Summary
Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.
Abstract
Metastasierung ist eine Hauptursache für krebsbedingten Morbidität und Mortalität. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess und aufgrund seiner Komplexität, die genauen zellulären und molekularen Prozesse, die metastatische Verbreitung und Wachstum sind immer noch schwer zu regieren. Echtzeit-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der dynamischen und räumlichen Wechselwirkungen von Zellen und ihrer Mikroumgebung. Soliden Tumoren metastasieren häufig in die Lunge. Jedoch stellt die anatomische Lage der Lungen eine Herausforderung für die intravital Bildgebung. Dieses Protokoll stellt eine relativ einfache und schnelle Methode zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung Stroma in Lungenmetastasen. Mit dieser Methode kann die Motilität von Krebszellen als auch Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen in ihrer Mikroumgebung für mehrere Stunden in Echtzeit visualisiert werden. transgenen fluoreszierenden Reporter-Mäuse Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Zelllinie, injizierbare fluoreszenzmarkiertenMoleküle und / oder Antikörper, mehrere Komponenten der Lunge Mikroumgebung visualisiert, wie Blutgefäße und Immunzellen werden. Um das Bild zu den verschiedenen Zelltypen, eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop, das langfristige kontinuierliche Bildgebung mit schnellen, vierfarbige Bildaufnahme ermöglicht verwendet wurde. Zeitraffer-Filme aus Bildern zusammengestellt mehrere Positionen und Brennebenen gesammelt über zeigen Wechselwirkungen zwischen Live-metastatischen und Immunzellen für mindestens 4 Stunden. Diese Technik kann weiter zu testen Chemotherapie oder gezielte Therapie verwendet werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren für die Untersuchung von anderen Lungenbezogenen Pathologien angepasst werden, dass die Lunge Mikroumgebung beeinflussen.
Protocol
Alle beschriebenen Verfahren muss mit Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung durch die lokalen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) entsprechend durchgeführt werden.
1. Erzeugung von Lungenmetastasen für Ex-Live-Imaging (Transgene oder Schwanzveneninjektion) vivo
HINWEIS: Lungenmetastasen kann durch Verwendung gentechnisch veränderter Mausmodelle oder durch intravenöse (iv) Injektion von Krebszellen erzeugt werden.
- Generieren Lungenmetastasen für die Bildgebung durch eine gentechnisch veränderte Tumormausmodell in einer transgenen Reporter Maus überqueren, zum Beispiel, über die Brustkrebs-Mausmodell, Maus-Mammatumorvirus Long Terminal Repeat-Polyoma-Mitte-T-Antigen (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP Mausmodell 12.
HINWEIS: Das drückt ACTB-ECFP Modell cyan fluoreszierende Protein (ECFP) unter der β-act verbessertin Promotors, so dass alle Zellen fluoreszieren in dem blauen, CFP-Kanal. Jedoch sind die Krebszellen mit Abstand zu den führenden und als Hauptteil ECFP-positive Zellen unter dem Mikroskop erscheinen. Der MMTV-PyMT Mausmodell entwickelt sich eine progressive Erkrankung, bei der Mammatumorwachstum mit der Verbreitung von Krebszellen an die Peripherie zugeordnet ist, insbesondere an der Lunge. In MMTV-PyMT Mäuse auf dem FVB / n Hintergrund können Mikrometastasen um 10 bis 11 Wochen alt sind zu beachten. Im Allgemeinen werden diese Fortschritte zu Makrometastasen bei etwa 14 Wochen alt 13.
ODER - Generieren experimentellen Metastasen mit Primärzellen oder syngenen Zelllinien. Verwenden in vitro manipuliert Primärtumorzellen oder Zelllinien (z. B. Transduktion), gefolgt von iv-Injektion 14.
- Ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierenden (+) MMTV-PyMT Zelllinie in fluoreszierenden Reporter-Mäuse (ACTB-ECFP) oder Wildtyp-Mäusen Kurz gesagt, in diesem Protokoll injizieren. Dann,visualisieren diese als VO-PyMT Zellen 15 bezeichnet Zellen, die grün, GFP Kanal.
HINWEIS: Die ursprüngliche VO-PyMT Zelllinie an der Vanderbilt Orthopädie in Nashville, TN abgeleitet wurde. VO steht für Vanderbilt Orthopädie. - Im Anschluss an die Injektion von 10 6 Zellen (in 200 ul), Krebszelle Extravasation sofort und bis zu ein paar Stunden nach der Injektion beobachtet; beobachten Mikrometastasen zwischen 1-3 Wochen nach der Injektion und erkennen Makrometastasen 3 Wochen nach der Injektion 15.
HINWEIS: Weniger Zellen injiziert werden, die Zeit von der Injektion bis Metastasenwachstum zu verlängern.
- Ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierenden (+) MMTV-PyMT Zelllinie in fluoreszierenden Reporter-Mäuse (ACTB-ECFP) oder Wildtyp-Mäusen Kurz gesagt, in diesem Protokoll injizieren. Dann,visualisieren diese als VO-PyMT Zellen 15 bezeichnet Zellen, die grün, GFP Kanal.
2. Markierung von interessierenden Komponenten in dem metastatischen Mikromilieu (Transgene und / oder Injektionspräparate)
HINWEIS: Labeling kann durch transgenen Mäusen und / oder durch verschiedene Injektionen erreicht werden. Stellen Sie sicher, verschiedenen fluoreszierenden Farben für die Markierung von verschiedenen Zelltypen zu verwenden.
