Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Published: February 3, 2016 doi: 10.3791/53741
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Abstract

גרורה היא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה מסרטן. גרורה הוא תהליך רב שלב ובשל מורכבותו, התהליכים התאיים והמולקולריים המדויקים שולטי הפצה וצמיחה גרורתי עדיין חמקמקים. הדמיה חיה מאפשרת הדמיה של האינטראקציות הדינמיות המרחבי של תאי microenvironment שלהם. גידולים מוצקים גרורות בדרך כלל אל הריאות. עם זאת, המיקום האנטומי של הריאות מציבה אתגר בפני הדמיה intravital. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומהירה יחסית הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות דינמי בין תאים סרטניים stroma הסובבת אותם בתוך גרורות ריאה. באמצעות שיטה זו, תנועתיות של תאים סרטניים כמו גם יחסי הגומלין בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ב microenvironment שלהם ניתן דמיינו בזמן אמת במשך כמה שעות. באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים, שורת תאי פלורסנט, בזריקות שכותרתו fluorescentlyמולקולות ו / או נוגדנים, מספר רכיבים של microenvironment הריאות יכולות להיות חזותי, כגון כלי דם ותאי חיסון. כדי לדמות את סוגי התאים השונים, דיסק מסתובב מיקרוסקופ confocal המאפשר הדמיה רציפה ארוכת טווח עם מהירה, רכישת תמונה בארבעה צבעים נוצל. הזמן לשגות סרטים מלוקטים מתמונות שנאספו במשך מספר רב של עמדות ומטוסים מוקדי להראות אינטראקציות בין גרורה חיים ותאי חיסון במשך שעה לפחות 4. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להוסיף ולבדוק כימותרפיה או טיפול ממוקד. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר פתולוגיות הקשורות ריאה אחרת שעלולים להשפיע על המיקרו-סביבת הריאות.

Protocol

כל ההליכים המתוארים חייב להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כולל אישור מראש על ידי טיפול מוסדי בעלי חיים הוועדה המקומית שימוש (IACUC).

דור 1. ריאות גרורות עבור vivo לשעבר הדמית חיה (מהונדס או זנב וריד הזרקה)

הערה: גרורות ריאות יכול להיווצר על ידי ניצול מודלים עכבר מהונדס גנטית או על ידי תוך ורידי (IV) הזרקה של תאים סרטניים.

  1. צור גרורות סרטניות בריאות הדמיה ידי חצייה במודל של עכברי גידול מהונדס גנטית לעכבר כתב מהונדס, למשל, לחצות את במודל העכברי של סרטן שד, המסוף ארוך וירוס גידול חלב העכבר החוזר-polyoma אנטיגן באמצע T (MMTV-PyMT) 11 לתוך ACTB-ECFP עכבר מודל 12.
    הערה: מודל ACTB-ECFP מבטא משופרת חלבון פלואורסצנטי ציאן (ECFP) תחת β-המעשהב אמרגן כך שכל התאים לזרוח בערוץ כחול, CFP. עם זאת, תאים סרטניים הם ללא ספק הבולטים ונראים כמו הארי של תאים ECFP חיובי תחת מיקרוסקופ. מודל עכבר MMTV-PyMT מפתחת מחלה מתקדמת, שבה צמיחת גידול חלב קשורה להפצת תאים סרטניים לפריפריה, במיוחד אל ריאות. בעכברים MMTV-PyMT על FVB / n רקע, micrometastases ניתן לצפות סביב 10-11 שבועות של גיל. באופן כללי, התקדמות אלה macrometastases בסביבות 14 שבועות של גיל 13.
    אוֹ
  2. צור גרורות ניסיון באמצעות תאים ראשוניים או שורות תאי syngeneic. השתמש בתאי גידול ראשוני מניפולציות במבחנה או שורות תאים (למשל., תמרה) ואחריו הזרקת iv 14.
    1. בקצרה, בפרוטוקול זה, להזריק חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing (+) שורת תאי MMTV-PyMT לעכברי כתב ניאון (ACTB-ECFP) או עכברי wildtype. אז,לדמיין תאים אלה מכונים 15 תאים VO-PyMT באמצעות המסלול הירוק, GFP.
      הערה: שורת תאי VO-PyMT המקורי נגזרו על אורתופדיה ונדרבילט בנשוויל, טנסי. VO מייצג אורתופדיה ונדרבילט.
    2. בעקבות הזרקה של 10 6 תאים (200 μl), להתבונן extravasation תא סרטני מיד ועד כמה שעות לאחר ההזרקה; להתבונן micrometastases בין 1-3 שבועות לאחר ההזרקה וכדי לזהות macrometastases 3 שבועות לאחר ההזרקה 15.
      הערה: פחות תאים ניתן להזריק להאריך את הזמן בין הזרקה לצמיחה גרורתי.

2. תיוג של רכיבי ענייני microenvironment גרורתי (טרנסגניים ו / או הזרקה)

הערה: תיוג יכול להיות מושגת על ידי עכברים מהונדסים ו / או על ידי הזרקה שונה. הקפד להשתמש בצבעי ניאון שונים עבור תיוג של סוגי תאים שונים.

