam bronchiën de lobben 'cut op navel (Figuur 1F).
- Plaats de lobben, met het platte vlak naar beneden om beeldvorming oppervlak te maximaliseren, in een putje van een 24-well imaging plaat (figuur 1G). Voeg 100 ul van 37 ° C RPMI-1640 bovenop de lobben. Door diverse 15 mm ronde dekglaasjes microscoop bovenop de lobben om te voorkomen drijven.
- Giet warm PBS in de omringende putten de RPMI-1640 media uit evap voorkomenOrating. Plaats de 24-wells plaat in de geëquilibreerde klimaatruimte en onderhouden longkwabben bij 37 ° C met lucht en 5% CO2. Plaats de klimaatruimte op het stadium van de confocale microscoop.
LET OP: Andere gasmengsels (bijvoorbeeld 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 naar cel gedrag onder omstandigheden van hypoxie / lager zuurstofgehalte onderzoeken) kan ook worden overwogen.
Figuur 1. Protocol voor het bereiden van longen levende beeldvorming. (A) Blootstelling van de trachea na bereiding van de muis. (B) Kleine knip gemaakt in de blootgestelde luchtpijp parallel aan het kraakbeen ringen. (C) 20 G naald 4-5 mm in de luchtpijp. (D) instillatie van 400 gl 2% laagsmeltend agarose temperatuur in de longen. (E) Inflated gescheiden longen van de muis. (F) Kwabben gescheiden na inflatie. (G) lobben geplaatst in een putje van een 24-well imaging plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Verwerving en beeldanalyse
OPMERKING: Beelden kunnen met verschillende draaiende schijf confocale microscopen ondersteund door verschillende softwareprogramma's worden verkregen. In dit protocol wordt ofwel μManager met een op maat gemaakte draaiende schijf confocale microscoop of Zen met een in de handel verkrijgbare draaiende schijf confocale microscoop gebruikt voor het verwerven, terwijl Imaris wordt gebruikt voor filmbewerking en analyse.
- Acquire beelden met behulp van μManager. Een gedetailleerde stap voor stap protocol voor het verwerven van beelden met behulp van μManager software is eerder beschreven 18.
OF - Acquire beeldenmet behulp van beeldanalyse-software zoals Zen (zie figuur S1).
- Klik op het tabblad 'Zoeken' en kies doelstelling (10x of 20x) in de 'Light Path' gereedschap (figuur S1A, rode doos). Vervolgens klikt u op 'Eyes - DAPI' te kijken naar de GVB-kanaal door het oculair (figuur S1A, blauwe doos). Lokaliseren het monster handmatig met behulp van de microscoop. Klik op 'All Off'after het weefsel is in het midden van het gezichtsveld.
- Klik op het tabblad 'Overname' om alle parameters voor het verwerven te stellen.
- In de functie 'Channels', klikt u op de knop '+' (figuur S1B, rode doos). Een pop-up menu verschijnt en zoek naar de kleurstof (s) in het monster aanwezig in de 'Dye Database' (figuur S1B). Selecteer de kleurstof en klik op 'Toevoegen'.
NB: Het programma zal stel alle filters worden geoptimaliseerd. Een kleurstof kan worden verwijderddoor het te selecteren, gevolgd door te klikken op de knop prullenbak (figuur S1B, geel kader). - In de 'Acquisition Mode' menu, set 'Binning' naar 5x5. Dubbelklik op ECFP in het menu kanalen om deze te selecteren. Verlaag het laservermogen tot 20%, zodat het monster niet wordt gebleekt, terwijl het instellen van de parameters voor het overname.
- Vink het vakje 'Tiles' in het gedeelte 'Experiment Manager' en de tegels gereedschap verschijnt in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1C). Klik op 'Advanced Setup' om de live-beeld te zien van de camera. Klik op de knop 'Add' in de sectie 'Positions' 4 tot 6 posities toe te voegen aan het experiment. Om een positie te verwijderen, selecteert u die positie en klik op de knop prullenbak.
- In de 'Acquisition Parameter' gereedschap groep, opent u de 'Focus-strategie' tool, en selecteer 'Absolute Vaste Z-positie 'uit de keuzelijst.