- Label-Komponenten des metastatischen Mikroumgebung unter Verwendung von transgenen Mäusen. Überqueren den zuvor genannten Maustumormodell (z. B. MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in ein transgenes Mausmodell, in dem die stromalen Zellen von Interesse durch ein fluoreszierendes Protein markiert sind, die nicht ECFP ist, z. B., c-fms-EGFP 4,16.
HINWEIS: Zusätzlich zu Visualisierung von Krebszellen in der GFP-Kanal ermöglicht diese Visualisierung von myeloischen Zellen in der GFP-Kanal 4.
UND / ODER - Beschriften verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung mit Injektionen in transgene Mäuse oder fluoreszierenden Reporter (nicht fluoreszierenden) Wildtyp-Mäusen.
HINWEIS: Mehrere Verbindungen können verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung, beispielsweise ein AF647-konjugierten Gr-1-Antikörper wird verwendet, hier zu beschriften Neutrophilen und Monozyten einige 13 und unterschiedlichem Molekulargewicht Dextrane zu beschriften werden injiziert werden verwendet,Lungenkapillaren zu kennzeichnen. Für die Herstellung dieser injizierbaren siehe Schritt 4.
3. Herstellung von Materialien vor Dissection
- 2% Agarose
- Wiegen 0,2 g Agarose und in den 10 ml 1 x PBS. Die Lösung wird die Agarose zu lösen. Agarose wird bei RT verfestigen, so halten sie in einem 37 ° C Wasserbad, bis die Inflation eingesetzt.
- CO 2 und Temperaturregler
- Prüfen ddH 2 O in die Befeuchtungskammer. Füllen Sie, wenn nötig. Legen Konfiguration Platte in Temperaturstufe Plattenhalter (Klimakammer). Schalten Sie den CO 2-Controller und setzen CO 2 bei 5%. Sicherstellen, dass die Luftdurchsatz bei 0,4 Nl / min eingestellt ist.
- Öffnen Sie die Luft und CO 2 Ventile. Schalten Sie den Temperaturregler. Sicherstellen, dass die Temperatur der Klimakammer und der Deckel auf 37 ° C eingestellt sind.
- Lassen Sie Luftdruck auf die CO 2 Meter. Prüfen CO 2 zu erhöhen, equilibration kann bis zu 30 Minuten dauern.
- Spinning Disk Konfokalmikroskop
HINWEIS: Details des Mikroskops Set-up vorher 4,17 beschrieben wurden.- Schalten Sie den Laser (Argon-Laser für 488 nm Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser). Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera, den Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, die Laser-Steuereinheit und der Kamerasteuerung.
- Öffnen Sie das Mikroskop Verschluss, schalten Sie den Computer das Mikroskop ausgeführt und die Software öffnen.
- Herstellung der Werkzeuge und Dissektion Plattform.
- Schalten Sie das heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es 250 ° C erreichen. Saubere zwei Paare von chirurgische Scheren und Pinzetten mit Wasser und Seife. Sterilisieren Sie die Tools für mindestens 30 Sekunden. Lassen Sie die Werkzeuge abzukühlen. Verwenden Sie einen Polystyrol Deckel als Dissektion Plattform. Decken Sie sie mit einem Stück Labor Soaker.
4. Herstellung von Injektionen
HINWEIS: In Abhängigkeit von der Halbwertszeit und die bevorzugte Reaktion, spritzen fluoreszenzmarkierten Antikörpern und / oder fluoreszierende Moleküle entweder unmittelbar vor der Tieropfer oder ein paar Stunden bis Tage vor.
- Um das Bild zu Gr1-positive Neutrophile und Monozyten, eine Spritze mit 7 ul Lager AF647-konjugierte Gr-1-Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul sterilem PBS unter der Haube vorzubereiten. Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf die Spritze.
- Um die Bild Lungenkapillaren, bereiten eine zweite und dritte Spritze mit 100 ul von entweder 70 kD Rhodamin-konjugiertem Dextran (4 mg / ml) oder 10 kD AF647-konjugiertem Dextran (4 mg / ml). Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf den Spritzen.
- Spritzen Sie die AF647-konjugierte Antikörperlösung iv 5 Stunden vor der Lunge 'Exzision.
- Einspritzen eines oder beider Dextranlösungen iv unmittelbar vor der Lunge 'Exzision.
5. Herstellung von Lungen für Ex-vivo-Live-Imaging
HINWEIS: Versuchen Sie, so steril und vorsichtig wie möglich zu arbeiten, um unnötige Herausforderungen der Immunzellen in der Lunge zu vermeiden.
- Spritzen Sie die Maus intraperitoneale (ip) mit einer tödlichen Überdosis eines Narkosemittels durch das Tier Protokoll von IACUC genehmigt erlaubt, z. B. 1 ml 2,5% Avertin. Warten, bis die Maus Atem anzuhalten und vollständig nicht mehr reagiert auf Schmerzreize (Hinterpfote Prise) sein.
HINWEIS: Genickbruch und Euthanasie Kohlendioxid sollte, wie es nachteilig Lungenzelllebensfähigkeit beeinflussen vermieden werden können. - Immobilisieren die Maus auf einer Dissektion Bord und sterilisieren Sie die Maus mit 70% Ethanol.