  1. רכיבי תווית של microenvironment גרורתי באמצעות עכברים מהונדסים. נחצה את מודל הגידול העכבר שהוזכרו לעיל (למשל., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) למודל עכבר מהונדס שבו תאים סטרומה עניין מסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי שהוא לא ECFP, למשל., ג-FMS-EGFP 4,16.
    הערה: בנוסף להדמיה של תאים סרטניים בערוץ CFP, זו מאפשרת הדמיה של תאים מיאלואידית ב GFP ערוץ 4.
    ו / או
  2. לייבל רכיבים שונים של microenvironment גרורתי באמצעות הזרקה לעכברי כתב ניאון מהונדסים או (לא ניאון) עכברי wildtype.
    הערה: תרכובות כמה ניתן להזריק לתייג רכיבים שונים של microenvironment גרורתי, למשל, נוגדן AF647 מצומדות Gr-1 משמש כאן לתייג נויטרופילים וכמה מונוציטים 13 ו dextrans המשקל המולקולרי שונים משמשלתייג נימי ריאות. להכנת ההזרקה אלה ראו שלב 4.

3. הכנת חומרים לפני החיתוך

  1. 2% Agarose
    1. לשקול 0.2 גרם של agarose ולהוסיף 10 מ"ל 1 x PBS. מחממים את הפתרון לפזר את agarose. Agarose יהיה לגבש ב RT, אז לשמור אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד בשימוש לאינפלציה.
  2. CO 2 ו בקר טמפרטורה
    1. בדוק DDH 2 O בתא humidification. מילוי בעת הצורך. הכנס צלחת תצורה לתוך בעל צלחת במת טמפרטורה (תא האקלים). הפעל את בקר ה- CO 2 ולהגדיר 2 CO ב -5%. ודא שקצב זרימת האוויר מוגדר 0.4 NL / min.
    2. פתח את האוויר ושסתום 2 CO. הפעל את בקר הטמפרטורה. צריך להקפיד שהטמפרטורה של החדר האקלים והמכסה נקבעים על 37 מעלות צלזיוס.
    3. שחרר לחץ אוויר על מטר 2 CO. בדוק CO 2 הגדלה, דוארquilibration עשוי להימשך עד 30 דקות.
  3. דיסק confocal ספינינג מיקרוסקופ
    הערה: פרטים על הגדרת מיקרוסקופ תוארו בעבר 4,17.
    1. הפעל לייזרים (הלייזר ארגון עבור עירור 488 ננומטר ננומטר של מצב מוצק 405, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים). הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה, יחידת בקרת דיסק ספינינג, AOTF, יחידת בקרת הליזר לבין בקר המצלמה.
    2. פתח את תריס מיקרוסקופ, להדליק את המחשב פועל המיקרוסקופ ולפתוח את התוכנה.
  4. הכנת הכלים והפלטפורמה לנתיחה.
    1. הפעל מעקר את החרוז החם ולתת לו להגיע 250 מעלות צלזיוס. 2 זוגות נקיים של מספרי מלקחיים כירורגית עם מים וסבון. לעקר את הכלים שניים 30 לפחות. תנו את הכלים להתקרר. השתמש מכסה פוליסטירן כפלטפורמה לנתיחה. כסה אותה בפיסת שתיין במעבדה.

4. הכנת זריקות

הערה: בהתאם את זמן מחצית החיים ואת התגובה המועדפת, להזריק fluorescently שכותרתו נוגדנים ו / או מולקולות ניאון או מיד לפני להקריב בעלי חיים או כמה שעות עד ימים לפני.

  1. חזרה לתמונה Gr1 חיובי נויטרופילים ומונוציטים, להכין מזרק עם 7 μl של AF647 מצומדות המניות Gr-1 נוגדנים (1 מ"ג / מ"ל) לתוך 100 μl של PBS סטרילי מתחת למכסה המנוע. מניחים מחט G ½ 27 על המזרק.
  2. כדי נימים ריאות תמונה, להכין מזרק השני והשלישי עם 100 μl של 70 או dextran rhodamine מצומדות KD (4 מ"ג / מ"ל) או 10 KD dextran AF647 מצומדות (4 מ"ג / מ"ל). מניחים מחט G ½ 27 על המזרקים.
  3. להזריק את hr iv 5 פתרון נוגדן AF647 מצומדות לפני כריתה של הריאות.
  4. להזריק אחד או שני פתרונות dextran iv הערב 'כריתת הריאות.

5. הכנת הריאות עבור vivo לשעבר הדמיה חיה

הערה: נסה לעבוד סטרילי וזהירה ככל האפשר כדי להימנע אתגרים מיותרים של תאים חיסוניים בתוך הריאות.