- Controleer de Z-Stack box aan de sectie 'Experiment Manager' en de Z-Stack hulpmiddel verschijnt in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1D). Dubbelklik op een van de posities in de rubriek 'Posities' en druk op 'Live'. Eerst handmatig instellen en laatste positie van het veld imaging. Stel het interval 4 urn.
NB: Het programma zal het aantal plakken voor het gekozen bereik en de interval te bepalen. Idealiter 5-7 schijfjes zijn handig om voldoende visualisatie en snelle beeldacquisitie mogelijk te maken. - Controleer de doos van de 'Time Series' in de sectie 'Experiment Manager'. Stel de gewenste 'Duur' en 'Interval' keer in instrument van de 'Time Series', dat verscheen in de 'Multidimensional Acquisition' hulpmiddel groep (Figuur S1E).
- In de 'acquisitietie Mode 'menu, set' Binning 'naar 2x2. Dubbelklik op een fluorofoor in het menu kanalen om deze te selecteren en verhoging van de laservermogen tot 100%. Druk op 'Live' en stel de 'Exposure Time'. Herhaal dit voor elke fluorofoor.
- Controleer de 'Enable Auto Save' box. Selecteer een map en typ de naam van het bestand. Alle verkregen beelden wordt automatisch opgeslagen in deze map.
- Klik op 'Start Experiment' in het gedeelte 'Experiment Manager' om het beeld acquisitie te beginnen.
- Na beeldacquisitie, compileren de ruwe data in Imaris software. Afbeeldingen converteren bestanden ims en aanpassingen kunnen worden gemaakt. Een gedetailleerde stap voor stap protocol voor het omzetten van bestanden, het maken van aanpassingen en het opslaan van films met behulp van Imaris is eerder beschreven 18.
- Bij het opslaan van de film, zet de 'Frame Rate' tot 5 frames per seconde (fps).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van spinning-disk confocale microscopie, diverse muismodel systemen en injectables, kan de metastatische micro-omgeving worden gevisualiseerd en bijgehouden in de tijd. Met een MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP triple transgeen muismodel, verschillende cellulaire componenten worden fluorescent gelabelde (Figuur 2A, Movie 1). De typische structuur van het longparenchym kan worden gevisualiseerd in de GVB kanaal omdat alle cellen brengen ECFP onder β-actine promoter. Grotere / meercellige longmetastasen zijn gemakkelijk opgelost als deze verschijnen als een bulk van de cellen in de longen georganiseerde structuur. Myeloïde cellen gevisualiseerd in de GFP kanaal c-fms -EGFP expressie, die het transgen voor CSFR-1 12. Myeloïde cellen zijn zeer dynamisch als ze migreren gehele beeldveld. C-fms -EGFP-positieve cellen overvloediger en verplaatst zich longparenchym in vergelijking met die in nauw contact met de longmetastase. De dynamiek van myeloïde cellen en hun interacties met longmetastasen kan realtime enkele uren gevolgd.
Metastatische zaaien en groei te onderzoeken, is een experimenteel metastase model gebruikt (figuur 2B, Movie 2). De GFP + VO-PyMT tumorcellen werden geïnjecteerd in een wildtype, niet-reporter muis en liet zaad en groeien 2 weken. De structuur van de longen is duidelijk zichtbaar in de GFP kanaal door autofluorescentie van de longen. De VO-PyMT cellen nog gemakkelijk te onderscheiden van de longstructuur omdat ze een ronde vorm en hogere EGFP expressie dus lichter in vergelijking met het longparenchym. VO-PyMT cellulaire beweeglijkheid kan worden waargenomen binnen de vastgestelde metastatische laesie.
Cellulaire interacties tussen metastatische en immuuncellen in de long micro kan worden onderzocht volgens de experimentele metastase model. Twee weken nainjectie van VO-PyMT cellen, fluorescent gelabelde Gr-1 647 geconjugeerde antilichamen zijn iv geïnjecteerd 5 uur voorafgaand aan de longen uitsnijding (figuur 2C, Movie 3). Aan de linkerkant van het veld imaging worden twee Gr-1 + myeloïde cellen interactie met een VO-PyMT cel. Een metastatische laesie waargenomen aan de rechterzijde van het beeldveld. Na verloop van tijd, zijn Gr-1 + cellen aangeworven om de metastatische laesie. Onder de metastatische laesie, een van de Gr-1 + cellen nauw samenwerkt met een VO-PyMT cel. Uiteindelijk, de VO-PyMT cel loskomt, het ontkoppelen van de Gr-1 + cel.