- Verwenden chirurgische Scheren, zunächst einen quer im Oberbauch Schnitt durch die Haut zu machen, um einen ähnlichen Schnitt durch die Bauchfell gefolgt. Halten Sie die Dissektion Bord in einer vertikalen Position und schneiden Sie den absteigenden Aorta, so dass die Blutbäder nach unten in den Bauch und nicht in der Brusthöhle.
- Sersticken eine kleine Öffnung in der Membran Vakuum freizugeben. Schneiden Sie entlang der 10. und 12. Rippe mit der Membran herauszuschneiden und visuellen Zugriff auf die Lunge gelangen.
- Verwenden chirurgische Schere, um die Haut zu schneiden bis zur Luftröhre über den Brustkorb, aber lassen Sie den Brustkorb erhalten. Trennen Sie die Haut vor dem Brustkorb. Setzen Sie die Luftröhre durch das umgebende Bindegewebe zu entfernen, man aufpassen, nicht die Luftröhre selbst (1A) zu beschädigen.
- Snip eine kleine Öffnung in etwa 1 mm im Durchmesser in dem freigelegten Luftröhre parallel zu den Knorpelringe, so nahe wie möglich dem Kehlkopf (1B). Achten Sie darauf, nicht vollständig durch die Luftröhre zu schneiden.
- Nehmen Sie eine 20 G-Nadel und legen Sie die Nadel langsam 4-5 mm in die Luftröhre ohne Gegenkraft (1D). Das Ende der Nadel wird durch die Luftröhre (1C) sichtbar. Verwenden einer Pinzette die Nadel in die Luftröhre zu stabilisieren. Alternativ kann ein Nahtmaterial gebunden around die Luftröhre, die Nadel in Position zu halten.
HINWEIS: zu tief Einsetzen der carina traumatisiert werden können oder nur eine Seite der Lunge könnte aufgeblasen werden. - Füllen einer Spritze mit 400 ul von 37 ° C 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur (direkt von einem Bad mit konstanter Temperatur entnommen). Achten Sie darauf, das Sezieren Board steht und vermitteln langsam die warme Agarose durch die Nadel in die Lunge, verwenden Sie ~ 400 & mgr; l in die Lungen aufzublasen.
Hinweis: Sehen Sie sich die Lunge in den Brustkorb Aufblasen. Nicht über-Aufblasen der Lunge, wie es reißt. - Sobald die Lunge aufgeblasen sind, füllen ~ ⅔ des Brustkorbs, die Spritze zu lösen und die Nadel in der Luftröhre halten zu einem Agarose nicht auslaufen.
- Gießen ca. 50 ml 20 ° C PBS in den aufgeblasenen Lungen die Agarose in der Lunge zu ermöglichen, festzulegen und zu verfestigen. Die Nadel langsam entfernt und die Luftröhre mit einer Pinzette schließen Agarose jede nichtverfestigten nicht auslaufen. </ Li>
- Expose der Lunge durch eine Sternotomie durchführen und herauszuschneiden anschließend in die Lunge. Zum Herausschneiden der Lunge, halten, um die Luftröhre, während vollständig durch die Luftröhre zu schneiden. Ziehen Sie die Luftröhre auf, das Bindegewebe und Speiseröhre beim Ziehen die Lunge aus dem Brustraum weggeschnitten, bis die Lungen von der Maus (1E) getrennt ist.
- Tauchen Sie in die Lunge in warmem RPMI-1640 übermäßiger Blut abzuwaschen und trennen Sie vorsichtig die Lappen von Schere und Pinzette die Lappen "Hauptstamm Bronchien bei Nabel (1F) zu schneiden.
- Legen Sie die Lappen, mit der flachen Oberfläche nach unten Abbildungsfläche zu maximieren, in eine Vertiefung einer 24-Well-Bildplatte (1G). Füge 100 & mgr; l von 37 ° C RPMI-1640 auf der Oberseite der Lappen. Legen Sie mehrere 15 mm Kreis Mikroskop Abdeckung gleitet oben auf den Lappen, damit sie nicht schwimmen.
- Gießen warmen PBS in die umgebenden Vertiefungen die RPMI-1640-Medium aus evap zu verhindernOrating. Legen Sie die 24-Well-Platte in der Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht und unterhält die Lungenlappen bei 37 ° C mit Luft und 5% CO 2. Legen Sie die Klimakammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops.
Hinweis: andere Gasgemische (beispielsweise 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 Zellverhalten unter Bedingungen von Hypoxie / niedrigeren Sauerstoff zu untersuchen) ebenfalls berücksichtigt werden.
Abbildung 1. Das Protokoll für die Vorbereitung der Lunge für die Live-Darstellung. (A) Die Exposition der Luftröhre nach der Herstellung der Maus. (B) kleine Schnipsel aus in die freiliegende Luftröhre parallel zu den Knorpelringe. (C) 20 G Nadel eingeführt 4-5 mm in die Luftröhre. (D) Instillation von 400 ul 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur in die Lunge. (E) Inflated Lungen von der Maus getrennt. (F) Lobes nach dem Aufblasen getrennt. (G) Keulen in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen Bildgebung gestellt. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Akquisition und Analyse der Bilder
HINWEIS: Die Bilder können durch verschiedene Softwareprogramme unterstützt mit einer Vielzahl von Spinnplatten konfokalen Mikroskopen erworben werden. In diesem Protokoll entweder μManager mit einem maßgeschneiderten drehende Scheibe konfokalen Mikroskop oder Zen mit einem handelsüblichen Konfokalmikroskop drehende Scheibe ist für die Bildaufnahme verwendet, während Imaris für die Filmbearbeitung und Analyse verwendet wird.