  1. להזריק את intraperitoneal העכבר (IP) באמצעות מנת יתר קטלנית של הרדמה המותר על פי פרוטוקול חיה שאושר על ידי IACUC, למשל., 1 מ"ל של 2.5% Avertin. חכה בעכבר כדי להפסיק לנשום ולהיות שאינם מגיבים לחלוטין לגירויים מזיקים (קמצוץ כפה אחורי).
    הערה: נקע בצוואר הרחם המתת חסד פחמן דו חמצני יש להימנע כפי שהוא יכול להשפיע לרעה על כדאיות התא ריאות.
  2. לשתק את העכבר על קרש חיתוך לעקר את העכבר עם אתנול 70%.
  3. השתמש במספריים כירורגית שיחולל תחילה חתך רוחבי ברום הבטן דרך העור, ואחריו חתך דומה דרך הצפק. החזק את קרש החיתוך במצב אנכי וחתך את אבי העורקים יורד, כך מצטבר דם למטה בבטן ולא בתוך חלל החזה.
  4. Sלגדוע פתח קטן בסרעפת לשחרר ואקום. גזור לאורך הצלע -10 וה -12 שיחתוך את הסרעפת ולקבל גישה ויזואלית אל הריאות.
  5. השתמש במספריים כירורגית לחתוך את העור עד קנה נשימה מעל צלעותיו אבל לעזוב את בית החזה ללא פגע. הפרד את העור מפני בית החזה. לחשוף את קנה הנשימה על ידי הסרת רקמת החיבור שמסביב, נזהר שלא לפגוע קנה הנשימה עצמו (איור 1 א).
  6. לגזור פתח קטן כ 1 מ"מ הקוטר במקביל קנה נשימה החשופה טבעות הסחוסים, קרוב הגרון ככל האפשר (איור 1 ב). היזהר שלא לחתוך לחלוטין דרך קנה הנשימה.
  7. קח מחט 20 G ו בעדינות להכניס את המחט מ"מ 4-5 לתוך קנה הנשימה ללא כוח נגדי (1D איור). סופו של מחט צריך להיות גלוי דרך קנה הנשימה (איור 1 ג). שימוש במלקחיים כדי לייצב את המחט בתוך קנה הנשימה. לחלופין, תפר עשוי להיות קשור Around קנה הנשימה להחזיק את המחט במקום.
    הערה: על ידי הוספה עמוקה מדי, קארינה ניתן טראומה או רק צד אחד של ריאות עלולים להיות מנופח.
  8. ממלאים מזרק עם 400 μl של 37 ° C 2% agarose התכה נמוכה בטמפרטורה (נלקח ישירות מאמבט טמפרטורה קבועה). ודא קרש החיתוך בעמידה ולאט לאט להחדיר את agarose חם דרך המחט אל תוך הריאות, השתמש ~ 400 μl כדי לנפח את הריאות.
    הערה: צופה ריאות הניפוח בתוך בית החזה. אל מעל לנפח את הריאות כפי שהוא יהיה קרע.
  9. לאחר הריאות מנופחות, מילוי ~ ⅔ של כלוב צלעות, לנתק את המזרק ולשמור את המחט בתוך קנה הנשימה כדי למנוע כל agarose מ דולפת.
  10. יוצק כ 50 מיליליטר של 20 ° C PBS מעל הריאות המנופחות כדי לאפשר agarose בתוך הריאות להגדיר לחזק. לאט להוציא את המחט ולסגור את קנה הנשימה עם מלקחיים כדי למנוע כל אי-הקרושה agarose מ דולף. </ Li>
  11. לחשוף את הריאות על ידי ביצוע sternotomy ובהמשך שיחתוך את הריאות. עבור כריתה של הריאות, על מנת להחזיק את קנה הנשימה תוך חיתוך דרך קנה הנשימה לחלוטין. משוך בעדינות את קנה הנשימה, לחתוך את רקמת החיבור והוושט תוך משייכת הריאות מתוך חלל החזה עד הריאות מופרדות העכבר (איור 1E).
  12. לטבול את הריאות ב RPMI-1640 חם לשטוף דם מוגזם בעדינות להפריד את האונות באמצעות מספריים מלקחיים לחתוך את הסמפונות הגבעול המרכזי 'האונות ב hilum (איור 1F).
  13. מניח את האונות, עם המשטח השטוח למטה על מנת למקסם את שטח הדמיה, בעוד גם צלחת הדמיה 24 גם (1G איור). הוספת 100 μl של 37 ° C RPMI-1640 על גבי האונות. מניחים כמה 15 מ"מ שקופיות כיסוי מיקרוסקופ עגול על גבי האונות כדי למנוע ממנה צף.
  14. יוצקים PBS חם לתוך הבארות שמסביב למנוע התקשורת RPMI-1640 מ EVAPנואם. הכנס את צלחת 24 גם לתוך תא אקלים equilibrated ולתחזק את אונה של הריאות ב 37 מעלות צלזיוס עם% אוויר ו -5 CO 2. הכנס את קאמרית האקלים על הבמה של המיקרוסקופ confocal.
    הערה: תערובות גז אחרות (למשל, 5% O 2, 5% CO 2 ב N 2 לבחון התנהגות תא בתנאים של היפוקסיה / חמצן נמוך) יכולה להיות גם נחשבת.

איור 1
איור 1. פרוטוקול להכנת ריאות הדמיה לחיות. (א) חשיפה של קנה נשימה לאחר הכנה של עכבר. (ב) חיתוך קטן שנעשה במקביל קנה נשימה החשופה טבעות הסחוסים. (ג) 20 מחט G מוכנס 4-5 מ"מ לתוך קנה הנשימה. (ד) החדרה של 400 μl 2% נמוכים היתוך בטמפרטורה agarose לריאות. (E) Inflריאות ated מופרדות העכבר. (F) אונות נפרדו לאחר האינפלציה. (G) לאונות להציב גם צלחת הדמיה 24 באר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. רכישה וניתוח של תמונות

הערה: תמונות ניתן לרכוש עם מגוון רחב של ספינינג מיקרוסקופים confocal דיסק נתמך על ידי תוכנות שונות. בפרוטוקול זה, או μManager עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב מחוייט או זן עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב, זמין מסחרית משמש לרכישת התמונה, בעוד Imaris משמש לעריכת סרטים וניתוח.