De combinatie van reporter transgene muismodellen met de experimentele metastase model en injecteerbare antilichamen labelen immuuncellen levert een drie-kleuren film. Een week na de injectie van VO-PyMT cellen in een ACTB-ECFP reporter muis, fluorescent gelabelde Gr-1 647 geconjugeerde antilichamen iv geïnjecteerd 5 uur voorafgaand aan weefsel excisie (figuur 2D, Film4). Gr-1 + cellen migreren krachtig binnen het gezichtsveld, terwijl één GFP + metastatische cellen zichtbaar in het midden van het beeldveld.
Het injecteren van verschillende fluorescerende dextranen in reporter muizen, die eerder werden geïnjecteerd met uitgezaaide cellen, kan een vier-color film (figuur 2E, Movies 5-6) opleveren. Vroege gebeurtenissen in het zaaien van metastase kan worden bestudeerd bij VO-PyMT cellen direct worden gevisualiseerd en 4 uur na iv injectie in ACTB-ECFP reporter muizen. De injectie van rhodamine geconjugeerd, 70 kD dextran en 10 kD dextran geconjugeerd aan een 647 tl-tag maakt de visualisatie van de long haarvaten. Het gebruik van lagere en hogere molecuulgewicht dextranen zou kunnen worden gebruikt om veranderingen in de permeabiliteit van capillairen in de longen te detecteren, aangezien de laagmoleculaire moleculen sneller extravasatie opzichte van de hoogmoleculaire die 19 molecuulgewicht. Hoewel cellul ar gebeurtenissen nog effectief worden bestudeerd, Film 5 is een voorbeeld van een weefsel drift. Indien nodig en in het geval het weefsel niet tijdens de opnamesessie kan worden verplaatst, kan dit tijdens het beeld na de overname analyseert worden gecorrigeerd.
Dit systeem zorgt voor een snelle, vier kleuren continue beeldacquisitie verschillende fluorescent gelabelde celtypen te volgen binnen de longen uitgezaaide micro-omgeving. Dit protocol maakt ook de visualisatie van metastase van verschillende grootte, van gebeurtenissen in verband met het zaaien van afzonderlijke kankercellen vaste metastasen. Bovendien kunnen tumorcellen en stromale cellen worden gevisualiseerd beweging binnen de long micro met bloedvaten. Meestal kan cellulaire beweging worden gedurende minimaal 4 uur vanaf het begin van de opnamesessie. De waarneming van verschillende micro-omgevingen metastatische binnen dezelfde longweefsel helpt muis tot muis variabiliteit voorkomen.
nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 2. Vertegenwoordiger van beelden uit films overgenomen door live-imaging. (A) Momentopname van een gefuseerde Z-stack van film 1 toont myeloïde cellen geassocieerd met een long metastase (geel insert) versus die in verband met het longparenchym (rood insert). (B) Momentopname van een gefuseerde Z-stack van de film 2 toont GFP + metastatische cel in een experimenteel metastase model. Pijlpunt wijst op een beweeglijke metastatische cel. (C) Momentopname van een Z-stack van de film 3 toont co-lokalisatie van fluorescerende signalen van een GFP + metastase en Gr-1 + cellen gevisualiseerd door een Gr-1 antilichaam geconjugeerd aan een 647-tag (rode pijl). Green pijlpunt wijst op een GFP + metastatische cel die losgeraakt van de metastatische bulk. White pijlpunt wijst op een Gr-1 + cel die interactie met de beweeglijke GFP + VO-PyMT cel. (D) Snapshot vaneen samengevoegde Z-stack van film 4 toont GFP + VO-PyMT cellen, in ACTB-ECFP muis. Een enkele VO-PyMT cel is zichtbaar in het centrum (groene pijl). Het dier werd geïnjecteerd met Gr-1 647 geconjugeerd antilichaam. (E) Representatieve Z-stack van films 5 en 6 tonen bloedvaten in de longen van muizen gedood onmiddellijk na injectie van 70 kD rhodamine-dextran (rode pijlpunt) tezamen met de GFP + VO-PyMT cellen (groen). Schaal bars zijn 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Figuur 1. Screen shots van ZEN camera software voor de verwerving van beelden. (A) de eerste plaats in het hulpprogramma 'Light Path' de juiste doel moet worden gekozen (rode doos) en The weefsel worden gelokaliseerd in de microscoop. (B) configureren kanalen voor het verwerven, in de functie kanalen 'Channels' kunnen worden gewist (rode doos) of toegevoegd (gele doos). (C) In de 'Tegels' tool, kunnen verschillende posities om het experiment te worden toegevoegd. (D) In de Z-Stack "hulpmiddel kan de Z-stack ingesteld en de dikte van segmenten kan worden aangepast. (E) In functie van de 'Time Series', de Duur en Interval kan worden ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Interacties tussen een long metastase en sur. afronding immuuncellen met behulp van transgene reporter muizen Dit filmpje toont een uitzaaiing in de longen van een triple-transgene MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP muis waarin alle cellen gelabeld met ECFP en myeloïde cellen gelabeld met EGFP. De metastase kan worden waargenomen als een massa van cellen in blauw in tegenstelling tot de normale long architectuur. C-fms + myeloïde cellen migreren gedurende het gehele beeldveld. Deze film is een 2 uur 1 min overname.