- Erwerben Sie Bilder mit μManager. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Erfassung von Bildern μManager Software zuvor 18 beschrieben.
ODER - erwerben Sie BilderVerwendung von Bildanalysesoftware wie Zen (siehe Abbildung S1).
- Klicken Sie auf "Suchen" Registerkarte und wählen Ziel (10x oder 20x) in der "Light Path 'Werkzeug (Abbildung S1A, roter Kasten). Anschließend klicken Sie auf 'Eyes - DAPI "bei der GFP-Kanal durch das Okular schauen (Abbildung S1A, blauer Kasten). Lokalisieren Sie die Probe manuell das Mikroskop. Klicken Sie auf "Alle Off'after das Gewebe Mitte des Sichtfeldes ist.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Übernahme" für die Bildaufnahme alle Parameter einzustellen.
- In der Werkzeug 'Channels', klicken Sie auf die Schaltfläche "+" (Abbildung S1B, roter Kasten). Ein Pop-up-Menü erscheint und für den Farbstoff (en), die in der Probe in der 'Dye Datenbank' (Abbildung S1B) suchen. Wählen Sie den Farbstoff und klicken Sie auf "Hinzufügen".
HINWEIS: Das Programm wird eingestellt Alle Filter optimiert werden. Ein Farbstoff kann gelöscht werdenindem Sie sie anschließend das Papierkorbsymbol (Abbildung S1B, gelber Kasten) klicken. - Im Menü "Erfassungsmodus" gesetzt "Binning" zu 5x5. Klicken Sie doppelt auf ECFP in der Kanäle-Menü, um es auszuwählen. Senken Sie die Laserleistung auf 20%, so dass die Probe wird beim Einrichten der Parameter für die Bildaufnahme nicht gebleicht werden.
- Aktivieren Sie das Feld "Fliesen" in der "Experiment-Manager 'Abschnitt und die Fliesen Werkzeug erscheint in der" Mehrdimensionale Bildaufnahme' Werkzeuggruppe (Abbildung S1C). Klicken Sie auf "Erweiterte Einstellungen", um das Live-Bild der Kamera zu sehen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" im Bereich "Position" 4 bis 6 Positionen auf das Experiment hinzuzufügen. Um eine Position zu löschen, wählen Sie diese Position, und klicken Sie auf das Papierkorb-Taste.
- In der Werkzeuggruppe "Erwerb Parameter ', öffnen Sie das Werkzeug" Fokus-Strategie ", und wählen Sie" Absolute Fest Z-Position "aus der Dropdown-Liste.
- Schauen Sie sich die Z-Stapel-Box in der 'Experiment-Manager' Abschnitt und dem Z-Stapel-Tool erscheint in der "Mehrdimensionale Bildaufnahme 'Werkzeuggruppe (Abbildung S1D). Klicken Sie doppelt auf eine der Positionen in der "Position" Abschnitt und drücken Sie "Live". manuell einstellen ersten und letzten Position des Abbildungsfeldes gesetzt. Legen Sie das Intervall auf 4 um.
Hinweis: Das Programm wird die Anzahl der Scheiben für den gewählten Bereich und Intervall bestimmen. Im Idealfall sind 5-7 Scheiben praktisch ausreichende Visualisierung und schnelle Bildaufnahme zu ermöglichen. - Überprüfen Sie das Feld "Time Series" in der "Experiment-Manager-Seite. Den gewünschten "Laufzeit" und "Interval" mal in der "Time Series" Tool, das in der "Mehrdimensionale Bildaufnahme 'Werkzeuggruppe (Abbildung S1E) erschien.
- In der "Erwerbtion-Modus 'Menü einstellen "Binning" zu 2x2. Klicken Sie doppelt auf einem Fluorophor in den Kanälen Menü, um es auszuwählen und die Laserleistung auf 100% erhöhen. Drücken Sie "Live" und stellen Sie die "Belichtungszeit". Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluorophor.
- Überprüfen Sie die "Enable Auto Save" ein. Wählen Sie einen Ordner und geben Sie den Namen der Datei ein. Alle aufgenommenen Bilder automatisch in diesem Ordner gespeichert werden.
- Klicken Sie auf "Start Experiment 'im Abschnitt' Experiment-Manager" Bildaufnahme zu starten.
- Nach der Bildaufnahme, die Rohdaten in Imaris Software kompilieren. Konvertieren von Bildern in .IMS Dateien und Anpassungen vorgenommen werden können. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Konvertierung von Dateien, so dass Anpassungen und Speichern von Filmen Imaris verwendet, ist zuvor beschrieben 18.
- Wenn Sie den Film zu speichern, setzen Sie die "Frame Rate" zu 5 Bilder pro Sekunde (fps).