  1. לרכוש תמונות באמצעות μManager. צעד מפורט על-ידי פרוטוקול צעד לרכישת תמונות באמצעות תוכנת μManager מתואר בעבר 18.
    אוֹ
  2. לרכוש תמונותתוכנת ניתוח תמונה באמצעות כגון זן (ראה איור S1).
    1. לחץ על הכרטיסייה 'אתר', ולבחור אובייקטיבי (10x או 20x) בכלי 'נתיב האור' (איור S1A, תיבה אדומה). בהמשך לכך, לחץ על 'עיניים - DAPI' להסתכל על ערוץ CFP דרך עיני (האיור S1A, קופסא כחולה). למקם את המדגם באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ. לחץ על 'כל Off'after הרקמה במרכז שדה הראייה.
    2. לחץ על הכרטיסייה 'רכישה' כדי להגדיר את כל הפרמטרים לרכישת התמונה.
    3. בכלי 'ערוצים', לחץ על '+' כפתור (איור S1B, תיבה אדומה). תפריט מוקפץ מופיע ולחפש את צבען (ים) הנוכחי במדגם ב 'מסד דיי' (איור S1B). בחר את הצבע ולחץ על 'הוסף'.
      הערה: התוכנית תקבע את כל המסננים להיות מותאם. ניתן למחוק לצבועעל ידי בחירה בו ואחריו לחיצה על כפתור פח האשפה (האיור S1B, תיבה צהובה).
    4. בתפריט 'מצב רכישה', להגדיר 'binning' כדי 5x5. לחץ לחיצה כפולה על ECFP בתפריט הערוצים כדי לבחור בו. מנמיכים את כוח לייזר עד 20% כך המדגם לא יהיה מולבן בעת ​​הגדרת הפרמטרים לרכישת התמונה.
    5. סמנו את התיבה 'האריחים' בקטע 'מנהל ניסוי' וכלי האריחים מופיע בקבוצת הכלי 'הרכישה רבה הממדית "(האיור S1C). לחץ על כפתור 'הגדרות מתקדמות' כדי להציג את התמונה בזמן אמת מהמצלמה. לחץ על הכפתור 'הוסף' בקטע 'ועמדות להוסיף 4 עד 6 עמדות הניסוי. להסיר עמדה, בחר מיקום כי ולחץ על כפתור פח האשפה.
    6. בקבוצת הכלי 'פרמטר הרכישה', פתח את הכלי "אסטרטגית הפוקוס ', ובחר' אבסולוטדואר קבוע Z-עמד מהרשימה נפתחת.
    7. סמן את התיבה Z-Stack במקטע 'מנהל ניסוי' והכלי-סטאק Z מופיע בקבוצת כלי 'רב מימדי רכישת' (איור S1D). לחץ לחיצה כפולה על אחת מעמדות במקטע 'הפוזיציות' ולחץ על 'בשידור חי'. הגדר באופן ידני הראשונה ולהגדיר בתפקידו האחרון של בתחום ההדמיה. הגדר את המרווח ב 4 מיקרומטר.
      הערה: התכנית תקבע את מספר הפרוסות עבור מגוון מרווח הנבחר. באופן אידיאלי, 5-7 פרוסות נוחות כדי לאפשר ויזואליזציה מספיק ורכישת תמונה מהירה.
    8. סמנו את התיבה 'סדרות עתיות' בקטע 'מנהל ניסוי'. בקבוצה הרצויה 'משך' ושעות 'מרווח' בכלי 'סדרות עתיות "שהופיעו בקבוצת כלי' רכישת רב ממדית" (איור S1E).
    9. בשנות ה Acquisition מצב 'התפריטים, להגדיר' binning 'כדי 2x2. לחץ לחיצה כפולה על fluorophore בתפריט ערוצים כדי לבחור בו ולהגביר את כוח לייזר עד 100%. לחץ 'בשידור חי' ולהתאים את 'זמן חשיפה'. חזור על פעולה זו עבור כל fluorophore.
    10. סמן את התיבה 'אפשר שמירה אוטומטית'. בחר תיקייה ולהקליד את שם הקובץ. כל התמונות רכשה יישמרו באופן אוטומטי בתיקייה זו.
    11. לחץ על 'התחלת ניסוי' בקטע 'מנהל ניסוי' כדי להתחיל רכישת התמונה.
  3. לאחר רכישת תמונה, לקמפל את הנתונים הגולמיים בתוכנת Imaris. המרת תמונות .ims קבצים יכולות להתבצע התאמות. צעד מפורט על-ידי פרוטוקול צעד לגיור של קבצים, ביצוע התאמות וסרטי חיסכון באמצעות Imaris מתואר בעבר 18.
  4. בעת שמירת הסרט, להגדיר את 'מסגרת השיעור' עד 5 פריימים לשנייה (fps).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, מערכות במודל של עכברים שונים הזרקה, במיקרו-סביבה של גרורתי ניתן דמיינו מסומנים לאורך זמן. שימוש MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ג-FMS-EGFP במודל עכבר משולשת מהונדס, מרכיבים תאיים שונים מסומנים fluorescently (איור 2 א, סרט 1). המבנה הטיפוסי של parenchyma ריאות ניתן דמיינו בערוץ CFP מאז כל התאים לבטא ECFP תחת האמרגן β-אקטין. גדולות / גרורות סרטניות בריאות רבה-תאיים נפתרות בקלות כמו אלה מופיע כמעין בתפזורת של תאים בתוך מבנה ריאות המאורגנות. תאים מיאלואידית הם דמיינו בערוץ GFP דרך c-FMS -EGFP הביטוי, המהווה את transgene עבור CSFR-1 12. תאים מיאלואידית מאוד דינמיים של כ תעבור ברחבי בתחום ההדמיה. ג-FMS -EGFP חיוב תאים הם יותר שופעים נודדי parenchyma ריאות, בהשוואה לאלו בקשר הדוק עם הריאותגרורות. הדינמיקה של תאים מיאלואידית ויחסי הגומלין שלהם עם גרורות סרטניות בריאות ניתן בעקבות בזמן אמת במשך כמה שעות.