Movie 2. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Cancer cel beweeglijkheid in een experimenteel metastase model. Deze film toont een long metastase gegenereerd door iv injectie van GFP + VO-PyMT (groen) cellen in een wild-type, niet-reporter, muis. Longen werden twee weken na injectie van VO geoogst-PyMT Cellen. GFP + cellen die zich binnen de metastatische bulk. Deze film is een 4 uur 40 min lang overname.
Movie 3. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Werving van immuuncellen gevisualiseerd door fluorescent-geconjugeerde antilichamen tegen experimenteel gevestigde metastase. Deze film toont een long metastase gegenereerd door iv injectie van GFP + VO-PyMT cellen (groen) in een wild-type, niet- reporter, muis. Longen werden verzameld twee weken na de VO-PyMT cellen geïnjecteerd. Gr-1 + cellen zijn voorzien van Gr-1 647 geconjugeerd antilichaam en waargenomen in het nabij-infrarode kanaal (wit). Merk op dat Gr-1-cellen zijn aangeworven om de GFP + metastase. Deze film is een voorbeeld van een lange-termijn verwerving, in totaal 11 uur 27 min.
Movie 4. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Beweeglijkheid van immuuncellen gevisualiseerd door fluorescent-geconjugeerde antilichamen in een transgene reporter muizen geïnjecteerd met uitgezaaide cellen. Deze film toont een enkele GFP + VO-PyMT cel in de long gegenereerd door iv injectie van VO- PyMT cellen (groen) in een ACTB-ECFP muis. De longen werden geoogst één week na de VO-PyMT cellen werden geïnjecteerd. Gr-1 + cellen zijn voorzien van Gr-1 647 geconjugeerd antilichaam en waargenomen in het nabij-infrarode kanaal (wit). Deze film is een 2 uur 40 min lang overname.
Movie 5. (Right click om te downloaden). Metastatische cellen en capillairen gevisualiseerd door fluorescerende dextranen onmiddellijk na intraveneuze injectie in een transgene reporter muis. Deze film toont experimentele metastase gegenereerd door iv injectie van GFP + VO-PyMT cellen (groen) in een ACTB-ECFP muis, samen met de injectie van rhodamine geconjugeerd, 70 kD dextran (rood) en 10 kD dextran geconjugeerd aan een fluorescerend label 647 (wit), bloedvaten markeren. Deze film is een voorbeeld van een weefsel drift en een 18 minuten lange acquisitie.
Movie 6. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Metastatische cellen en capillairen gevisualiseerd door fluorescerende dextranen enkele uren na iv injectie in een transgene reporter muis. Deze film toont experimentele metastase genererend door iv injectie van GFP + VO-PyMT cellen (groen) in een ACTB-ECFP muis, samen met de injectie van rhodamine geconjugeerde, 70 kD dextran (rood) en 10 kD dextran geconjugeerd aan een 647 fluorescerend label (wit), om aan te geven aderen. De longen werden teruggevonden 4 uur na injectie van de VO-PyMT cellen. Deze film is een 19 min lang overname.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde methode voor ex vivo live-beeldvorming van de long metastase in muismodellen van metastase. Deze beeldprotocol een directe visualisatie van de dynamische en ruimtelijke tumorcel-stroma interacties binnen de long micro. Het is een relatief eenvoudige en snelle methode die betrouwbare beeldvorming van longmetastase gedurende ten minste 4 uur mogelijk maakt. Films verkregen uit deze experimenten kan worden gebruikt om dynamische processen celmotiliteit en cellulaire interacties te volgen.