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Representative Results
Mit Spinnen-Scheibe konfokalen Mikroskopie, verschiedene Mausmodellsystemen und Injektionen kann der metastatischen Mikroumgebung sichtbar gemacht und im Laufe der Zeit verfolgt werden. Mit Hilfe eines MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP dreifach transgenen Mausmodell, verschiedenen zellulären Komponenten werden fluoreszenzmarkierten (2A, Film 1). Die typische Struktur des Lungenparenchym kann in der GFP-Kanal sichtbar gemacht werden, da alle Zellen unter der β-Actin-Promotors exprimieren ECFP. Größere / vielzelligen Lungenmetastasen leicht gelöst werden, da diese als Masse der Zellen innerhalb der organisierten Lungenstruktur angezeigt. Myeloischen Zellen werden in der GFP Kanal durch c-fms visualisiert -EGFP Ausdruck, der das Transgen für CSFR-1 ist 12. Myeloischen Zellen sind sehr dynamisch, da sie während des Abbildungsfeldes migrieren. C-fms -EGFP-positive Zellen reichlicher und Migrations in Lungenparenchym sind in engem Kontakt mit der Lunge im Vergleich zu denenMetastasierung. Die Dynamik der myeloischen Zellen und ihre Wechselwirkungen mit Lungenmetastasen kann in Echtzeit über mehrere Stunden eingehalten werden.
Um zu untersuchen, wird metastasierendem Aussaat und Wachstum, eine experimentelle Metastasierung Modell (2B, Movie 2). Die GFP + VO-PyMT Tumorzellen wurden in ein Wildtyp, nicht-Reporter Maus injiziert und man ließ sie für 2 Wochen Saatgut und zu wachsen. Die Struktur der Lunge ist deutlich sichtbar in der GFP-Kanal durch Autofluoreszenz der Lunge. Jedoch sind die VO-PyMT Zellen immer noch leicht von der Lungenstruktur, da sie eine runde Form und eine höhere EGFP Expressions so heller erscheinen, verglichen mit dem Lungenparenchym haben. VO-PyMT zellulären Beweglichkeit innerhalb des etablierten metastatischen Läsion beobachtet werden.
Zellulären Interaktionen zwischen metastasierten und Immunzellen in der Lunge Mikroumgebung kann auch mit Hilfe der experimentellen Metastasierung Modell untersucht werden. Zwei Wochen nachInjektion von VO-PyMT Zellen fluoreszierend markierten Gr-1 647 konjugierten Antikörper sind iv 5 h vor der Lunge Exzision (2C, Movie 3) injiziert. Auf der linken Seite des Abbildungsfeldes, zwei Gr-1 + myeloiden Zellen interagieren mit einer VO-PyMT Zelle. Eine metastatische Läsion ist auf der rechten Seite des Abbildungsfeldes beobachtet. Im Laufe der Zeit, Gr-1 + Zellen werden dem metastatischen Läsion rekrutiert. Unterhalb der metastatischen Läsion, einer der Gr-1 + Zellen in enger Wechselwirkung mit einem PyMT-VO Zelle. Schließlich löst die VO-PyMT Zelle, von der + Zelle Gr-1 löst.
Immunzellen Kennzeichnung transgenen Mausmodellen mit der experimentellen Metastasen-Modell und injizierbare Antikörpern führt zu einem Drei-Farben-Film Reporter kombiniert wird. Eine Woche nach der Injektion von VO-PyMT Zellen in eine ACTB-ECFP Reporter Maus, fluoreszenzmarkierten Gr-1 647 konjugierten Antikörper sind iv 5 Stunden vor der Gewebeentnahme injiziert (2D, Film4). Gr-1 + Zellen wandern kräftig innerhalb des Sichtfeldes, während ein einzelner GFP + metastatischen Zellen in der Mitte des Abbildungsfeldes sichtbar ist.
Injizieren verschiedenen fluoreszierenden Dextrane in Reporter-Mäuse, die mit metastatischen Zellen zuvor injiziert wurden, kann ein Vier-Farben-Film (2E, Filme 5-6) ergeben. Frühe Ereignisse in der Aussaat von Metastasen untersucht werden, wenn VO-PyMT Zellen sichtbar gemacht werden sofort und 4 Stunden nach iv Injektion in ACTB-ECFP Reporter Mäusen. Die Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD und 10 kD Dextran Dextran an eine fluoreszierende Markierung konjugiert ist 647 ermöglicht die Visualisierung von Lungenkapillaren. Die Verwendung von niedrigeren und höheren Molekulargewicht Dextrane könnte möglicherweise Änderungen genutzt werden in der Permeabilität der Kapillaren in der Lunge zu erkennen, da die niedermolekularen Molekülen extravasieren schneller im Vergleich zu den hochmolekularen diejenigen 19. Obwohl Cellul ar Ereignisse können immer noch effektiv untersucht werden, Film 5 ist ein Beispiel für ein Gewebe Drift. Falls erforderlich und in dem Fall kann das Gewebe während der Bildgebungssitzung neu positioniert werden, kann dies während des POST Bild korrigiert werden Erfassung analysiert.
Dieses System ermöglicht eine schnelle, Vierfarbenerfassung kontinuierlichen Bild unterschiedlichen fluoreszierend markierten Zelltypen innerhalb der Lunge Metastasen Mikroumgebung zu folgen. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Darstellung von Metastasen verschiedener Größen von Ereignissen zum Animpfen einzelner Krebszellen etablierten Metastasen im Zusammenhang. Außerdem Bewegung Tumorzellen und Stromazellen können zusammen mit Blutgefäßen in der Lunge Mikroumgebung visualisiert werden. Typischerweise kann zelluläre Bewegung für mindestens 4 Stunden vom Beginn der Bildgebungssitzung zu beobachten. Die Beobachtung von verschiedenen metastatischen Mikroumgebungen innerhalb der gleichen Lungengewebe hilft Maus-zu-Maus-Variabilität zu vermeiden.