כדי לבחון זריעה וצמיחה גרורתי, מודל גרורות ניסיוני משמש (איור 2 ב, סרט 2). תאי הגידול GFP + VO-PyMT הוזרקו עכבר wildtype, הלא כתב ואיפשר זרע ולגדול במשך 2 שבועות. המבנה של הריאה נראה בבירור בערוץ GFP בשל autofluorescence של הריאות. עם זאת, תאי VO-PyMT עדיין להבחין בקלות ממבנה הריאות שכן יש להם צורה עגולה והבעת EGFP גבוהה ובכך להיראות בהירה לעומת parenchyma הריאות. VO-PyMT תנועתיות הסלולר ניתן להבחין בתוך הנגע גרורתי הוקמה.

אינטראקציות הסלולר בין גרורתית תאים חיסוניים במיקרו-סביבה של הריאות יכול גם להיבדק באמצעות מודל גרורות ניסיוני. שבועיים לאחרהזרקה של תאי VO-PyMT, שכותרתו fluorescently Gr-1 647 נוגדנים מצומדות הם iv מוזרק 5 שעות לפני כריתת ריאות (איור 2 ג, סרט 3). בצד שמאל של השדה הדמיה, שני Gr-1 + תאים מיאלואידית נמצאים באינטראקציה עם תא VO-PyMT. פצע גרורתי הוא ציין בצד ימין של שדה ההדמיה. במשך הזמן, תאי Gr-1 + מגויסים הנגע גרורתי. להלן הנגע גרורתי, באחד התאים Gr-1 + אינטראקציה בשיתוף פעולה הדוק עם תא VO-PyMT. בסופו של דבר, את תא VO-PyMT שמחלץ, מתנתק מן התא Gr-1 +.

שילוב מודלי עכבר כתב מהונדס עם מודל גרורות ניסיוני ונוגדנים בזריקות תיוג תאים חיסוניים מניב סרט תלת צבע. שבוע לאחר ההזרקה של תאי VO-PyMT לעכבר כתב ACTB-ECFP, שכותרתו fluorescently Gr-1 647 נוגדנים מצומדות הם iv מוזרק 5 שעות לפני כריתת רקמה (2D איור, סרט4). Gr-1 + תאים נודדים נמרצות בתוך שדה הראייה, בעוד GFP יחיד + תא גרורתי גלוי במרכז בתחום ההדמיה.

הזרקת dextrans ניאון שונה לעכברים הכתב, אשר הוזרקו בעבר עם תאים גרורתי, יכול להניב סרט בארבעה צבעים (איור 2E, סרטים 5-6). אירועים בתחילת הזריעה של הגרורות ניתן ללמוד כאשר תאי VO-PyMT הם דמיינו מייד ו -4 שעות לאחר הזרקת iv לעכברי כתב ACTB-ECFP. הזרקת מצומדות-rhodamine, 70 dextran KD ו -10 KD dextran מצומדות לתגית 647 ניאון מאפשרת הדמיה של נימי ריאות. השימוש dextrans משקל מולקולרי נמוך וגבוה יכול להיות מנוצל באופן פוטנציאלי כדי לזהות שינויים חדירות של נימי דם בתוך הריאות, מאז מולקולות משקל מולקולרי נמוך extravasate יותר מהר לעומת אלה משקל מולקולרי גבוה 19. למרות Cellul אירועי ar עדיין ניתן ללמוד ביעילות, סרט 5 הוא דוגמא של סחיפת רקמות. במידת הצורך ובמקרה הרקמה לא יכול להיות מיקומו במהלך הפגישה הדמיה, זה יכול להיות מתוקן במהלך רכישת התמונה פוסט ניתוחי.

מערכת זו מאפשרת רכישת תמונה רציפה מהירה, בארבעה צבעים לעקוב סוגי תאים שכותרתו שונה fluorescently במיקרו-סביבה של גרורתי ריאות. פרוטוקול זה גם מאפשר הדמיה של גרורות בגדלים שונים, מאירועים הקשורים הזריעה של תאי סרטן יחידים גרורים הוקם. יתר על כן, תאים סרטניים ותנועה תאים סטרומה ניתן דמיינו במיקרו-סביבה של הריאות יחד עם כלי הדם. בדרך כלל, תנועת הסלולר ניתן לצפות לפחות 4 שעות מתחילת הפגישה הדמיה. התצפית של microenvironments גרורה השונה בתוך אותה הרקמה הריאה עוזרת למנוע עכבר אל עכבר השתנות.