Twee werkwijzen voor het genereren van longmetastasen beschreven: een genetisch gemanipuleerd muizenmodel en het gebruik van een gemanipuleerde cellijn. De MMTV-PyMT muismodel recapituleert borstkanker progressie en spontane long metastase. Andere technieken die metastase recapituleren zijn ook beschikbaar, bv., Orthotope transplantatie van cellen in de melkklier 20. Een intraveneus geïnjecteerd VO-PyMT cell lijn wordt gebruikt om te zaaien en de uitgroei van de uitzaaiing van borstkanker na te bootsen. De tijd vergoeding voor VO-PyMT cel uitgroei, hangt af van de experimentele voorkeur voor het stadium van long metastase. Afhankelijk van het aantal geïnjecteerde cellen kunnen micrometastasen worden waargenomen binnen enkele dagen tot 2 weken na VO-PyMT celinjectie.
Voor een optimale longen imaging, moet grote zorg worden genomen tijdens het opblazen van de longen. Voor juiste spanning, moet de naald slechts 4-5 mm ingebracht in de luchtpijp. Dieper inbrengen van de naald kan leiden tot gedeeltelijke eenzijdige opblazen van de longen. Bovendien moet de longen tijdens de daadwerkelijke inflatie worden bekeken om hard oppompen die kunnen resulteren in weefselschade voorkomen. Bovendien is het cruciaal om de longen zo steriel mogelijk te houden, zodat de immuuncellen in de long niet wordt betwist.
Voor elke levende imagingexperiment, de optimale balans tussen de hoeveelheid data acquisitie en the mogelijke weefselschade veroorzaakt door overmatige blootstelling laser moet worden beschouwd. Het is belangrijk om de instellingen voor beeldacquisitie optimaliseren door het uitvoeren pilootexperimenten. Ook is het aan te raden om het laservermogen laag te houden bij het zoeken naar een optimale gezichtsvelden en / of om de sluitertijd af te houden wanneer de beelden niet worden verworven.
De beweeglijkheid van de kanker en / of immuuncellen plaats is een van de indicatoren voor celvitaliteit. Beweeglijkheid gevoelig voor temperatuur, zuurstofgehalte en fototoxiciteit 7. Echter, de remming of gebrek aan motiliteit niet gerelateerd aan beeldvormende omstandigheden of technische problemen maar biologische. Motiliteitsremming gevolg kunnen zijn van een bepaald therapeutisch effect of de arrestatie van metastatische cellen vlak voor hun proliferatie in de microvasculatuur van de long en de extravasatie in het longparenchym 21,22. Het kan daarom van belang zijn om dergelijke gegevens met behulp van extra bevestigentechnieken (zoals migratie assays in 2D cultuur) 23.
Bovendien is deze ex vivo longbeeldvorming methode is voldoende voor een korte-termijn studie die niet long microcirculatie vereist. Met deze methode wordt beweging van kanker en / of immuuncellen gedurende minimaal 4 uur. Voorafgaand aan beeldverwerving, het duurt ongeveer 30 minuten om de longen en 30-60 min bereiden op posities voor acquisitie vinden. Hoewel celmotiliteit waargenomen na 4 uur (tot 11 uur, Film 3), langdurige weergave afhankelijk van de specifieke celtypen onderzocht, de gebruikte omstandigheden (bijv., Zuurstofarme) en moet worden bepaald voor een bepaalde experimentele opstelling. Bovendien, vanwege het gebrek aan microcirculatie en de mogelijke gevolgen van postmortale veranderingen of in het geval er een motief nodig de resultaten in de aanwezigheid van een intacte microcirculatie verifiëren, kan de long intravitale beeldvorming met een thoracale zuig weer worden gebruikt. Het is echter stiII a uitdaging voor intravitale longbeeldvorming meerdere dagen met behulp van een beeldvormende venster zoals uitgevoerd in de hersenen, borstklier en buikorganen 5 voeren vanwege problemen bij het handhaven van voldoende onderdruk. Als een alternatieve werkwijze voor perfusie van intacte ex vivo longen, werd het geïsoleerde geperfuseerde long-vroeger toegepaste methode om longmetastasen bestuderen. Echter, deze methode vaak gebruikt voor grotere dieren. Omdat muizen hebben kleinere thoracale holtes, ze vormen een echte uitdaging voor effectieve perfusie 24.
Door lichtverstrooiing, de beeldvorming diepte van de draaiende schijf confocale microscopie beperkt. Bijgevolg wordt visualisatie van celdynamiek en cellulaire interacties beperkt tot oppervlakkige longmetastasen. Longmetastasen zijn verrijkt in de longen periferie sinds metastatische cellen worden begrensd door de capillairen die afnemen in grootte naar de buitenranden van de long 1. Bovendien is easier de levensvatbaarheid van de cellen dichter bij het oppervlak van de long zoals ze toegang tot media en zuurstof liever handhaven. Om dieper visualisatie in de longen mogelijk te maken, kan live-beeldvorming van de long secties worden uitgevoerd. Er moet echter aanzienlijke hoeveelheid celdood te verwachten. Als alternatief kan multiphoton microscopie worden uitgevoerd, waardoor een grotere penetratie. Bovendien multiphoton imaging genereert een intrinsiek optisch signaal, genoemd tweede harmonische generatie (SHG), waarbij de visualisatie van niet-centrosymmetrische structuren in de extracellulaire matrix, zoals collageen vezels 1 toelaat.
Zoals getoond in deze studie kan de tumor en immuuncel gedrag longmetastasen gevolgd en geanalyseerd met fluorescerende reporter muizen, gemanipuleerde tumorcellen en fluorescent gelabelde tracers of antilichamen. Deze methode kan worden aangepast voor de studie van andere cellen en determinanten in de metastatische micro. Hiervoor zijn er diverse transgenic reporter muizen beschikbaar voor stromale cellen studie waaronder die voor fibroblasten als FSP1-EGFP 4, alfa-SMA-RFP 25 en COL1A1-EGFP 25 of endotheelcellen als Tie2-GFP 26.
Cel kleuring van levende longsecties is uitgevoerd om immuuncelpopulaties 8 visualiseren. Deze vlekken strategie kan als alternatief voor multi-color beeld vast te leggen worden vastgesteld. Echter meeste markers etiket vaak verschillende celpopulaties in plaats van een afzonderlijke celpopulatie. Injecties die door specifieke celpopulaties 4 of fluorescent gelabelde antilichamen tegen bijkomende celmarkers genomen kunnen worden om verder te differentiëren tussen populaties. Het gebruik van verschillende fluorescente kleuren om de verschillende cellen van belang label voorkeur voor beeldvorming. Wanneer het gebruik van verschillende fluorescente kleurstoffen niet kan worden uitgevoerd (bijv., Door beperkte beeldvorming channels), is het mogelijk om het verschillende celtypen met zelfde fluorescerende reporters zolang ze gemakkelijk te onderscheiden door de vorm en / of anatomische lokalisatie.
Naast het bestuderen van verschillende celtypen verschillende klassen chemotherapeutica zijn zwak fluorescerend (zoals doxorubicine). Deze chemotherapeutica kunnen in principe worden gebruikt voor geneesmiddelafgifte en distributie longmetastasen soortgelijke wijze aanschouwelijk in 19 primaire tumor. Andere gerichte therapeutica die fluorescent gelabeld kunnen ook worden gebruikt ex vivo longbeeldvorming. Met name zou de ervaring met de longbeeldvorming data informatiever welke cellen benutting deze geneesmiddelen en hun interactie met andere cellen in de metastatische micro naast de extravasatie van deze therapeutica van actieve bloedvaten. Deze techniek kan verder worden gebruikt voor de studie van primaire longkanker 27 of aangepast voor de studie van andere longaandoeningengerelateerde pathologieën die de long micro 28,29 beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
- Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
- Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
- Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
- Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
- Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
- Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
- Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