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Abbildung 2. Repräsentative Bilder aus Filmen von Echtzeit-Bildgebung erworben. (A) Schnappschuss eines fusionierten Z-Stack von Film 1 myeloischen Zellen, die mit einer Lungenmetastasen (gelb-Einlage) im Vergleich zu denen, die mit dem Lungenparenchym (rot Einsatz) zeigt. (B) Schnappschuss eines fusionierten Z-Stack aus Film 2 zeigt GFP + metastatischen Zellen in einem experimentellen Metastasen-Modell. Pfeilspitze zeigt auf eine bewegliche metastatischen Zelle. (C) Snapshot einer Z Stapel von Film 3 zeigt Kolokalisation von Fluoreszenzsignalen von einer GFP + Metastasierung und Gr-1 + durch eine Gr-1-Antikörpers an einen 647-Tag konjugiert visualisiert Zellen (rote Pfeilspitze). Grün Pfeilspitze zeigt auf eine GFP + metastatische Zelle, die von der metastatischen Masse verdrängt. Weiße Pfeilspitze zeigt auf eine Gr-1 + Zellen, die mit dem beweglichen GFP + VO-PyMT Zelle interagiert. (D) Schnappschusseine fusionierte Z-Stack von Film 4 GFP + VO-PyMT Zellen zeigt, in ACTB-ECFP Maus. Eine einzelne VO-PyMT Zelle ist sichtbar in der Mitte (grün Pfeilspitze). Das Tier wurde mit Gr-1 647 konjugierte Antikörper injiziert. (E) repräsentative Z-Stapel der Filme 5 und 6 die Blutgefäße in der Lunge von Mäusen zeigt, das unmittelbar nach der Injektion von 70 kD Rhodamin-Dextran (rote Pfeilspitze) zusammen mit den GFP + VO-PyMT Zellen (grün). Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1. Screenshots von ZEN-Kamera-Software für die Erfassung von Bildern. (A) zunächst in der "Light Path 'Werkzeug das richtige Ziel (rotes Feld) und th gewählt werden sollte,e Gewebe im Mikroskop lokalisiert werden. (B) Konfigurieren Kanäle für die Bilderfassung, in die kann 'Channels' Werkzeug Kanäle gelöscht (rotes Feld) werden oder hinzugefügt (gelber Kasten). (C) In der "Fliesen" Werkzeug können verschiedene Positionen des Experiments zugegeben werden. (D) In der "Z-Stack 'Tool können die Z-Stapel gesetzt werden und die Dicke der Scheiben kann eingestellt werden. (E) in der "Time Series" -Tool, die Dauer und Intervall eingestellt werden. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. (Rechtsklick zum Herunterladen). Wechselwirkungen zwischen einer Lungenmetastasen und sur. unter Verwendung von Immunzellen transgener Mäuse Reporter Rundungs Dieser Film zeigt eine Metastase in der Lunge von einer Dreifach-transgenen MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Maus in dem alle Zellen mit ECFP und myeloide Zellen markiert sind, mit EGFP markiert. Die Metastasierung kann als ein Großteil der Zellen in blau im Gegensatz zu der normalen Lungenarchitektur zu beachten. C-fms + myeloiden Zellen im gesamten Bildfeld wandern. Dieser Film ist ein 2 Std 1 Min Akquisition.
Film 2 (Recht auf Download klicken). Krebszellbeweglichkeit in einem experimentellen Metastasen-Modell. Dieser Film zeigt eine Lunge nach intravenöser Injektion von GFP + VO-PyMT (grün) Zellen in ein Wildtyp, nicht-Reporter, Maus erzeugt Metastasierung. Lungen wurden zwei Wochen nach Injektion von VO geerntet-PyMT Zellen. GFP + Zellen innerhalb des metastasierten Masse bewegen. Dieser Film ist ein 4 h 40 min lang Akquisition.
Film 3 (rechts zum Download anklicken). Die Rekrutierung von Immun visualisiert Zellen durch fluoreszenz konjugierte Antikörper zur Metastasierung experimentell ermittelt. Dieser Film zeigt eine Lungenmetastasen, die durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in einem Wildtyp, nicht Reporter, Maus. Die Lungen wurden zwei Wochen nach der VO-PyMT Zellen geerntet injiziert. Gr-1 + Zellen werden mit Gr-1 647 konjugierter Antikörper und beobachtet im nahen Infrarotkanal (white) markiert. Beachten Sie, dass Gr-1-Zellen mit dem GFP + Metastasen rekrutiert werden. Dieser Film ist ein Beispiel für eine Langzeiterfassung, insgesamt 11 h 27 min.
Film 4. (rechts zum Download anklicken). Motilität von Immun visualisiert Zellen durch fluoreszenz konjugierte Antikörper in einer transgenen Reporter Maus mit metastatischen Zellen injiziert. Dieser Film zeigt eine einzelne GFP + VO-PyMT Zelle in der Lunge, die durch iv Injektion von VO- PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus. Die Lungen wurden eine Woche nach der VO-PyMT Zellen injiziert wurden geerntet. Gr-1 + Zellen werden mit Gr-1 647 konjugierter Antikörper und beobachtet im nahen Infrarotkanal (white) markiert. Dieser Film ist ein 2 h 40 min lang Akquisition.
Film 5. (rechts klickenk zum Download). metastatischen Zellen und Kapillaren visualisiert durch Fluoreszenz Dextrane unmittelbar nach iv Injektion in einer transgenen Reporter Maus. Dieser Film zeigt experimentelle Metastasierung, die durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus zusammen mit der Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD Dextran (rot) und 10 kD Dextran mit einem Fluoreszenz-Tag 647 (weiß) konjugiert ist, Blutgefäße zu markieren. Dieser Film ist ein Beispiel für ein Gewebe Drift und ist eine 18 min lange Akquisition.
Film 6. (Rechtsklick zum Herunterladen). Metastatischen Zellen und Kapillaren von fluoreszierenden Dextrane mehrere Stunden nach iv visualisiert Injektion in einer transgenen Reporter Maus. Dieser Film zeigt experimentelle Metastasierung erzeugend durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus zusammen mit der Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD Dextran (rot) und 10 kD Dextran zu einer 647 fluoreszierende Markierung konjugiert (weiß), zu markieren Blutgefäße. Lungen wurden 4 Stunden nach der Injektion der VO-PyMT Zellen abgerufen. Dieser Film ist eine 19 min lange Akquisition.
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung von Lungenmetastasen in Maus-Modellen der Metastasierung. Diese Bildgebungsprotokoll stellt eine direkte Visualisierung der Dynamik und räumliche Tumorzell-Stroma-Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung. Es ist eine relativ einfache und schnelle Methode, die für mindestens 4 h zuverlässige Abbildung von Lungenmetastasen ermöglicht. Filme aus diesen Experimenten erworben kann verwendet werden, um dynamische Prozesse wie Zellbeweglichkeit und zellulären Interaktionen zu verfolgen.
Zwei Verfahren zur Erzeugung von Lungenmetastasen wurden beschrieben: eine gentechnisch veränderte Maus-Modell und die Verwendung eines manipulierten Zelllinie. Der MMTV-PyMT Mausmodell rekapituliert Brustkrebs Progression und spontanen Lungenmetastasen. Andere Techniken, die Metastasierung rekapitulieren stehen ebenfalls zur Verfügung, z. B. orthotope Transplantation von Zellen in der Brustdrüse 20. Eine intravenös injiziert VO-PyMT cell Linie dient Metastasierung nachzuahmen Säen und Auswuchs von Brustkrebs. Die Zeitvorgabe für VO-PyMT Zellauswuchs ist abhängig von der experimentellen Vorliebe für die Bühne von Lungenmetastasen. Abhängig von der Anzahl der injizierten Zellen, können Mikrometastasen innerhalb von einigen Tagen bis 2 Wochen nach der VO-PyMT Zellinjektion zu beachten.
Für eine optimale Bildgebung der Lunge muss große Sorgfalt beim Aufblasen der Lunge entnommen werden. Für die richtige Inflation sollte die Nadel nur 4-5 mm in die Luftröhre eingeführt werden. Tiefer Einführen der Nadel kann in Teil, einseitige Aufblasen der Lunge führen. Darüber hinaus sollte die Lunge während der eigentlichen Inflation zu verhindern, dass über-Inflation, die sich ergeben können Gewebeschäden beobachtet werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Lunge so steril wie möglich zu halten, so dass die Immunzellen in der Lunge wird nicht in Frage gestellt werden.
Für jede Echtzeit-Bildgebung Experiment, die optimale Balance zwischen der Menge an Datenerfassung und the Potential von Gewebe durch zu hohe Laserbelichtung verursacht werden muss berücksichtigt werden. Es ist wichtig, die Einstellungen für die Bildaufnahme zu optimieren, indem Pilotversuche laufen. Außerdem empfiehlt es sich, die Laserleistung zu halten, während für eine optimale Sichtfeldern gesucht und / oder den Verschluss zu halten, wenn die Bilder nicht erworben.
Die Beweglichkeit der Krebs und / oder Immunzellen in der Umgebung ist einer der Indikatoren für die Vitalität der Zellen. Motilität ist empfindlich gegenüber Temperatur, Sauerstoffgehalt, und Phototoxizität 7. Jedoch kann nicht die Hemmung oder das Fehlen von Motilität Abbildungsbedingungen oder technische Probleme in Beziehung gesetzt werden, sondern biologisch. Hemmung der Beweglichkeit kann aus einer bestimmten therapeutischen Wirkung führen oder von der Verhaftung von metastatischen Zellen unmittelbar vor deren Proliferation in der Mikrovaskulatur der Lunge und ihre Extravasation in das Lungenparenchym 21,22. Es kann daher wichtig sein, solche Daten zu untermauern mit zusätzlichenTechniken (wie Migrationsassays in 2D Kultur) 23.
Darüber hinaus ist diese ex vivo Bildgebung der Lunge Methode ist ausreichend für eine Kurzzeitstudie, die nicht Lungenmikrozirkulation erfordert. Mit dieser Methode Bewegung von Krebs und / oder Immunzellen ist für mindestens 4 h beobachtet. Vor der Bildaufnahme, dauert es etwa 30 Minuten in die Lunge und 30-60 Minuten zu bereiten Positionen für den Erwerb zu finden. Obwohl der Zellbeweglichkeit über 4 Stunden beobachtet wird (bis zu 11 h, Movie 3) hängt längeren Bildgebung auf den jeweiligen Zelltypen untersucht, die verwendeten Bedingungen (z. B. reduzierte Sauerstoff) und sollte für einen bestimmten Versuchsaufbau bestimmt werden. Außerdem ist es aufgrund des Fehlens der Mikrozirkulation und die möglichen Auswirkungen von postmortalen Veränderungen oder, falls es ein Grund für die Notwendigkeit besteht, die Ergebnisse in der Anwesenheit eines intakten Mikrozirkulation, der Lunge Intravital Bildgebung mit einem Brust Ansaugfenster zu verifizieren, verwendet werden. Es ist jedoch still eine Herausforderung intravital Bildgebung der Lunge über mehrere Tage durchzuführen, ein bildgebendes Fenster unter Verwendung der in Gehirn, Brustdrüse und Bauchorgane 5 aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung ausreichender Unterdruck durchgeführt. Als ein alternatives Verfahren für die Perfusion von intakten ex vivo Lunge, der isoliert perfundierten Lunge Methode wurde bisher verwendeten Lungenmetastasen zu untersuchen. Jedoch wird dieses Verfahren oft für größere Tiere verwendet. Da Mäuse kleiner Brusthöhle haben, stellen sie eine echte Herausforderung für eine effektive Durchblutung 24.
Aufgrund der Lichtstreuung, die Abbildungstiefe der Spinnplatten konfokalen Mikroskopie ist begrenzt. Infolgedessen Visualisierung von Zelldynamik und zelluläre Wechselwirkungen an oberflächlichen Lungenmetastasen beschränkt. Lungenmetastasen in der Lungenperipherie angereichert da metastatischen Zellen von den Kapillaren eingeschlossen sind, die 1 in der Größe zu den äußeren Rändern der Lunge zu verringern. Darüber hinaus ist es easier die Lebensfähigkeit der Zellen näher Oberfläche der Lunge zu erhalten, da sie Zugang zu Medien und Sauerstoff bevorzugt sind. Damit tiefer Visualisierung in die Lunge, kann die Live-Darstellung von Lungenschnitten durchgeführt werden. Allerdings sollte beträchtliche Menge an Zelltod zu erwarten. Alternativ können Multiphotonen-Mikroskopie werden größere Gewebepenetration durchgeführt, so dass. Zusätzlich erzeugt Multi Abbilden eines intrinsischen optischen Signals, genannt Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG), die die Visualisierung von nicht-zentrosymmetrischen Strukturen in der extrazellulären Matrix, wie Kollagen 1 Fasern ermöglicht.
Wie in dieser Studie gezeigt, können Tumor und Immunzellverhalten in Lungenmetastasen folgen und analysiert fluoreszierenden Reporter Mäusen manipuliert Tumorzellen und fluoreszenzmarkierte Tracer oder Antikörpern. Diese Methode kann für die Untersuchung von anderen Zellen und Faktoren innerhalb des metastatischen Mikroumgebung modifiziert werden. Zu diesem Zweck gibt es verschiedene transgenic Reporter Mäusen für Stromazellen Studie unter anderem für Fibroblasten als FSP1-EGFP 4, alpha-SMA-RFP 25 und COL1A1-EGFP 25 oder Endothelzellen als Tie2-GFP 26.
Zellfärbung von lebenden Lungenschnitten durchgeführt worden Populationen von Immunzellen 8 zu visualisieren. Diese Färbung Strategie kann für den Mehrfarbenbildaufnahme als Alternative angenommen werden. Jedoch Mehrzahl von Markern beschriften oft mehrere Zellpopulationen anstelle eines gesonderten Zellpopulation. Injektionspräparate, die von spezifischen Zellpopulationen 4 oder fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen zusätzliche Zellmarker aufgenommen werden, können verwendet werden, um zwischen Populationen zu unterscheiden. Die Verwendung von verschiedenen fluoreszierenden Farben die verschiedenen Zellen von Interesse zu kennzeichnen ist für die Bildgebung bevorzugt. In Fällen, in denen die Verwendung von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen nicht durchgeführt werden kann (z. B. aufgrund der begrenzten Abbildungs channels), ist es möglich, Bild verschiedenen Zelltypen mit der gleichen fluoreszierenden Reportern, solange sie durch Form und / oder anatomischen Lokalisation leicht unterscheidbar sind.
Zusätzlich zu den verschiedenen Zelltypen zu studieren, sind mehrere Klassen von Chemotherapeutika schwach fluoreszierend (wie beispielsweise Doxorubicin). Diese Chemotherapeutika kann im Prinzip verwendet werden, um Arzneistoffabgabe und die Verteilung in Lungenmetastasen in ähnlicher Weise wie in Primärtumor 19 visualisieren. Andere zielgerichtete Therapeutika, die auch in Ex-vivo-Bildgebung der Lunge verwendet werden fluoreszenzmarkierte werden konnte. Bemerkenswert ist, könnten die Daten mit der Lungenbildgebung erworben sein informativer, über die Zellen, die diese Medikamente und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellen innerhalb des metastasierten Mikroumgebung zusätzlich zu den Austritt von dieser Therapeutika aus dem aktiven Blutgefäße Aufnahme. Diese Technik kann weiter für die Untersuchung von primären Lungenkrebs 27 oder für die Untersuchung von anderen Lungen angepasst werdenbezogene Pathologien, die die Lunge Mikroumgebung 28,29 beeinflussen können.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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