Summary
Vi beskriver en forholdsvis enkel fremgangsmåte for ex vivo levende avbildning av tumorcelle-stromaceller interaksjoner i lungemetastase, ved å benytte fluorescerende reportere i mus. Ved hjelp av roterende disk konfokal mikroskopi, kan denne teknikken visualisering av levende celler i minst 4 timer, og kan bli tilpasset til å studere andre inflammatoriske lungesykdommer.
Abstract
Metastase er en vesentlig årsak til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet. Metastase er en flertrinnsprosess og på grunn av sin kompleksitet, de nøyaktige cellulære og molekylære prosesser som styrer metastatisk spredning og vekst er fortsatt unnvikende. Levende avbildning tillater visualisering av de dynamiske romlige og interaksjoner av celler og deres mikromiljø. Solide svulster ofte metastaserer til lungene. Men den anatomiske plasseringen av lungene er en utfordring for intra bildebehandling. Denne protokollen gir en relativt enkel og rask metode for ex vivo levende avbildning av det dynamiske samspillet mellom kreftceller og deres omkringliggende stroma innen lungemetastaser. Ved hjelp av denne metoden, kan bevegeligheten av kreftceller, så vel som vekselvirkninger mellom kreftceller og stromale celler i deres mikromiljø visualiseres i sann tid i flere timer. Ved hjelp av transgene fluorescerende reporter mus, en fluorescerende cellelinje, injiserbare fluorescensmerketmolekyler og / eller antistoffer, flere komponenter av lungen mikromiljøet kan visualiseres, slik som blodkar og immunceller. Til bilde de ulike celletyper, har en roterende disk konfokalmikroskop som gjør langvarig kontinuerlig avbildning med rask, fire-farge image oppkjøpet blitt brukt. Time-lapse film satt sammen av bilder som er samlet over flere posisjoner og fokusplan viser interaksjoner mellom levende metastatisk og immunceller i minst 4 timer. Denne teknikken kan videre brukes til å teste kjemoterapi eller målrettet terapi. Videre kan denne fremgangsmåte tilpasses for studiet av andre lunge-relaterte patologiske tilstander som kan påvirke lungene mikromiljøet.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet må utføres i samsvar med retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning av den lokale Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Generering av lungemetastaser for ex vivo Levende Imaging (transgene eller halevenen Injection)
MERK: Lungemetastaser kan genereres ved anvendelse av genetisk modifiserte musemodeller eller ved intravenøs (IV) injeksjon av kreftceller.
- Generer lungemetastaser for bildebehandling ved å krysse en genmodifisert svulst musemodell til en transgen reporter mus, f.eks krysse brystkreft mus modell, mus brystsvulst virus lang terminal repeat-polyoma midtre T-antigen (MMTV-PyMT) 11 inn ACTB-ECFP musemodell 12.
MERK: ACTB-ECFP modellen uttrykker forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) under β-acti promoter slik at alle celler som fluorescerer i blått, CFP kanal. Men kreftceller er den klart mest fremtredende og vises som en bulk av ECFP-positive celler under mikroskop. MMTV-PyMT musemodell utvikler en progressiv sykdom, hvor brysttumorvekst er forbundet med den spredning av kreftceller til periferien, spesielt til lungene. I MMTV-PyMT mus på FVB / n bakgrunn, kan mikrometastaser observeres rundt 10-11 ukers alder. Vanligvis disse videre til macrometastases på rundt 14 ukers alder 13.
ELLER - Generer eksperimentelle metastaser ved hjelp av primærceller eller syngene cellelinjer. Bruk in vitro manipulert primær tumorceller eller cellelinjer (f.eks., Transduksjon) etterfulgt av iv injeksjon 14.
- Kort fortalt, i denne protokollen, injiserer et grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing (+) MMTV-PyMT cellelinje inn fluorescerende reporter mus (ACTB-ECFP) eller villtype mus. Da,visualisere disse cellene referert til som VO-PyMT celler 15 ved hjelp av grønn, GFP kanalen.
MERK: Den opprinnelige VO-PyMT cellelinjen ble avledet ved Vanderbilt Ortopedi i Nashville, TN. VO står for Vanderbilt Ortopedi. - Etter injeksjon av 10 6-celler (i 200 ul), observere kreftcelle ekstravasasjon umiddelbart og opp til noen få timer etter injeksjon; observere mikrometastaser mellom 1-3 uker etter injeksjon og oppdage macrometastases 3 uker etter injeksjon 15.
MERK: Færre celler kan injiseres for å forlenge tiden fra injeksjon til metastatisk vekst.
- Kort fortalt, i denne protokollen, injiserer et grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing (+) MMTV-PyMT cellelinje inn fluorescerende reporter mus (ACTB-ECFP) eller villtype mus. Da,visualisere disse cellene referert til som VO-PyMT celler 15 ved hjelp av grønn, GFP kanalen.
2. Merking av komponenter av interesse i Metastatisk mikromiljøet (Transgene og / eller Injectables)
MERK: Merking kan oppnås ved å transgene mus og / eller ved hjelp av forskjellige injiserbare preparater. Sørg for å bruke forskjellige fluoriserende farger for merking av ulike celletyper.
- Merk komponenter av metastatisk mikromiljøet ved hjelp av transgene mus. Krysse den tidligere nevnte musetumormodell (f.eks., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) inn i en transgen musemodell hvori stromale celler av interesse er merket med et fluorescent protein som er ikke ECFP, f.eks., C-fms-EGFP 4,16.
MERK: I tillegg til visualisering av kreftceller i CFP kanal, gjør dette visualisering av myeloide celler i GFP kanalen fire.
OG / ELLER - Merk ulike delene av metastatisk mikromiljøet ved hjelp av injeksjoner i transgene fluorescerende reporter mus eller (ikke-fluoriserende) villtype mus.
MERK: Flere forbindelser kan injiseres for å merke forskjellige komponenter i metastatisk mikromiljøet, for eksempel, er en AF647-konjugert Gr-1-antistoff er brukt her å merke nøytrofiler og monocytter noen 13 og forskjellige molekylvekt dekstraner benytteså merke lungekapillærer. For tilberedning av disse injectables se trinn 4.
3. Fremstilling av materialer Før Dissection
- 2% agarose
- Vei 0,2 g agarose og legge til 10 ml 1 x PBS. Varm løsningen for å oppløse agarose. Agarose vil størkne ved romtemperatur, så opprettholder det i et 37 ° C vannbad inntil anvendes for inflasjon.
- CO 2 og temperaturregulatoren
- Sjekk DDH 2 O i luftfukting kammeret. Etterfyll ved behov. Sett konfigurasjon platen inn temperaturen scenen plate holder (klimakammer). Slå på CO 2-kontrolleren og sette CO 2 på 5%. Kontroller at lufthastigheten er satt til 0,4 Nl / min.
- Åpne luft og CO 2 ventiler. Slå på temperaturregulatoren. Sørge for at temperaturen i klimakammeret og lokket er satt ved 37 ° C.
- Slipp lufttrykk på CO 2 meter. Sjekk CO 2 øker, equilibration kan ta opp til 30 min.
- Spinning disk konfokalmikroskop
MERK: Detaljer om mikroskop set-up har blitt beskrevet tidligere 4,17.- Slå på lasere (argon laser for 488 nm eksitasjon og SSD-405 nm, 561 nm og 640 nm lasere). Slå på mikroskop, kameraet, den roterende disk styreenheten, AOTF, laserstyreenheten og kamerastyreenheten.
- Åpne mikroskop lukkeren, slå på datamaskinen som kjører mikroskop og åpne programvaren.
- Utarbeidelse av verktøy og disseksjon plattform.
- Slå på varm perle sterilisator og la det nå 250 ° C. Rengjør 2 par kirurgiske saks og pinsett med vann og såpe. Steril verktøyene i minst 30 sek. La verktøyene kjøle seg ned. Bruk en polystyren lokk som disseksjon plattform. Dekk den med et stykke lab soaker.
4. Utarbeidelse av injeksjoner
MERK: Avhengig av halveringstid og den foretrukne svar, injisere fluorescensmerkede antistoffer og / eller fluorescerende molekyler enten umiddelbart før dyreoffer eller et par timer til dager før.
- Å bilde GR1-positive nøytrofile granulocytter og monocytter, utarbeide en sprøyte med 7 mL av lager AF647-konjugert Gr-1 antistoff (1 mg / ml) i 100 ul steril PBS under panseret. Plasser en 27 G ½ nålen på sprøyten.
- Til bildelungekapillærene, forberede en andre og tredje sprøyte med 100 ul av enten 70 kD rhodaminkonjugert dekstran (4 mg / ml) eller 10 kD AF647-konjugert dekstran (4 mg / ml). Plasser en 27 G ½ nål på sprøytene.
- Injiser AF647 antistoff løsning iv fem timer før lungene "excision.
- Injisere en eller begge dekstran løsninger iv umiddelbart før lungene "excision.
5. Utarbeidelse av lungene for ex vivo Levende Imaging
MERK: Prøv å jobbe som sterilt og forsiktig som mulig for å unngå unødvendige utfordringer immunceller i lungene.
- Injisere mus intraperitonealt (ip) med en dødelig overdose av et bedøvelsesmiddel er tillatt av dyret protokoll godkjent av IACUC, f.eks., 1 ml 2,5% Avertin. Vent til musen for å slutte å puste og være fullstendig ikke-respondere på skadelige stimuli (bakfot klype).
MERK: Livmorhals forvridning og karbondioksid dødshjelp bør unngås da det kan detrimentally påvirke lunge celle levedyktighet. - Immobilisere musen på en disseksjon bord og sterilisere mus med 70% etanol.
- Bruk av kirurgiske sakser å først lage en tverrgående epigastrisk innsnitt gjennom huden, etterfulgt av en lignende snitt gjennom bukhinnen. Hold disseksjon bord i en vertikal posisjon og kutt synkende aorta, slik at blodet bassenger ned i magen og ikke i brysthulen.
- Snappe en liten åpning i membranen for å frigjøre vakuum. Skjær langs den 10. og 12. rib å kutte ut mellomgulvet og få visuell tilgang til lungene.
- Bruk kirurgisk saks til å klippe huden opp til luftrøret over brystkasse, men la brystkasse intakt. Skill huden fra brystkasse. Expose luftrøret ved å fjerne de omkringliggende bindevev, være forsiktig for ikke å skade luftrøret seg selv (figur 1A).
- Avklipt en liten åpning omtrent 1 mm i diameter i den frilagte luftrøret parallelt med de brusk ringer, som i nærheten av strupehodet som mulig (figur 1B). Vær forsiktig med å skjære helt gjennom luftrøret.
- Ta en 20 G nål og forsiktig stikk nålen 4-5 mm inn i luftrøret uten motkraften (figur 1D). Slutten av nålen skal være synlig gjennom luftrøret (figur 1C). Bruk pinsett til å stabilisere nålen i luftrøret. Alternativt kan en sutur være bundet around luftrøret for å holde nålen på plass.
MERK: Ved å sette inn for dypt, kan det være carina traumatisert eller bare en side av lungene kan være oppblåst. - Fylle en sprøyte med 400 ul av 37 ° C 2% lavtsmeltende agarose-temperatur (tatt direkte fra et bad med konstant temperatur). Kontroller at disseksjon styret står opp og sakte innpode den varme agarose gjennom nålen inn i lungene, bruke ~ 400 mL å blåse lungene.
MERK: Se lungene blåse inne i brystkasse. Ikke over-blåse lungene som det vil sprekke. - Når lungene blir oppblåst, fyller ~ ⅔ av brystkassen, løsner sprøyten og holde nålen inne i luftrøret for å hindre enhver agarose i å lekke.
- Hell omtrent 50 ml 20 ° C PBS over oppblåste lunger for å tillate agarose inne i lungene for å sette og størkne. Sakte fjerne nålen og lukker luftrøret med tang for å hindre enhver ikke-størknet agarose lekker. </ Li>
- Expose lungene ved å utføre en sternotomi og deretter skjære lungene. For fjerning av lungene, holde på luftrøret mens skjære gjennom luftrøret helt. Forsiktig trekke luftrøret opp, skjæres bort bindevevet og spiserøret mens trekke lungene ut av brysthulen til lungene er atskilt fra mus (figur 1E).
- Fordyp lungene i varm RPMI-1640 for å vaske av overdreven blod og forsiktig skille flikene ved hjelp saks og pinsett til å kutte lobes 'viktigste stammen bronkie på hilum (figur 1F).
- Plasser fliker, med den flate overflaten og ned for å maksimere avbildning overflate, i en brønn av en 24-brønns avbildningsplate (figur 1G). Tilsett 100 ul av 37 ° C RPMI-1640 på toppen av fliker. Plasser flere 15 mm sirkulært mikroskop dekkglass på toppen av lapper for å hindre at det flyter.
- Hell varmt PBS i de omkringliggende brønner for å hindre at RPMI-1640 media fra evaporating. Sett i 24-brønners plate i den ekvilibrerte klimakammer og vedlikeholde lungelapper ved 37 ° C med luft og 5% CO2. Sett klimakammer på scenen av konfokal mikroskop.
MERK: Andre gassblandinger (for eksempel, til 5% O2, 5% CO2 i 2 N undersøke celle oppførsel under betingelser med hypoksi / nedre oksygen) kan også tas i betraktning.
Figur 1. Protokoll for utarbeidelse av lungene for live avbildning. (A) Eksponering av luftrøret etter utarbeidelsen av musen. (B) Små klipp laget i eksponert luftrøret parallelt med bruskringene. (C) 20 G nål innsatt 4-5 mm inn i luftrøret. (D) Instillasjon av 400 ul 2% lavtsmeltende agarose-temperatur i lungene. (E) inflrerte lungene skilles fra mus. (F) Lobes skilles etter inflasjon. (G) fliker plassert i en brønn i en 24-brønns bildebehandling plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Oppkjøp og analyse av bilder
MERK: Bilder kan bli kjøpt med en rekke spinner disk confocal mikroskoper som støttes av ulike programmer. I denne protokollen, er enten μManager med en skreddersydd spinnende disk confocal mikroskop eller Zen med en kommersielt tilgjengelig spinne disk confocal mikroskop brukes for bildeopptak, mens Imaris brukes til filmredigering og analyse.
- Acquire bilder ved hjelp μManager. En detaljert trinnvis protokoll for kjøp av bilder ved hjelp μManager programvaren er tidligere beskrevet 18.
ELLER - hente bilderved hjelp av bildeanalyse programvare som Zen (se figur S1).
- Klikk på fanen "Finn", og velge objektiv (10x eller 20x) i «Light Path 'verktøyet (figur S1 A, rød boks). Deretter klikker du på 'Eyes - DAPI "for å se på CFP kanal gjennom okularet (Figur S1 A, blå boks). Lokaliser prøven manuelt ved hjelp av mikroskop. Klikk "All Off'after vevet er midt i synsfeltet.
- Klikk på fanen "Erverv" for å sette alle parametere for bildeopptak.
- I "Kanaler" verktøyet, klikker du på "+" knappen (figur S1B, rød boks). En pop-up meny vises, og søk etter fargestoff (e) til stede i prøven i 'Dye Database' (figur S1B). Velg farge og klikk på "Legg til".
MERK: Programmet vil sette alle filter som skal optimaliseres. Et fargestoff kan slettesved å velge det fulgt ved å klikke på papirkurvknappen (figur S1B, gul boks). - I "Acquisition Mode" -menyen, sett "binning" til 5x5. Dobbelklikk på ECFP i menyen kanaler å velge det. Senk lasereffekt til 20%, slik at prøven ikke vil bli bleket mens du setter opp parametrene for bildeopptak.
- Sjekk den "fliser" boksen i "Experiment Manager" seksjonen og fliser verktøyet vises i 'flerdimensjonale Acquisition "verktøy gruppen (Figur S1C). Klikk på "Advanced Setup" -knappen for å se det levende bildet fra kameraet. Klikk på "Legg til" -knappen i 'posisjoner' for å legge til 4 til 6 stillinger til eksperimentet. For å slette en posisjon, velger den posisjonen og klikk på søppelbøtta knappen.
- I "Acquisition Parameter" verktøy gruppe, åpner du "Focus Strategy" verktøy, og velg "Absolute Fast Z-stilling "fra rullegardinlisten.
- Sjekk Z-Stack boksen i "Experiment Manager" seksjonen og Z-Stack verktøyet vises i 'flerdimensjonale Acquisition "verktøy gruppen (Figur S1D). Dobbeltklikk på en av stillingene i "posisjoner" -delen og trykk på "live". Manuelt sette først og angi siste posisjon i bildefeltet. Angi intervall 4 mikrometer.
MERK: Programmet vil bestemme antall skiver for den valgte rekkevidde og intervall. Ideelt sett 5-7 skiver er praktisk å gi tilstrekkelig visualisering og rask image oppkjøpet. - Sjekk 'Time Series' boksen i "Experiment Manager" delen. Still inn ønsket varighet "og" Intervall "ganger i 'Time Series' verktøy som dukket opp i" Flerdimensjonal Acquisition "verktøy gruppen (Figur S1E).
- I "anskaffelsessjon Mode "-menyen, sett" binning "til 2x2. Dobbeltklikk på en fluoroforen i menyen kanaler å velge den og øke laser makt til 100%. Trykk "live" og justere 'Exposure Time'. Gjenta dette for hver fluorophore.
- Sjekk Aktiver Auto Lagre 'boksen. Velg en mappe og skriv inn navnet på filen. Alle de oppkjøpte bildene blir automatisk lagret i denne mappen.
- Klikk på 'Start Experiment "i" Experiment Behandling' for å starte bilde oppkjøpet.
- Etter bilde oppkjøpet, kompilere rådata i Imaris programvare. Konvertere bilder til .ims filer og justeringer kan gjøres. En detaljert trinnvis protokoll for konvertering av filer, gjør justeringer og lagre filmer ved hjelp Imaris er tidligere beskrevet 18.
- Når du lagrer filmen, sette 'Frame Rate' til 5 bilder per sekund (fps).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av roterende disk konfokalmikroskopi, ulike musemodellsystemer og injectables, kan metastatisk mikro visualiseres og spores over tid. Ved hjelp av en MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP trippel transgen musemodell, ulike cellulære komponenter er fluorescensmerket (figur 2A, Movie 1). Den typiske struktur av lunge parenchyma kan visualiseres i CFP kanal, siden alle celler uttrykker ECFP under β-aktin-promoteren. Større / flercellede lungemetastaser er lett løst da disse vises som en bulk av celler i organisert lungestrukturen. Myeloide celler blir visualisert i GFP kanal c-fms -EGFP uttrykk, som er transgene for CSFR-1 12. Myeloide celler er svært dynamisk etter hvert som de vandrer gjennom hele bildefeltet. C-fms -EGFP-positive celler er mer rikelig og vandrende i lunge parenchyma sammenlignet med de som er i nær kontakt med lungenemetastasering. Dynamikken i myeloide celler og deres interaksjon med lungemetastaser kan følges i sanntid i flere timer.
For å undersøke metastatisk såing og vekst, er en eksperimentell metastase modellen (figur 2B, Movie 2). De GFP + VO-PyMT tumorceller ble injisert inn i en villtype, ikke-reporter mus og tillatt å frø og vokse i 2 uker. Strukturen av lungen er klart synlig i den GFP kanalen på grunn av autofluorescens av lungene. Imidlertid VO-PyMT celler som fremdeles lett kan skilles fra den tette struktur siden de har en rund form og høyere EGFP uttrykk således vises lysere sammenlignet med lunge parenchyma. VO-PyMT cellular motilitet kan observeres innenfor den etablerte metastatisk lesjon.
Cellular interaksjoner mellom metastatisk og immunceller i lungene mikromiljøet kan også bli undersøkt ved hjelp av den eksperimentelle metastase modell. To uker etterinjeksjon av VO-PyMT celler, fluorescensmerkede Gr-1 647 konjugerte antistoffer er iv injisert fem timer før lunge eksisjon (figur 2C, Movie 3). På venstre side av bildefeltet, er to Gr-1 + myeloide celler i samspill med en VO-PyMT celle. En metastatisk lesjon er observert på høyre side av bildefeltet. Over tid blir Gr-1 + -celler rekruttert til metastatisk lesjon. Under metastatisk lesjon, en av Gr-1 + celler nært samvirker med en VO-PyMT celle. Til slutt løsner VO-PyMT celle, løsrev fra Gr-1 + celle.
Kombinere reporter transgene musemodeller med den eksperimentelle metastase modell og injiserbare antistoffer merking immunceller gir en tre-farge film. En uke etter injeksjon av VO-PyMT celler i en ACTB-ECFP reporter mus, fluorescensmerkede Gr-1 647 konjugerte antistoffer er iv injisert fem timer før vevet excision (figur 2D, Movie4). Gr-1 + celler migrerer kraftig innenfor synsfeltet, mens en enkelt GFP + metastatisk celle er synlig i sentrum av bildefeltet.
Injisering ulike fluorescerende dekstraner inn reporter mus, som tidligere ble injisert med metastatiske celler, kan gi en fire-farge film (2E Filmer 5-6). Tidlig hendelser i såing av metastasering kan studeres når VO-PyMT celler er visualisert umiddelbart og fire timer etter iv injeksjon i ACTB-ECFP reporter mus. Injeksjon av rhodamin-konjugert, 70 kD dekstran og 10 kD dekstran konjugert til en 647 fluoriserende kode tillater visualisering av lungekapillærer. Bruken av lavere og høyere molekylvekt dekstraner kan potensielt bli anvendt for å detektere endringer i permeabiliteten av blodkar i lungene, siden lavmolekylære molekyler ekstravasere raskere i forhold til de høymolekylære seg 19. selv cellul ar hendelser kan fremdeles bli effektivt undersøkt, film 5 er et eksempel på en vev drift. Hvis det er nødvendig, og i det tilfellet at vevet ikke kan flyttes i løpet av avbildnings sesjon, kan dette rettes opp i etter bildeinnlastingen analyser.
Dette systemet gir en rask, fire-farge kontinuerlig bildeopptak for å følge forskjellige fluorescensmerkede celletyper i lungene metastatisk mikromiljøet. Denne protokollen tillater også visualisering av metastasering av forskjellige størrelser, fra hendelser knyttet til såing av enkeltkreftceller til etablerte metastaser. Videre kan tumorceller og stromale celler bevegelse visualiseres i lungene mikromiljøet sammen med blodårer. Typisk kan cellulær bevegelse observeres i minst 4 timer fra starten av sesjonen avbildning. Observasjonen av forskjellige metastatiske microenvironments innenfor samme lungevevet hjelper til å unngå mus-til-mus variabilitet.
nt "fo: keep-together.within-side =" always ">
Figur 2. Representative bilder fra filmer kjøpt opp av levende avbildning. (A) stillbilde fra et sammenslått Z stabel fra filmen 1 viser myeloide celler i forbindelse med en lungemetastase (gul insert) versus de som er forbundet med lungeparenkym (rød innsats). (B) stillbilde fra et sammenslått Z stabel fra filmen 2 viser GFP + metastatisk celle i en eksperimentell metastase modell. Arrowhead peker på en bevegelig metastatisk celle. (C) øyeblikksbilde av en Z stabel fra filmen 3, og viser ko-lokalisering av fluorescerende signaler fra et GFP + metastase og Gr-1 + -celler visualisert ved hjelp av en Gr-1-antistoff konjugert til en 647 tag (rød pilspiss). Grønne pilspiss peker på en GFP + metastatisk celle som løsner fra metastatisk bulk. Hvite pilspiss peker på en Gr-1 + celle som samhandlet med bevegelige GFP + VO-PyMT celle. (D) Stillbilde fraet fusjonert Z stabelen fra filmen 4 viser GFP + VO-PyMT celler, i ACTB-ECFP mus. En enkelt VO-PyMT celle er synlig i sentrum (grønn pilspiss). Dyret ble injisert med Gr-1 647 konjugert antistoff. (E) Representative Z-stabel av filmer 5 og 6 som viser blodkar i lungene fra musene avlivet umiddelbart etter injeksjon av 70 kD rhodamin-dekstran (rød pilspiss) sammen med GFP + VO-PyMT celler (grønn). Skala barer er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Utfyllende Figur 1. Skjermbildene av ZEN kamera programvare for kjøp av bilder. (A) Først i "lysbanen" verktøy rett målet bør velges (rød boks) og the vev være lokalisert i mikroskopet. (B) Konfigurer kanaler for image oppkjøpet, i 'Channels' verktøy kanaler kan slettes (rød boks) eller lagt til (gul boks). (C) I "fliser" verktøy, kan ulike stillinger legges til eksperimentet. (D) I "Z-Stack 'verktøyet, kan Z-stack settes og tykkelsen på skivene kan justeres. (E) I 'Time Series' verktøyet, varighet og intervall kan stilles inn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. (Høyreklikk for å laste ned). Interaksjoner mellom en lungemetastase og sur. avrunding immunceller ved hjelp av transgene reporter mus Denne filmen viser en metastase i lunge av en trippel-transgen MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP mus der alle cellene er merket med ECFP og myeloide celler er merket med EGFP. Metastasen kan observeres som en bulk av celler i blått i motsetning til den normale lunge arkitekturen. C-fms + myeloide celler migrerer gjennom hele bildefeltet. Denne filmen er en 2 timers 1 min oppkjøpet.
Movie 2. (Høyreklikk for å laste ned). Kreft cellemotilitet i en eksperimentell metastase modell. Denne filmen viser en lungemetastase generert ved iv injeksjon av GFP + VO-PyMT (grønn) celler i en hvete, ikke-reporter, mus. Lungene ble høstet to uker etter injeksjon av VO-PyMT Celler. GFP + celler flytter innenfor metastatisk bulk. Denne filmen er en 4 timers 40 min lang oppkjøpet.
Movie 3. (Høyreklikk for å laste ned). Rekruttering av immunceller visualisert ved fluorescently-konjugerte antistoffer mot eksperimentelt etablert metastasering. Denne filmen viser en lungemetastase generert ved iv injeksjon av GFP + VO-PyMT celler (grønt) i en hvete, ikke- reporter, mus. Lungene ble høstet to uker etter VO-PyMT celler ble injisert. Gr-1 + celler er merket med Gr-1 647 konjugert antistoff og observert i det nære infrarøde kanalen (hvit). Merk at Gr-1 celler blir rekruttert til GFP + metastasering. Denne filmen er et eksempel på en langsiktig oppkjøp, totalt 11 timer 27 min.
Movie 4. (Høyreklikk for å laste ned). Motilitet av immunceller visualisert ved fluorescens-konjugerte antistoffer i en transgen reporter mus injisert med metastatiske celler. Denne filmen viser en enkelt GFP + VO-PyMT celle i lungene som genereres ved iv injeksjon av VO- PyMT celler (grønt) i en ACTB-ECFP mus. Lungene ble høstet en uke etter VO-PyMT celler ble injisert. Gr-1 + celler er merket med Gr-1 647 konjugert antistoff og observert i det nære infrarøde kanalen (hvit). Denne filmen er en 2 timers 40 min lang oppkjøpet.
Movie 5. (Høyre click å laste ned). Metastatisk celler og blodkar visualisert ved fluorescerende dekstraner umiddelbart etter iv injeksjon i en transgen reporter mus. Denne filmen viser eksperimentelle metastase generert ved iv injeksjon av GFP + VO-PyMT celler (grønt) til en ACTB-ECFP mus sammen med injeksjon av rhodamin-konjugert, 70 kD dekstran (rød) og 10 kD dekstran konjugert til en fluorescerende 647 tag (hvit), for å markere blodkar. Denne filmen er et eksempel på en vev drift og er en 18 min lang oppkjøpet.
Movie 6. (Høyreklikk for å laste ned). Metastatisk celler og blodkar visualisert ved fluorescerende dekstraner flere timer etter iv injeksjon i en transgen reporter mus. Denne filmen viser eksperimentelle metastase generered ved intravenøs injeksjon av GFP + VO-PyMT celler (grønn) inn i en ACTB-ECFP mus sammen med injeksjon av rhodamin-konjugert, 70 kD dekstran (rød) og 10 kD dekstran konjugert til en 647 fluorescerende tag (hvit), for å markere blodkar. Lungene ble hentet fire timer etter injeksjon av VO-PyMT celler. Denne filmen er en 19 min lang oppkjøpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver en detaljert metode for ex vivo levende avbildning av lunge metastaser i musemodeller av metastasering. Denne bilde protokollen gir en direkte visualisering av dynamiske og romlige tumorcelle-stroma interaksjoner i lungene mikromiljøet. Det er en relativt enkel og rask fremgangsmåte som gjør det mulig pålitelig avbildning av lungemetastaser i minst 4 timer. Filmer kjøpt fra disse eksperimentene kan brukes til å spore dynamiske prosesser som cellemotilitet og cellulære interaksjoner.
To fremgangsmåter for generering av lungemetastaser ble beskrevet: et genetisk konstruert musemodell, og bruk av en manipulert cellelinje. Den MMTV-PyMT musemodell rekapitulerer brystkreft progresjon og spontan lungemetastaser. Andre teknikker som rekapitulere metastatisk spredning er også tilgjengelig, f.eks., Ortotopisk transplantasjon av celler i brystkjertelen 20. En intravenøst injisert VO-PyMT cell linje blir brukt til å etterligne såing og utvekst av brystkreft metastasering. Tiden kvote for VO-PyMT celle utvekst avhenger av eksperimentelle preferanse for scenen av lungemetastaser. Avhengig av antall injiserte celler, kan mikrometastaser observeres i løpet av flere dager til 2 uker etter VO-PyMT celleinjeksjon.
For optimal lunge bildebehandling, må stor forsiktighet tas under inflasjon av lungene. For riktig lufttrykk, må nålen kun settes inn 4-5 mm inn i luftrøret. Dypere innsetting av nålen kan resultere i delvis, ensidig oppblåsning av lungene. I tillegg bør lungene bli sett under selve inflasjonen å forhindre over-inflasjon som kan føre til vevsskade. Videre er det viktig å holde lungen så sterilt som mulig, slik at immunceller i lunge ikke vil bli utfordret.
For hver levende avbildning eksperiment, den optimale balansen mellom mengden av datainnsamling og the potensialet av vevsskade forårsaket av overdreven eksponering for laser må vurderes. Det er viktig å få optimale innstillinger for bildeopptak ved å kjøre pilotforsøk. Dessuten anbefales det å holde laser makt ned mens du søker etter optimale synsfelt og / eller for å holde utløser av når bildene ikke er anskaffet.
Motilitet av kreft og / eller immunceller av interesse er en av indikatorene for celle vitalitet. Motilitet er følsom for temperatur, oksygennivåer, og fototoksisitet 7. Imidlertid kan hemming eller mangel på motilitet ikke være relatert til bilde forhold eller tekniske problemer, men heller biologisk. Hemming av motilitet kan være resultatet av en viss terapeutisk virkning eller fra arrest av metastatiske celler like før deres spredning i mikrovaskulaturen av lungen og deres uttredelse inn i lunge parenchyma 21,22. Det kan derfor være viktig for å underbygge slike data ved hjelp av ekstrateknikker (som migrasjonsforsøk i 2D kultur) 23.
Videre er tilstrekkelig for en kortvarig studie som ikke krever lunge mikrosirkulasjon denne ex vivo lunge avbildningsmetode. Ved hjelp av denne metoden, blir bevegelse av kreft og / eller immunceller overvåkes i minst 4 timer. Før image oppkjøpet, tar det ca 30 min å forberede lungene og 30-60 min å finne posisjoner for oppkjøpet. Selv cellemotilitet er observert utover 4 timer (opptil 11 timer, Movie 3), avhenger langvarig bildebehandling på bestemte celletyper studert, forholdene brukes (f.eks., Redusert oksygen), og skal fastsettes for en bestemt eksperimentelt oppsett. Videre, på grunn av mangel på mikrosirkulasjonen og den mulige effekten av post mortem endres, eller i tilfelle det er en begrunnelse for et behov for å bekrefte resultatene i nærvær av en intakt mikrosirkulasjonen, kan lunge intravital avbildning med et torakal suge vindu benyttes. Det er imidlertid STIll en utfordring å utføre intra lunge bilde over flere dager ved hjelp av et bildevindu som utføres i hjernen, melkekjertlene og bukorganer 5 på grunn av vanskeligheter med å opprettholde tilstrekkelig undertrykk. Som en alternativ metode for perfusjon av intakte ex vivo lungene, ble det isolert perfusert-lunge metode som tidligere ble brukt for å studere lungemetastaser. Imidlertid er denne metoden ofte brukt for større dyr. Siden mus har mindre thorax hulrom, de utgjør en reell utfordring for effektiv perfusjon 24.
På grunn av lysspredning, er den avbildning dybden av den roterende disk konfokal mikroskopi begrenset. Som en konsekvens, er visualiseringen av celle dynamikk og cellulære interaksjoner begrenset til overfladisk lungemetastase. Lungemetastaser er beriket i lungen periferien siden metastatiske celler er begrenset av kapillærene som minsker i størrelse mot de ytre kantene av lunge en. Dessuten er det eaSier for å opprettholde levedyktigheten av cellene nærmere overflaten av lungen som de foretrukket adgang til media og oksygen. Å tillate dypere visualisering inn i lungene, kan levende avbildning av lunge seksjoner utføres. Imidlertid bør betydelig celledød forventes. Alternativt kan multiphoton mikroskopi utføres, slik at større vev penetrasjon. I tillegg genererer multiphoton avbildning en iboende optisk signal, kalt andre-harmonisk generering (SHG), som tillater visualisering av ikke-centrosymmetric strukturer i den ekstracellulære matriks, så som kollagen 1 fibre.
Som vist i denne studien, kan tumorceller og immun oppførsel i lungemetastaser følges og analysert ved hjelp av fluorescerende rapportør mus, manipulerte tumorceller og fluorescerende merkede sporstoff eller antistoffer. Denne metodikken kan modifiseres for studiet av andre celler og determinantene i det metastatisk mikromiljøet. For å oppnå dette, er det ulike transgenic reporter mus tilgjengelig for stromal blodlegemer inkludert de for fibroblaster som FSP1-EGFP 4, alfa-SMA-RFP 25 og Col1a1-EGFP 25 eller endotelceller som Tie2-GFP 26.
Cell flekker på live lunge seksjoner har blitt utført for å visualisere immuncellepopulasjoner 8. Dette farging strategien kan bli vedtatt som et alternativ for multi-farge bildeopptak. Men flertallet av markører ofte merke flere cellepopulasjoner i stedet for en tydelig cellepopulasjon. Injiserbare preparater som tas opp av spesifikke cellepopulasjoner 4 eller fluorescensmerkede antistoffer mot andre celle markører kan anvendes for ytterligere å skille mellom populasjonene. Bruken av forskjellige fluoriserende farger for å merke de ulike cellene av interesse er å foretrekke for bildebehandling. I de tilfeller hvor bruk av ulike fluorescerende fargestoffer ikke kan utføres (f.eks., På grunn av begrenset avbildning flaels), er det mulig å avbilde forskjellige celletyper med samme fluorescerende reportere, så lenge de lett kan skilles fra formen og / eller anatomisk lokalisering.
I tillegg til å studere forskjellige celletyper, flere klasser av kjemoterapeutika er svakt fluorescerende (for eksempel doksorubicin). Disse kjemoterapeutika kan i prinsippet brukes til å visualisere medikamentavgivelse og fordeling i lungemetastaser i en lignende måte som i primærtumor 19. Andre målrettede terapeutiske midler som kan bli fluorescensmerkede kan også anvendes i ex vivo avbildning lunge. Spesielt, kan dataene innhentet med lungen avbildnings være mer informativ om hvilke celler tar opp disse stoffene og deres interaksjon med andre celler i metastatiske mikromiljøet i tillegg til den ekstravasering av disse terapeutika fra aktive blodkar. Denne teknikken kan bli ytterligere anvendt for studiet av primær lungecancer 27 eller tilpasset for studiet av andre lunge-relaterte sykdommer som kan påvirke lungene mikro 28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
- Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
- Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
- Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
- Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
- Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
- Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
- Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