NT "FO: keep-together.within-page =" תמיד "> איור 2
איור 2. נציגים תמונות מסרטים נרכשו על ידי הדמיה לחיות. (א) תצלום של ערימת Z הממוזגת מסרט 1 מראה תאי מיאלואידית קשורים גרור ריאות (להוסיף צהוב) לעומת אלה הקשורים parenchyma הריאות (להוסיף אדום). (ב) התצלום של ערימת Z הממוזגת מסרט 2 מראה GFP + תאי גרורתי מודל גרורות הניסיון. ראש החץ מצביע על תא גרורתי ניע. (ג) תצלום של ערימה Z מסרט 3 מראה שיתוף לוקליזציה של אותות ניאון מתוך GFP + גרורות ו Gr-1 + תאים דמיינו ידי נוגדן Gr-1 מצומדות כדי (חץ אדום) 647 תג. נקודות חץ ירוקות על GFP + תא בגרורות וחלצו מן בתפזורת גרורתי. נקודות ראש חץ לבנות לתא + Gr-1 שהשתלב עם תא GFP + VO-PyMT הניע. (ד) תצלום שלערימה Z הממוזגת מסרט 4 מראה תאים GFP + VO-PyMT, עכבר ACTB-ECFP. תא בודד VO-PyMT גלוי במרכז (חץ ירוק). החיה הזריקה Gr-1 647 נוגדן מצומדות. (ה) נציג Z- מחסנית של סרטים 5 ו -6 מראים כלי הדם בריאים של עכברים הקריב מייד לאחר ההזרקה של 70 KD rhodamine-dextran (חץ אדום) יחד עם תאי GFP + VO-PyMT (הירוק). ברי סולם הם 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1 משלים
יריות באיור 1. מסך משלים של תוכנת מצלמת ZEN לרכישת תמונות. (א) ראשית, בכלי 'נתיב האור' המטרה התקינה צריכים להיבחר (תיבה אדומה) ו הרקמת דואר להיות מקומי במיקרוסקופ. (ב) גדר ערוצים לרכישת תמונה, באפיקי הכלי 'ערוצי' ניתן למחוק (התיבה האדומה) או להוסיף (תיבה צהובה). (ג) בכלי 'אריחים', ניתן להוסיף עמדות שונות הניסוי. (ד) בכלי 'Z-Stack ", את ערימת Z ניתן להגדיר את העובי פרוס יכול להיות מותאם. (E) בכלי 'סדרות עתיות ", משך מרווח ניתן להגדיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1

סרט 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). אינטראקציות בין גרורת ריאות sur. סרט עיגול תאים חיסוניים באמצעות עכברי כתב מהונדס זה מראה גרור בריא של טריפל-המהונדס MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ג-FMS-EGFP העכבר שבו כל התאים מסומנים עם ECFP ותאי מיאלואידית מסומנים עם EGFP. הגרורה ניתן לצפות בתור חלק ארי של התאים בכחול בניגוד ארכיטקטורת הריאות הנורמלית. ג-FMS + תאי מיאלואידית נודד ברחבי בתחום ההדמיה כולה. הסרט הזה הוא רכישת 2 hr 1 דקות.

סרט 2

סרט 2. (קליק ימני להוריד). תנועתיות תא הסרטן במודל גרור הניסיון. סרט זה מראה גרורות ריאות שנוצרו על ידי הזרקת iv של GFP + VO-PyMT (ירוק) תאים לתוך wildtype, הלא כתב, עכבר. ריאות נבצרו שבועות לאחר ההזרקה של VO תאי -PyMT. GFP + תאים עוברים בתוך בתפזורת גרורתי. סרט זה הוא רכישה באורך 4 שעות 40 דקות.

סרט 3

סרט 3. (קליק ימני להוריד). גיוס של תאים חיסוניים דמיינו ידי נוגדני fluorescently- מצומדות תיוצר גרורות ניסיון. סרט זה מראה גרורות ריאות שנוצרו על ידי הזרקת iv של תאי GFP + VO-PyMT (הירוק) לתוך wildtype, הלא כתב, עכבר. ריאות נבצרו שבועות לאחר שתאי VO-PyMT הוזרקו. Gr-1 + תאים מסומנים עם Gr-1 647 נוגדן מצומדות וצפו בערוץ האינפרה אדום הקרוב (לבן). שים לב תאים Gr-1 מגויסים גרורות + GFP. סרט זה הוא דוגמה של הרכישה לטווח ארוך, בסך הכל 11 שעות 27 דקות.

ther.within-page = "תמיד"> סרט 4

סרט 4. (קליק ימני להוריד). תנועתיות של תאים חיסוניים דמיינו ידי נוגדנים fluorescently- מצומדות בעכבר הכתב מהונדס הוזרקו תאים גרורתי. סרט זה מראה תא יחיד GFP + VO-PyMT בריאה שנוצר על ידי הזרקת iv של VO- תאי PyMT (ירוק) לעכבר ACTB-ECFP. ריאות נבצרו שבוע לאחר תאי VO-PyMT הוזרקו. Gr-1 + תאים מסומנים עם Gr-1 647 נוגדן מצומדות וצפו בערוץ האינפרה אדום הקרוב (לבן). הסרט זה הוא רכישה ארוכה 2 hr 40 min.

סרט 5

סרט 5. (clic העכברk להוריד). תאים ונימים גרורתי מדמיינים ידי dextrans פלורסנט מייד לאחר הזרקת iv לעכבר כתב מהונדס. סרט זה מציג גרורות הניסיון שנוצרו על ידי הזרקת iv של תאי GFP + VO-PyMT (הירוק) לעכבר ACTB-ECFP יחד עם הזרקת מצומדות-rhodamine, 70 dextran KD (אדום) ו -10 KD dextran מצומדות לתגית 647 ניאון (לבן), כדי לסמן את כלי הדם. סרט זה הוא דוגמא של סחיפת רקמות הנו רכישה ארוכה 18 דקות.

סרט 6

סרט 6. (קליק ימני להוריד). תאים ונימים גרורתי מדמיינים ידי dextrans ניאון כמה שעות לאחר הזרקת iv לעכבר כתב מהונדס. סרט זה מציג גרורות ניסיוניות ליצורד בזריקה iv של תאים GFP + VO-PyMT (ירוק) לעכבר ACTB-ECFP יחד עם הזרקת rhodamine מצומדות, 70 KD dextran (אדום) ו -10 KD dextran מצומדות לתגית 647 ניאון (לבן), כדי לסמן כלי דם. הריאות נאספו 4 שעות לאחר ההזרקה של תאי VO-PyMT. הסרט זה הוא רכישה ארוכה 19 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה מתאר שיטה מפורטת עבור הדמית vivo לשעבר חיים של גרורות ריאה בעכברי מודל של גרורות. פרוטוקול הדמיה זו מספקת להדמיה ישירה של אינטראקציות stroma תאים סרטניים דינמית מרחבית במיקרו-סביבה של הריאות. זוהי השיטה קלה ומהיר יחסית המאפשר הדמיה אמינה של גרורות ריאה במשך שעה לפחות 4. סרטים רכשו מניסויים אלה יכולים לשמש למעקב אחר תהליכים דינמיים כמו תנועתיות תא אינטראקציות הסלולר.

שתי שיטות לייצור גרורות ריאות תוארו: במודל של עכברים מהונדסים גנטית והשימוש קו התא מניפולציות. מודל עכבר MMTV-PyMT משחזר התקדמות סרטן שד גרור ריאה ספונטנית. טכניקות אחרות כי לשחזר התפשטות גרורתית זמינים אף הם, למשל., השתלת orthotopic של תאים בבלוטת החלב 20. מוזרק לווריד ג VO-PyMTell הקו משמש לחקות זריעת תולדה של גרורות סרטן השד. הפרשת זמן תולדת תא VO-PyMT תלוי ההעדפה הניסיונית לשלב של גרורות ריאה. בהתאם למספר של תאים מוזרקים, micrometastases ניתן להבחין בתוך מספר ימים עד 2 שבועות לאחר הזרקת תא VO-PyMT.

עבור הדמיה ריאות אופטימלי, בזהירות רבה יש לנקוט במהלך התפיחה של הריאות. בשל האינפלציה נכונה, מחט צריך להיות מוכנס רק 4-5 מ"מ לתוך קנה הנשימה. כניסה עמוקה יותר של המחט עלולה לגרום חלקי, אינפלציה חד הצדדית של ריאות. בנוסף, הריאות צריכות להישמר במהלך האינפלציה בפועל כדי למנוע יתר אינפלציה שעלול לגרום ניזק לרקמות. יתר על כן, חשוב לשמור על הריאה סטרילי ככל האפשר כך תאים חיסוניים הריאה לא ניתן לערער.

עבור כל ניסוי הדמיה לחיות, את שיווי המשקל האופטימלי בין כמות רכישת נתונים הפוטנציאל הדואר של נזק לרקמות הנגרם על ידי חשיפה לייזר מוגזם צריך להיחשב. חשוב כדי לייעל את ההגדרות לרכישת תמונה על ידי הפעלת ניסויי פיילוט. כמו כן, מומלץ לשמור על כוח לייזר למטה תוך חיפוש שדות אופטימלי של נוף ו / או לשמור את התריס off כאשר התמונות אינן נרכשות.

תנועתיות של סרטן ו / או תאי מערכת החיסון של עניין הוא אחד המדדים עבור חיוניות התא. תנועתיות רגיש לטמפרטורה, רמות חמצן, phototoxicity 7. עם זאת, עיכוב או חוסר תנועתיות לא עשויה להיות קשורה לתנאי הדמיה או בעיות טכניות אלא ביולוגי. עיכוב של תנועתיות לנבוע השפעה טיפולית מסוימת או מהמעצר של תאים גרורתי רק לפני שגשוגם בתוך נימי הדם הזעירים ריאות extravasation שלהם לתוך parenchyma ריאות 21,22. ייתכן אפוא חשוב לאשש נתונים כאלה באמצעות נוסףטכניקות (כמו מבחני הגירה בתרבות 2D) 23.

יתר על כן, שיטת הדמיה ריאות vivo לשעבר זה מספיק עבור מחקר לטווח קצר שאינו מחייב מיקרו ריאות. באמצעות שיטה זו, התנועה של סרטן ו / או תאי מערכת החיסון הוא ציין לפחות שעה 4. לפני רכישת תמונה, זה לוקח בערך 30 דקות כדי להכין את הריאות 30-60 דקות כדי למצוא עמדות עבור רכישה. למרות תנועתיות תא הוא ציין מעבר ל -4 שעות (עד 11 שעות, סרט 3), הדמיה ממושכת תלויה בסוג התא המסוים למדו, תנאים המשמש (למשל., החמצן מופחת), ואת צריכה להיקבע על הגדרת ניסוי בפרט. יתר על כן, בשל חוסר בזרימת הדם ואת ההשפעה האפשרית של שינויים שלאחר המוות או במקרה שיש רציונל צורך לאמת את התוצאות בנוכחות של מיקרו ללא פגע, הדמיה intravital ריאות עם חלון יניקה החזה יכול להיות מנוצל. עם זאת, Still אתגר לבצע הדמיה ריאות intravital פני ימים מרובים באמצעות חלון הדמיה כפי שבוצעה במוח, בלוטת החלב ואת אברי הבטן 5 בשל קשיים בשמירה לחץ שלילי מספיק. כטכניקה חלופית זלוף של ריאות שלמות vivo לשעבר, שיטת הריאות המבודדות-perfused שמש בעבר ללמוד גרורות ריאתי. עם זאת, שיטה זו משמשת לעתים קרובות בחיות גדולות יותר. מאז יש עכברי חללי חזה קטנים, הם מציבים אתגר אמיתי עבור זלוף היעיל 24.

בשל פיזור אור, עומק הדמיה של מיקרוסקופיה confocal ספינינג-דיסק מוגבל. כתוצאה מכך, ויזואליזציה של דינמיקת תא אינטראקציות הסלולר מוגבלת גרורות ריאה שטחיות. גרורות ריאתי מועשרים בפריפריה ריאות מאז תאים גרורתי מוגבלים על ידי נימים המפחיתים בגודל לעבר השוליים החיצוניים של הריאה 1. יתר על כן, זה eaSier לשמור על יכולת הקיום של תאים קרוב לפני השטח של הריאה כפי שהם מעדיפים גישה למדיה וחמצן. כדי לאפשר ויזואליזציה עמוק לתוך הריאות, הדמית חיה של סעיפי ריאה יכולה להתבצע. עם זאת, כמות ניכרת של מוות של תאים צריך להיות צפוי. לחלופין, מיקרוסקופיה multiphoton יכול להתנהל, המאפשר חדירה לרקמות גדולה יותר. בנוסף, הדמית multiphoton מייצרת אות אופטית פנימית, שנקראה דור שני-הרמוני (SHG), אשר מאפשרת הדמיה של מבנים שאינם centrosymmetric במטריצה ​​התאית, כגון 1 הסיבי קולגן.

כפי שניתן לראות במחקר זה, גידול והתנהגות תא חיסוני גרורות ריאה ניתן בעקבות ונותחו באמצעות עכברי כתב ניאון, תאים סרטניים מניפולציות שכותרתו fluorescently קליעים נותבים או נוגדנים. מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה לחקר תאי ודטרמיננטות אחרים במיקרו-סביבה של גרורתי. לשם כך, יש שונות trעכברי כתב ansgenic לרשותנו בעבודת תא סטרומה לרבות אלה פיברובלסטים כמו FSP1-EGFP 4, אלפא-SMA-RFP 25 ו Col1a1-EGFP 25 או בתאי האנדותל כמו Tie2-GFP 26.

מכתים תא על סעיפי ריאות חיה שבוצע לדמיין אוכלוסיות תאי חיסון 8. ניתן לאמץ אסטרטגיה מכתים זה כחלופה עבור לכידת תמונה מרובת צבעים. עם זאת, רוב הסמנים לעתים קרובות לתייג אוכלוסיות תאים מרובות במקום של אוכלוסיית תא ברור. הזרקה כי נתפסות על ידי אוכלוסיות תאים ספציפיים 4 או נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד סמנים תא נוסף שניתן להשתמש בהם כדי ליצור הבחנה נוספת בין אוכלוסיות. השימוש בצבעים ניאון שונה לתייג התאים השונים של העניין היא מועדפת עבור הדמיה. במקרים שבהם השימוש של צבעי ניאון שונה לא יכול להתבצע (למשל., בשל chann הדמיה מוגבלאלס), אפשר תאים מסוגים שונים תמונה עם אותה כתבי ניאון כל עוד הם להבחין בקלות על ידי צורה ו / או לוקליזציה אנטומי.

בנוסף ללימוד סוגי תאים שונים, כמה כיתות של כימותרפיות הם פלורסנט חלושים (כגון דוקסורוביצין). יכולות כימותרפיות אלה באופן עקרוני לשמש כדי לחזות משלוח והפצת סמים גרור ריאה באופן דומה כמו גידול ראשוני 19. הרפוי ממוקד נוספים שיכולים להיות מתויג fluorescently עשוי לשמש גם בתחום ההדמיה ריאות vivo לשעבר. יצוין, כי הנתונים רכשה עם הדמיה בריאות עשויה להיות יותר אינפורמטיבי על אילו תאים לקחת- up תרופות אלה וקשרי הגומלין שלהם עם תאים אחרים במיקרו-סביבה של גרורתי בנוסף extravasation תרופות אלה מכלי דם פעיל. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להמשיך לחקר סרטן הריאה הראשי 27 או מותאם לחקר ריאה אחרותפתולוגיות -related שעשוי להשפיע על המיקרו-סביבת ריאות 28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MMTV-PyMT/FVB mice Jackson Laboratory 2374 Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
FVB mice Jackson Laboratory 1800 Female mice
GFP+ VO-PyMT cells UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D1818 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated Invitrogen D22914 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile  Amresco INC K813-500ML Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform Will be used as dissection board
Fine scissors sharp  Fine Science Tools 14060-11
Forceps Roboz Surgical Store RS-5135
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Air UCSF
Oxygen UCSF
Carbon dioxide UCSF
1 mL syringe without needle  BD 309659
27 G x 1/2 needle   BD 305109 for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel   BD 305178
Low-melting-temperature agarose  Lonza 50111 To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red Life Technologies 11835-030
24 well Imaging plate  E&K scientific EK-42892
Glass cover slides, 15 mm  Fisher Scientific 22-031-144
Digital CO2 and temperature controller Okolab DGTCO2BX http://www.oko-lab.com
Climate chamber Okolab http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head Yokogawa Corporation CSU-10b
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Tags

רפואה גיליון 108 סרטן, ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק גרורות תאי מערכת החיסון המיקרו-סביבה במודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
<em>Ex vivo</em> הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van den Bijgaart, R. J. E., Kong,More

van den Bijgaart, R. J. E., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J. Vis. Exp. (108), e53741, doi:10.3791/53741 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter