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Medicine

पूर्व फेफड़े मेटास्टेसिस और उनके microenvironment के लाइव इमेजिंग विवो

Published: February 3, 2016 doi: 10.3791/53741
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम फेफड़े मेटास्टेसिस के भीतर ट्यूमर सेल स्ट्रोमा बातचीत की पूर्व vivo रहते इमेजिंग के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि का वर्णन है, चूहों में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग। कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, इस तकनीक को कम से कम 4 घंटे के लिए जीवित कोशिकाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है और अन्य भड़काऊ फेफड़ों की स्थिति का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित रुग्णता और मृत्यु दर के लिए एक प्रमुख कारण है। मेटास्टेसिस एक multistep प्रक्रिया है और इसकी जटिलता की वजह से, सटीक सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं है कि मेटास्टेटिक प्रसार और विकास पर शासन अभी भी मायावी हैं। लाइव इमेजिंग कोशिकाओं और उनके microenvironment के गतिशील और स्थानिक बातचीत के दृश्य की अनुमति देता। ठोस ट्यूमर आमतौर पर फेफड़ों के लिए metastasize। हालांकि, फेफड़ों की संरचनात्मक स्थान intravital इमेजिंग के लिए एक चुनौती बन गया है। इस प्रोटोकॉल ट्यूमर कोशिकाओं और फेफड़ों मेटास्टेसिस के भीतर अपने आसपास के स्ट्रोमा के बीच गतिशील बातचीत के पूर्व vivo रहते इमेजिंग के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और त्वरित तरीका प्रदान करता है। इस विधि का प्रयोग, उनके microenvironment में कैंसर की कोशिकाओं की गतिशीलता के रूप में अच्छी तरह से कैंसर की कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच बातचीत कई घंटे के लिए वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं। ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों का उपयोग करके, एक फ्लोरोसेंट सेल लाइन, इंजेक्शन fluorescently लेबलअणुओं और / या एंटीबॉडी, फेफड़ों microenvironment के कई घटकों जैसे रक्त वाहिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में, कल्पना की जा सकती है। छवि के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन तेजी, चार रंग छवि अधिग्रहण के साथ लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग की अनुमति देता है कि इस्तेमाल किया गया है। कई पदों और फोकल विमानों से अधिक एकत्र छवियों से संकलित समय चूक फिल्मों में कम से कम 4 घंटे के लिए लाइव मेटास्टेटिक और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत दिखा। इस तकनीक को आगे कीमोथेरेपी या लक्षित चिकित्सा परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि अन्य फेफड़े संबंधी विकृतियों कि फेफड़ों को प्रभावित कर सकता microenvironment के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

वर्णित सभी प्रक्रियाओं के दिशा निर्देशों और स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा पूर्व अनुमोदन सहित कशेरुकी जीवों, के उपयोग के लिए नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए।

1. पूर्व के लिए फेफड़ों metastases की पीढ़ी लाइव इमेजिंग विवो (ट्रांसजेनिक या पूंछ नस इंजेक्शन)

नोट: फेफड़े मेटास्टेसिस अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल के उपयोग से या नसों (iv) कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है।

  1. एक ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस में एक अनुवांशिक इंजीनियर ट्यूमर माउस मॉडल पार, जैसे द्वारा इमेजिंग के लिए फेफड़ों मेटास्टेसिस उत्पन्न, ACTB-ECFP में स्तन कैंसर के माउस मॉडल, माउस स्तन ट्यूमर वायरस लंबे टर्मिनल दोहराने-polyoma बीच टी प्रतिजन (MMTV-PyMT) 11 पार माउस मॉडल 12।
    नोट: ACTB-ECFP मॉडल β-अधिनियम के तहत सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ECFP) बढ़ाया व्यक्तप्रमोटर में सभी कोशिकाओं नीले, CFP चैनल में प्रतिदीप्ति ऐसा है कि। हालांकि, कैंसर की कोशिकाओं को अब तक का सबसे प्रमुख हैं और माइक्रोस्कोप के तहत ECFP पॉजिटिव कोशिकाओं के एक थोक के रूप में दिखाई देते हैं। MMTV-PyMT माउस मॉडल एक प्रगतिशील रोग है, जो स्तन में ट्यूमर के विकास को विशेष रूप से फेफड़ों के लिए परिधि के लिए कैंसर कोशिकाओं के प्रसार के साथ जुड़ा हुआ है, विकसित करता है। पर FVB / एन पृष्ठभूमि MMTV-PyMT चूहों में, micrometastases उम्र के 10-11 सप्ताह के आसपास देखा जा सकता है। आम तौर पर, 13 साल की उम्र के लगभग 14 सप्ताह में macrometastases करने के लिए इन प्रगति।
    या
  2. प्राथमिक कोशिकाओं या syngeneic सेल लाइनों का उपयोग कर प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है। इन विट्रो चालाकी से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं या सेल लाइनों (जैसे।, पारगमन) चतुर्थ इंजेक्शन 14 के द्वारा पीछा में प्रयोग करें।
    1. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -expressing (+) MMTV-PyMT सेल लाइन फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों (ACTB-ECFP) या wildtype चूहों में इंजेक्षन। फिर,इन हरे, GFP चैनल का उपयोग कोशिकाओं के रूप में वीओ PyMT 15 कोशिकाओं के लिए भेजा कल्पना।
      नोट: मूल वीओ PyMT सेल लाइन नैशविले, तमिलनाडु में वेंडरबिल्ट आर्थोपेडिक्स पर निकाली थी। वीओ वेंडरबिल्ट आर्थोपेडिक्स के लिए खड़ा है।
    2. 10 6 कोशिकाओं के इंजेक्शन (200 μl में) के बाद, इंजेक्शन के बाद कुछ घंटों के लिए तुरंत और ऊपर कैंसर सेल परिस्त्राव निरीक्षण; इंजेक्शन के बाद 1-3 सप्ताह के बीच micrometastases पालन और इंजेक्शन के बाद 15 macrometastases 3 सप्ताह का पता लगाने।
      नोट: कम कोशिकाओं मेटास्टेटिक विकास के लिए इंजेक्शन से समय को लम्बा करने के लिए इंजेक्शन जा सकता है।

2. Metastatic microenvironment में ब्याज के घटकों की लेबलिंग (ट्रांसजेनिक और / या Injectables)

नोट: लेबल ट्रांसजेनिक चूहों द्वारा और / या विभिन्न इंजेक्टेबल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए अलग फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।

  1. मेटास्टेटिक microenvironment ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने का लेबल घटकों। जैसा कि पहले उल्लेख माउस ट्यूमर मॉडल क्रॉस (उदा।, MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में जो ब्याज की stromal कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जो ECFP नहीं है, उदाहरण के लिए।, सी-एफएमएस-EGFP द्वारा चिह्नित कर रहे हैं में 4,16।
    नोट: सीएफपी चैनल में कैंसर कोशिकाओं के दृश्य के अलावा, इस माइलॉयड कोशिकाओं के दृश्य GFP चैनल 4 में सक्षम बनाता है।
    और / या
  2. मेटास्टेटिक microenvironment ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों या (गैर फ्लोरोसेंट) wildtype चूहों में इंजेक्टेबल का उपयोग कर के विभिन्न घटकों लेबल।
    नोट: कई यौगिकों मेटास्टेटिक microenvironment, जैसे, एक AF647 संयुग्मित जीआर 1 एंटीबॉडी यहाँ न्यूट्रोफिल लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है और कुछ monocytes 13 और विभिन्न आणविक वजन dextrans इस्तेमाल कर रहे हैं के विभिन्न घटकों लेबल करने के लिए इंजेक्शन जा सकता हैफेफड़ों की केशिकाओं लेबल करने के लिए। इन इंजेक्टेबल की तैयारी के लिए चरण 4 से देखते हैं।

विच्छेदन के पहले सामग्री के 3. तैयारी

  1. 2% agarose
    1. agarose की 0.2 ग्राम वजन और 10 मिलीलीटर 1 एक्स पीबीएस में जोड़ें। agarose भंग करने के लिए समाधान हीट। Agarose आरटी पर जमना, तो एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इसे बनाए रखने के लिए जब तक मुद्रास्फीति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. सीओ 2 और तापमान नियंत्रक
    1. आर्द्रीकरण कक्ष में DDH 2 हे की जाँच करें। फिर से भरना जब जरूरत थी। तापमान चरण प्लेट धारक (जलवायु चैम्बर) में विन्यास प्लेट डालें। सीओ 2 नियंत्रक चालू करें और 5% सीओ 2 की स्थापना की। यकीन airflow दर 0.4 Nl / मिनट में सेट है।
    2. हवा और सीओ 2 वाल्व खुला। तापमान नियंत्रक चालू करें। यकीन है कि जलवायु चैम्बर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और ढक्कन पर सेट कर रहे हैं।
    3. सीओ 2 मीटर पर हवा दबाव जारी है। चेक सीओ 2 बढ़ रही है, ईquilibration 30 मिनट तक का समय लग सकता है।
  3. कताई डिस्क confocal खुर्दबीन
    नोट: माइक्रोस्कोप सेट-अप का विवरण पहले से 4,17 वर्णित किया गया है।
    1. लेजर (488 एनएम उत्तेजना और ठोस राज्य 405 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम लेज़रों के लिए आर्गन लेजर) चालू करें। माइक्रोस्कोप, कैमरा, कताई डिस्क नियंत्रण इकाई, AOTF, लेजर नियंत्रण इकाई और कैमरे के नियंत्रक चालू करें।
    2. माइक्रोस्कोप शटर खुला, माइक्रोस्कोप चल रहे कंप्यूटर पर बारी और सॉफ्टवेयर खुला।
  4. उपकरण और विच्छेदन मंच तैयार करना।
    1. गर्म मनका अजीवाणु पर मुड़ें और यह 250 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाने। शल्य कैंची और पानी और साबुन से संदंश की स्वच्छ 2 जोड़े। कम से कम 30 सेकंड के लिए उपकरण जीवाणुरहित। उपकरण बंद ठंडा होने दें। विच्छेदन मंच के रूप में एक polystyrene ढक्कन का प्रयोग करें। प्रयोगशाला मूसलधार बारिश के एक टुकड़े के साथ कवर।

4. इंजेक्शन की तैयारी

नोट: आधा जीवन और वरीय प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है, इंजेक्षन fluorescently लेबल एंटीबॉडी और / या फ्लोरोसेंट अणु या तो तुरंत पशु बलि या दिनों के लिए कुछ घंटों के पहले से पहले।

  1. छवि की Gr1 पॉजिटिव न्यूट्रोफिल और monocytes करने के लिए, हुड के नीचे बाँझ पीबीएस के 100 μl में शेयर AF647 संयुग्मित जीआर 1 एंटीबॉडी के 7 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एक सिरिंज तैयार करते हैं। सिरिंज पर एक 27 जी आधा सुई रखें।
  2. फेफड़ों की छवि केशिकाओं करने के लिए, या तो 70 केडी rhodamine संयुग्मित dextran (4 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl या 10 केडी AF647 संयुग्मित dextran (4 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एक दूसरे और तीसरे सिरिंज तैयार करते हैं। सीरिंज पर एक 27 जी आधा सुई रखें।
  3. फेफड़ों 'छांटना करने से पहले AF647 संयुग्मित एंटीबॉडी समाधान चतुर्थ 5 घंटा इंजेक्षन।
  4. एक या दोनों dextran समाधान चतुर्थ फेफड़ों 'छांटना करने के तुरंत पहले इंजेक्षन।

5. पूर्व के लिए फेफड़ों की तैयारी लाइव इमेजिंग विवो

ध्यान दें: फेफड़ों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अनावश्यक चुनौतियों से बचने के लिए बाँझ और संभव के रूप में काम करने के लिए सावधान प्रयास करें।

  1. एक संवेदनाहारी IACUC द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल, उदा। द्वारा अनुमति के लिए एक घातक अधिक मात्रा के साथ माउस intraperitoneal (आईपी) इंजेक्षन, 2.5% Avertin के 1 मिलीलीटर। माउस के लिए प्रतीक्षा सांस लेने बंद करो और हानिकारक उत्तेजनाओं (हिंद पंजा चुटकी) के लिए पूरी तरह से गैर जिम्मेदार होने के लिए।
    नोट: सरवाइकल अव्यवस्था और कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु के रूप में यह हानिकारकतापूर्वक फेफड़ों सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं बचा जाना चाहिए।
  2. एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस स्थिर और 70% इथेनॉल के साथ माउस बाँझ।
  3. शल्य कैंची का प्रयोग सबसे पहले त्वचा के माध्यम से एक अनुप्रस्थ अधिजठर चीरा, पेरिटोनियम के माध्यम से एक समान चीरा के द्वारा पीछा करने के लिए। एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में विच्छेदन बोर्ड पकड़ो और उतरते महाधमनी में कटौती, ताकि रक्त पूल नीचे पेट में और छाती गुहा में नहीं है।
  4. एसडायाफ्राम वैक्यूम जारी करने के लिए एक छोटे से खोलने चुटकी। 10 वीं और 12 वीं पसली के साथ कट डायाफ्राम आबकारी एवं फेफड़ों के लिए दृश्य पहुँच पाने के लिए।
  5. ribcage खत्म श्वासनली के लिए त्वचा को काटा लेकिन ribcage बरकरार छोड़ने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें। ribcage से त्वचा को अलग। आसपास के संयोजी ऊतक को हटाने, श्वासनली ही (चित्रा 1 ए) को नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा से श्वासनली बेनकाब।
  6. एक छोटे से खोलने कटाव उपास्थि के छल्ले के संपर्क में श्वासनली समानांतर में व्यास में लगभग 1 मिमी, के रूप में संभव है (चित्रा 1 बी) के रूप में गला के करीब। श्वासनली के माध्यम से पूरी तरह से कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  7. एक 20 जी सुई ले लो और धीरे किसी भी काउंटर बल (चित्रा -1) के बिना श्वासनली में सुई 4-5 मिमी डालें। सुई के अंत श्वासनली (चित्रा 1 सी) के माध्यम से दिखाई जानी चाहिए। श्वासनली में सुई को स्थिर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक सिवनी एआरओ बांधा जा सकता हैश्वासनली जगह में सुई धारण करने के लिए und।
    नोट: करके भी गहरी डालने, कैरिना आघात हो सकता है या फेफड़ों के केवल एक तरफ से फुलाया जा सकता है।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस 2% कम पिघलने तापमान agarose (एक निरंतर तापमान स्नान से सीधे लिया) के 400 μl के साथ एक सिरिंज भरें। यकीन विच्छेदन बोर्ड खड़े है सुनिश्चित करें और धीरे-धीरे फेफड़ों में सुई के माध्यम से गर्म agarose टपकाना, फेफड़ों फुलाना का उपयोग ~ 400 μl।
    नोट: फेफड़ों ribcage अंदर inflating देखो। फेफड़ों के रूप में यह टूटना होगा ओवर-बढ़ नहीं है।
  9. एक बार फेफड़ों फुलाया जाता है, भरने ~ रिब पिंजरे के ⅔, सिरिंज अलग और लीक से किसी भी agarose को रोकने के लिए श्वासनली के अंदर सुई रखने के लिए।
  10. फेफड़ों के अंदर agarose सेट और जमना करने की अनुमति फुलाया फेफड़ों के ऊपर 20 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के लगभग 50 मिलीलीटर डालो। धीरे-धीरे रोकने के लिए संदंश के साथ सुई को हटाने और बंद श्वासनली किसी भी गैर-जम agarose लीक से। </ Li>
  11. एक sternotomy प्रदर्शन से फेफड़ों का पर्दाफाश किया और बाद में फेफड़ों आबकारी। फेफड़ों के छांटना के लिए, श्वासनली के लिए पर पकड़ पूरी तरह से श्वासनली के माध्यम से काटने है। धीरे श्वासनली तक खींच, दूर कटौती संयोजी ऊतक और घेघा छाती गुहा के बाहर खींच जबकि फेफड़ों तक फेफड़ों माउस (चित्रा 1E) से अलग है।
  12. गर्म RPMI 1640 में विसर्जित कर दिया अत्यधिक रक्त फेफड़ों को धोने के लिए और धीरे कैंची और संदंश का उपयोग नाभिका (चित्रा 1F) पर पालियों 'मुख्य स्टेम श्वसनी में कटौती करने से पालियों अलग।
  13. इमेजिंग सतह को अधिकतम करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से इमेजिंग प्लेट (चित्रा 1G) के एक कुएं में नीचे पालियों प्लेस, फ्लैट सतह के साथ। पालियों की चोटी पर 37 डिग्री सेल्सियस RPMI 1640 के 100 μl जोड़ें। यह अस्थायी से रोकने के लिए पालियों के शीर्ष पर कई 15 मिमी परिपत्र माइक्रोस्कोप कवर स्लाइड रखें।
  14. EVAP से RPMI 1640 मीडिया को रोकने के लिए आसपास के कुओं में गर्म पीबीएस डालोorating। Equilibrated जलवायु चैम्बर में 24 अच्छी तरह से थाली डालें और हवा और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फेफड़ों पालियों बनाए रखें। confocal खुर्दबीन के मंच पर जलवायु चैम्बर डालें।
    नोट: अन्य गैस के मिश्रण (जैसे, 5% 2 हे, 5% सीओ 2 एन 2 में हाइपोक्सिया / कम ऑक्सीजन की शर्तों के तहत सेल व्यवहार की जांच करने के लिए) पर भी विचार किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. रहते इमेजिंग के लिए फेफड़ों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल। (ए) माउस की तैयारी के बाद श्वासनली का एक्सपोजर। (बी) छोटे उपास्थि के छल्ले के संपर्क में श्वासनली समानांतर में बने कटाव। (सी) 20 जी सुई श्वासनली में 4-5 मिमी डाला। (डी) 400 μl 2% कम पिघलने तापमान agarose फेफड़ों में की टपकाना। (ई) Inflपैदा फेफड़ों माउस से अलग कर दिया। (एफ) Lobes मुद्रास्फीति के बाद अलग कर दिया। (G) 24 अच्छी तरह से इमेजिंग प्लेट के एक कुएं में रखा पालियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. अधिग्रहण और छवियों के विश्लेषण

नोट: छवियों डिस्क confocal विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के द्वारा समर्थित सूक्ष्मदर्शी कताई की एक किस्म के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक कस्टम बनाया कताई डिस्क confocal खुर्दबीन या एक वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ ज़ेन के साथ या तो μManager, छवि अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि Imaris फिल्म संपादन और विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. μManager का उपयोग कर छवियों मोल। ΜManager सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों के अधिग्रहण के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक विस्तृत कदम पहले 18 में वर्णित है।
    या
  2. छवियों का मोल(देखें चित्र एस 1) ऐसे ज़ेन के रूप में प्रयोग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर।
    1. 'पता' टैब पर क्लिक करें और उद्देश्य (10x या 20x) 'प्रकाश पथ' उपकरण (चित्रा S1A, लाल बॉक्स) में चुनें। आईपीस (चित्रा S1A, नीले बॉक्स) के माध्यम से सीएफपी चैनल को देखने के लिए - 'DAPI आंखें' बाद में, पर क्लिक करें। नमूना स्थानीय बनाना मैन्युअल माइक्रोस्कोप का उपयोग। 'पर क्लिक करें सभी ऊतक Off'after देखने के क्षेत्र का केंद्र है।
    2. छवि अधिग्रहण के लिए सभी मानकों सेट करने के लिए 'अधिग्रहण' टैब पर क्लिक करें।
    3. 'चैनल' उपकरण में '+' बटन (चित्रा S1B, लाल बॉक्स) पर क्लिक करें। एक पॉप-अप मेनू प्रकट होता है और डाई (s) 'डाई डाटाबेस' (चित्रा S1B) में नमूने में मौजूद लिए खोज। डाई का चयन करें और 'जोड़ें' पर क्लिक करें।
      नोट: कार्यक्रम की सभी फिल्टर अनुकूलित किया जाना स्थापना की जाएगी। एक डाई नष्ट किया जा सकताचयन करके यह कचरा कर सकते हैं बटन (चित्रा S1B, पीले बॉक्स) पर क्लिक करके पालन किया।
    4. 'अधिग्रहण मोड' मेनू में, 5x5 सेट करने के लिए 'बिनिंग'। चैनलों के मेनू में ECFP पर डबल क्लिक करें यह चयन करने के लिए। 20% करने के लिए लेजर शक्ति कम इतनी नमूना है, जबकि छवि अधिग्रहण के लिए मानकों की स्थापना प्रक्षालित नहीं किया जाएगा।
    5. 'प्रयोग प्रबंधक' खंड में 'टाइलें' बॉक्स को चेक करें और टाइल्स उपकरण 'बहुआयामी अधिग्रहण' उपकरण समूह (चित्रा S1C) में प्रकट होता है। कैमरे से लाइव छवि को देखने के लिए 'उन्नत सेटअप' बटन पर क्लिक करें। प्रयोग करने के लिए 4 से 6 पदों जोड़ने के लिए 'पोजिशन' खंड में 'जोड़ें' बटन पर क्लिक करें। एक स्थिति हटाने के लिए, कि स्थिति का चयन और कचरा कर सकते हैं बटन पर क्लिक करें।
    6. 'अधिग्रहण पैरामीटर' उपकरण समूह में, 'फोकस रणनीति' उपकरण Absolut खुला, और चुनें 'ई फिक्स्ड लटकती सूची से जेड स्थिति '।
    7. 'प्रयोग प्रबंधक' अनुभाग और Z ढेर उपकरण में Z ढेर बॉक्स को चेक करें 'बहुआयामी अधिग्रहण' उपकरण समूह (चित्रा S1D) में प्रकट होता है। 'पोजिशन' अनुभाग और प्रेस 'लाइव' में पदों में से एक पर डबल क्लिक करें। मैन्युअल पहला सेट और इमेजिंग क्षेत्र के अंतिम स्थिति निर्धारित किया है। 4 माइक्रोन से कम अंतराल सेट करें।
      नोट: कार्यक्रम चुना रेंज और अंतराल के लिए स्लाइस की संख्या का निर्धारण करेगा। आदर्श रूप में, 5-7 स्लाइस पर्याप्त दृश्य और तेजी से छवि अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए सुविधाजनक हैं।
    8. 'प्रयोग प्रबंधक' खंड में 'समय' सीरीज बॉक्स को चेक करें। सेट वांछित 'अवधि' और 'टाइम' सीरीज उपकरण है कि 'बहुआयामी अधिग्रहण' उपकरण समूह (चित्रा S1E) में छपी 'अंतराल' बार।
    9. 'Acquisi मेंtion मोड 'मेनू, सेट' 2x2 करने के लिए बिनिंग '। चैनलों के मेनू में एक fluorophore पर डबल क्लिक करें इसे चुनें और 100% करने के लिए लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए। प्रेस 'लाइव' और 'एक्सपोजर समय' को समायोजित। हर fluorophore के लिए इस दोहराएँ।
    10. 'सक्षम ऑटो सहेजें' बॉक्स चेक करें। फ़ाइल के नाम पर एक फ़ोल्डर और प्रकार का चयन करें। सभी अधिग्रहीत छवियों को स्वचालित रूप से इस फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा।
    11. 'प्रयोग प्रबंधक' खंड में 'आरंभ प्रयोग' पर क्लिक करें छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए।
  3. छवि अधिग्रहण के बाद, Imaris सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा संकलन। फ़ाइलों .ims लिए छवियों को बदलने और समायोजन किया जा सकता है। फ़ाइलों के रूपांतरण, समायोजन कर रही है और बचत फिल्में Imaris प्रयोग करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक विस्तृत कदम पहले 18 में वर्णित है।
  4. जब फिल्म की बचत, प्रति सेकंड (एफपीएस) 5 फ्रेम करने के लिए 'फ्रेम दर' की स्थापना की।

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Representative Results

कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, विभिन्न माउस मॉडल प्रणाली और इंजेक्टेबल का प्रयोग, मेटास्टेटिक microenvironment कल्पना और समय के साथ लगाया जा सकता है। एक MMTV-PyMT का उपयोग करना; ACTB-ECFP; सी-एफएमएस-EGFP ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, विभिन्न सेलुलर घटकों fluorescently चिह्नित कर रहे हैं (2A चित्रा, मूवी 1)। फेफड़ों parenchyma की विशिष्ट संरचना सीएफपी चैनल के बाद से सभी कोशिकाओं β-actin प्रमोटर के तहत ECFP व्यक्त करने में देखे जा सकते हैं। बड़े / बहुकोशिकीय फेफड़ों मेटास्टेसिस को आसानी से हल कर रहे हैं इन संगठित फेफड़ों के ढांचे के भीतर कोशिकाओं के एक थोक के रूप में दिखाई देते हैं। माइलॉयड कोशिकाओं सी-एफएमएस के माध्यम से GFP चैनल -EGFP अभिव्यक्ति है, जो CSFR-1 12 के लिए ट्रांस्जीन है में कल्पना कर रहे हैं। माइलॉयड कोशिकाओं को बहुत गतिशील वे इमेजिंग क्षेत्र भर में पलायन के रूप में कर रहे हैं। सी-एफएमएस -EGFP पॉजिटिव कोशिकाओं को और अधिक प्रचुर मात्रा में और फेफड़ों parenchyma में प्रवासी हैं फेफड़ों के साथ निकट संपर्क में उन लोगों की तुलना मेंमेटास्टेसिस। माइलॉयड कोशिकाओं और फेफड़ों मेटास्टेसिस के साथ उनकी बातचीत की गतिशीलता कई घंटे के लिए वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता।

मेटास्टेटिक बोने और विकास की जांच करने के लिए, एक प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है (चित्रा 2 बी, मूवी 2)। + GFP वीओ PyMT ट्यूमर कोशिकाओं को एक wildtype, गैर संवाददाता माउस में इंजेक्शन और बीज के लिए और 2 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई। फेफड़ों की संरचना फेफड़ों के autofluorescence के कारण GFP चैनल में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। हालांकि, वीओ PyMT कोशिकाओं को अभी भी है क्योंकि वे एक गोल आकार और उच्च EGFP अभिव्यक्ति के रूप में इस प्रकार फेफड़ों parenchyma की तुलना में उज्जवल दिखाई है फेफड़ों संरचना से आसानी से अलग पहचाना जाता है। वीओ PyMT सेलुलर गतिशीलता स्थापित मेटास्टेटिक घाव के भीतर देखा जा सकता है।

मेटास्टेटिक और फेफड़ों microenvironment में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत सेलुलर भी प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल का उपयोग कर जांच की जा सकती। दो सप्ताह के बादवीओ PyMT कोशिकाओं के इंजेक्शन, fluorescently लेबल जीआर 1 647 संयुग्मित एंटीबॉडी चतुर्थ इंजेक्शन 5 घंटा फेफड़ों छांटना (चित्रा -2 सी, मूवी 3) से पहले कर रहे हैं। इमेजिंग क्षेत्र के बाईं ओर, दो जीआर 1 + माइलॉयड कोशिकाओं को एक वीओ PyMT सेल के साथ बातचीत कर रहे हैं। एक metastatic घाव इमेजिंग क्षेत्र के सही पक्ष पर मनाया जाता है। समय के साथ, जीआर 1 + कोशिकाओं मेटास्टेटिक घाव को भर्ती कर रहे हैं। मेटास्टेटिक घाव के नीचे, जीआर 1 + कोशिकाओं के एक निकट एक वीओ PyMT सेल के साथ सूचना का आदान प्रदान। आखिरकार, वीओ PyMT सेल dislodges, जीआर 1 + सेल से disengaging।

प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं लेबलिंग इंजेक्शन एंटीबॉडी के साथ रिपोर्टर ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का मेल एक तीन रंग फिल्म अर्जित करता है। एक सप्ताह के एक ACTB-ECFP संवाददाता माउस में वीओ PyMT कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद, fluorescently लेबल जीआर 1 647 संयुग्मित एंटीबॉडी चतुर्थ इंजेक्शन 5 घंटा ऊतक छांटना (चित्रा 2 डी, मूवी को पहले कर रहे हैं4)। जीआर 1 + कोशिकाओं, देखने के क्षेत्र के भीतर सख्ती विस्थापित जबकि एक एकल + GFP मेटास्टेटिक सेल इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र में दिख रहा है।

संवाददाता चूहों, जो पहले मेटास्टेटिक कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन थे, में विभिन्न फ्लोरोसेंट dextrans इंजेक्शन एक चार रंग फिल्म (चित्रा 2 ई, सिनेमा 5-6) अर्जित कर सकते हैं। मेटास्टेसिस के बोने में प्रारंभिक घटनाओं जब वीओ PyMT कोशिकाओं तुरंत कल्पना कर रहे हैं और ACTB-ECFP संवाददाता चूहों में चतुर्थ इंजेक्शन के बाद 4 घंटा का अध्ययन किया जा सकता है। rhodamine संयुग्मित, 70 केडी dextran और 10 केडी dextran एक 647 फ्लोरोसेंट टैग संयुग्मित के इंजेक्शन फेफड़ों केशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। निचले और उच्च आणविक भार dextrans के उपयोग के बाद से संभावित कम आणविक वजन अणुओं के रूप में तेजी से बहना उच्च आणविक भार वाले 19 की तुलना में, फेफड़ों में केशिकाओं की पारगम्यता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि Cellul एआर घटनाओं अभी भी प्रभावी ढंग से अध्ययन किया जा सकता, मूवी 5 एक ऊतक बहाव का एक उदाहरण है। आवश्यक है और इस मामले में ऊतक इमेजिंग सत्र के दौरान repositioned नहीं किया जा सकता है, तो इस पद छवि अधिग्रहण का विश्लेषण करती दौरान सही किया जा सकता है।

इस प्रणाली के फेफड़ों मेटास्टेटिक microenvironment के भीतर विभिन्न fluorescently लेबल प्रकार की कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक तेजी से, चार रंग निरंतर छवि अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल भी विभिन्न आकार के मेटास्टेसिस के दृश्य, मेटास्टेसिस स्थापित करने के लिए एकल कैंसर कोशिकाओं के बोने से संबंधित घटनाओं से अनुमति देता है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं आंदोलन रक्त वाहिकाओं के साथ फेफड़ों microenvironment भीतर देखे जा सकते हैं। आमतौर पर, सेलुलर आंदोलन इमेजिंग सत्र के शुरू होने से कम से कम 4 घंटे के लिए मनाया जा सकता है। एक ही फेफड़े के ऊतकों के भीतर विभिन्न मेटास्टेटिक microenvironments के अवलोकन माउस के लिए माउस परिवर्तनशीलता से बचने के लिए मदद करता है।

NT "fo: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्र 2
चित्रा 2. रहते इमेजिंग द्वारा अधिग्रहीत फिल्मों से छवियों प्रतिनिधि। (ए) फिल्म 1 फेफड़ों parenchyma (लाल डालने) से जुड़े लोगों की तुलना में एक फेफड़ों मेटास्टेसिस (पीले रंग डालने) के साथ जुड़े माइलॉयड कोशिकाओं को दिखाने से एक विलय जेड ढेर के स्नैपशॉट। (बी) फिल्म 2 से किसी मर्ज किए गए जेड ढेर के स्नैपशॉट एक प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल में GFP + मेटास्टेटिक सेल दिखा। Arrowhead एक गतिशील मेटास्टेटिक सेल के लिए अंक। (सी) फिल्म 3 से एक जेड ढेर के स्नैपशॉट एक GFP + मेटास्टेसिस और जीआर 1 + कोशिकाओं एक जीआर 1 एंटीबॉडी एक 647 टैग (लाल नोक) संयुग्मित द्वारा कल्पना से फ्लोरोसेंट संकेतों के सह स्थानीयकरण दिखा। एक GFP + मेटास्टेटिक सेल कि मेटास्टेटिक थोक से उखाड़ फेंकना करने के लिए ग्रीन नोक अंक। एक जीआर 1 + सेल कि गतिशील + GFP वीओ PyMT सेल के साथ बातचीत करने के लिए व्हाइट नोक अंक। (डी) के स्नैपशॉटफिल्म 4 से किसी मर्ज किए गए जेड ढेर + GFP वीओ PyMT कोशिकाओं दिखा, ACTB-ECFP माउस में। एक एकल वीओ PyMT सेल केंद्र (हरी नोक) में दिख रहा है। पशु जीआर 1 647 संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ इंजेक्ट किया गया था। (ई) फिल्मों 5 और 6 चूहों के फेफड़ों में रक्त वाहिकाओं को दिखाने का प्रतिनिधि Z ढेर 70 केडी rhodamine-dextran (लाल नोक) के इंजेक्शन + GFP वीओ PyMT कोशिकाओं (हरा) के साथ के बाद तुरंत बलिदान कर दिया। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1
छवियों के अधिग्रहण के लिए ज़ेन कैमरा सॉफ्टवेयर के पूरक चित्रा 1. स्क्रीन शॉट्स। (क) पहले, 'प्रकाश पथ' उपकरण में सही उद्देश्य से चुना जाना चाहिए (लाल बॉक्स) और वेंई ऊतक माइक्रोस्कोप में अनुवादित किया जा। (बी), छवि अधिग्रहण के लिए चैनलों विन्यस्त 'चैनल' उपकरण चैनलों को हटाया जा सकता है (लाल बॉक्स) में या जोड़ा (पीले बॉक्स)। (ग) 'टाइलें' उपकरण में विभिन्न पदों के प्रयोग करने के लिए जोड़ा जा सकता है। (डी) 'Z ढेर' उपकरण में जेड ढेर सेट किया जा सकता है और स्लाइस की मोटाई समायोजित किया जा सकता है। (ई) 'समय' सीरीज उपकरण में, अवधि और अंतराल सेट किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1

मूवी 1. (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। एक फेफड़ों मेटास्टेसिस और सुर के बीच सहभागिता। ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं गोलाई यह फिल्म एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक MMTV-PyMT के फेफड़ों में एक मेटास्टेसिस पता चलता है; ACTB-ECFP; सी-एफएमएस-EGFP माउस जिसमें सभी कोशिकाओं ECFP और माइलॉयड कोशिकाओं के साथ चिह्नित कर रहे हैं EGFP के साथ लेबल रहे हैं। मेटास्टेसिस सामान्य फेफड़ों वास्तुकला के विपरीत नीले रंग में कोशिकाओं के एक थोक के रूप में मनाया जा सकता है। सी-एफएमएस + माइलॉयड कोशिकाओं पूरे इमेजिंग क्षेत्र भर में पलायन। इस फिल्म में एक 2 घंटा 1 मिनट अधिग्रहण है।

फिल्म 2

मूवी 2. (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। एक प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल में कैंसर सेल गतिशीलता। इस फिल्म में एक wildtype, गैर संवाददाता, माउस में GFP + वीओ PyMT (हरा) कोशिकाओं के चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न एक फेफड़ों मेटास्टेसिस पता चलता है। फेफड़े दो सप्ताह VO के इंजेक्शन के बाद काटा गया-PyMT कोशिकाओं। GFP + कोशिकाओं मेटास्टेटिक थोक के भीतर बढ़ रहे हैं। इस फिल्म में एक 4 घंटा 40 मिनट लंबा अधिग्रहण है।

मूवी 3

मूवी 3. (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा कल्पना प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस स्थापित करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती। इस फिल्म में एक wildtype में GFP + वीओ PyMT कोशिकाओं (हरा) के चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न एक फेफड़ों मेटास्टेसिस पता चलता है, गैर संवाददाता, माउस। फेफड़े दो सप्ताह के बाद काटा गया वीओ PyMT कोशिकाओं इंजेक्शन थे। जीआर 1 + कोशिकाओं जीआर 1 647 संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल और निकट अवरक्त चैनल (सफेद) में मनाया जाता है। ध्यान दें कि जीआर 1 कोशिकाओं + GFP मेटास्टेसिस के लिए भर्ती कर रहे हैं। इस फिल्म में एक लंबी अवधि के अधिग्रहण, 11 घंटा के 27 मिनट की कुल का एक उदाहरण है।

मूवी 4. (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। एक ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मेटास्टेटिक कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन में fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा कल्पना प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता। यह फिल्म VO- के चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न फेफड़ों में एक भी + GFP वीओ PyMT सेल से पता चलता है PyMT कोशिकाओं (हरा) एक ACTB-ECFP माउस में। फेफड़े में एक सप्ताह काटा गया वीओ PyMT कोशिकाओं के बाद इंजेक्शन थे। जीआर 1 + कोशिकाओं जीआर 1 647 संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल और निकट अवरक्त चैनल (सफेद) में मनाया जाता है। इस फिल्म में एक 2 घंटा 40 मिनट लंबा अधिग्रहण है।

मूवी 5

मूवी 5. (राइट क्लिक करेंडाउनलोड करने के लिए कश्मीर)। metastatic कोशिकाओं और केशिकाओं तुरंत एक ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस में चतुर्थ इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंट dextrans द्वारा visualized। इस फिल्म के साथ-साथ एक ACTB-ECFP माउस में GFP + वीओ PyMT कोशिकाओं (हरा) के चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न प्रायोगिक मेटास्टेसिस से पता चलता rhodamine संयुग्मित, 70 केडी dextran (लाल) और 10 केडी dextran एक 647 फ्लोरोसेंट टैग (सफेद) संयुग्मित, इंजेक्शन रक्त वाहिकाओं को चिह्नित करने के लिए। यह फिल्म एक ऊतक बहाव का एक उदाहरण है और एक 18 मिनट लंबा अधिग्रहण है।

मूवी 6

मूवी 6. (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Metastatic कोशिकाओं और केशिकाओं फ्लोरोसेंट dextrans एक ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस में चतुर्थ इंजेक्शन के बाद कई घंटे तक कल्पना की। इस फिल्म से पता चलता प्रायोगिक मेटास्टेसिस उत्पन्नडी rhodamine संयुग्मित, 70 केडी dextran (लाल) और 10 केडी dextran एक 647 फ्लोरोसेंट टैग (सफेद) संयुग्मित के इंजेक्शन के साथ एक ACTB-ECFP माउस में GFP + वीओ PyMT कोशिकाओं (हरा) के चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा, चिह्नित करने के लिए रक्त वाहिकाएं। फेफड़े वीओ PyMT कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद 4 घंटा निकाल लिया गया था। यह फिल्म एक 19 मिनट लंबा अधिग्रहण है।

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Discussion

यह पांडुलिपि मेटास्टेसिस के माउस मॉडल में फेफड़ों मेटास्टेसिस के पूर्व vivo रहते इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन है। इस इमेजिंग प्रोटोकॉल फेफड़ों microenvironment भीतर गतिशील और स्थानिक ट्यूमर सेल स्ट्रोमा बातचीत का एक प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है। यह एक अपेक्षाकृत आसान और तेजी से विधि में कम से कम 4 घंटे के लिए फेफड़ों मेटास्टेसिस के विश्वसनीय इमेजिंग की अनुमति देता है। इन प्रयोगों से प्राप्त कर लिया सिनेमा सेल गतिशीलता और सेलुलर बातचीत के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

फेफड़ों मेटास्टेसिस की पीढ़ी के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया: एक अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल और एक चालाकी से सेल लाइन का उपयोग करें। MMTV-PyMT माउस मॉडल स्तन कैंसर की प्रगति और सहज फेफड़ों मेटास्टेसिस स्मरण दिलाता है। अन्य तकनीकों है कि मेटास्टेटिक प्रसार पुनरावृत्ति भी उपलब्ध हैं, उदाहरण के लिए।, स्तन ग्रंथि 20 में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण ओर्थोटोपिक। एक नसों में इंजेक्शन वीओ PyMT गपक्ष लाइन बोने और स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के परिणाम नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। वीओ PyMT सेल परिणाम के लिए समय भत्ता फेफड़ों मेटास्टेसिस के चरण के लिए प्रयोगात्मक पसंद पर निर्भर करता है। इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, micrometastases वीओ PyMT सेल इंजेक्शन के बाद 2 सप्ताह के लिए कई दिनों के भीतर देखा जा सकता है।

इष्टतम फेफड़ों इमेजिंग के लिए, महान देखभाल फेफड़ों के मुद्रास्फीति के दौरान लिया जाना चाहिए। उचित मुद्रास्फीति के लिए, सुई केवल श्वासनली में 4-5 मिमी डाला जाना चाहिए। सुई की गहरी सम्मिलन आंशिक, फेफड़ों की एक तरफा मुद्रास्फीति में परिणाम कर सकते हैं। इसके अलावा, फेफड़ों के ऊपर मुद्रास्फीति कि ऊतकों को नुकसान में परिणाम हो सकता है को रोकने के लिए वास्तविक मुद्रास्फीति के दौरान देखा जाना चाहिए। इसके अलावा, यह फेफड़ों संभव के रूप में बाँझ रखने के लिए इतना है कि फेफड़ों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चुनौती नहीं दी जाएगी महत्वपूर्ण है।

प्रत्येक रहते इमेजिंग प्रयोग के लिए, डाटा अधिग्रहण और वीं की राशि के बीच इष्टतम संतुलनअत्यधिक लेजर जोखिम के कारण ऊतकों को नुकसान के ई संभावित विचार किया जाना चाहिए। यह पायलट प्रयोगों चलाने के द्वारा छवि अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह जबकि देखने के इष्टतम क्षेत्रों के लिए खोज लेजर शक्ति कम रखने के लिए सिफारिश की है और / या शटर बंद रखने के लिए जब छवियों का अधिग्रहण नहीं कर रहे हैं।

कैंसर और / या ब्याज की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता सेल जीवन शक्ति के लिए संकेतकों में से एक है। गतिशीलता के तापमान, ऑक्सीजन का स्तर, और phototoxicity 7 के प्रति संवेदनशील है। हालांकि, निषेध या गतिशीलता की कमी इमेजिंग स्थितियों या तकनीकी मुद्दों बल्कि जैविक से संबंधित नहीं किया जा सकता है। गतिशीलता का निषेध एक निश्चित उपचारात्मक प्रभाव से या metastatic कोशिकाओं की गिरफ्तारी सिर्फ फेफड़ों के microvasculature के भीतर उनके प्रसार और फेफड़ों parenchyma 21,22 में उनके परिस्त्राव के लिए पहले से हो सकता है। इसलिए यह अतिरिक्त का उपयोग करते हुए इस तरह के डेटा की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है23 (2 डी संस्कृति में प्रवास assays के रूप में) तकनीक।

इसके अलावा, इस पूर्व vivo इमेजिंग विधि फेफड़ों एक अल्पकालिक अध्ययन है कि फेफड़ों के microcirculation की आवश्यकता नहीं है के लिए पर्याप्त है। इस विधि का प्रयोग, कैंसर और / या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आंदोलन को कम से कम 4 घंटे के लिए मनाया जाता है। छवि अधिग्रहण करने से पहले, यह फेफड़ों और 30-60 मिनट के तैयार करने के लिए अधिग्रहण के लिए पदों को खोजने के बारे में 30 मिनट लगते हैं। हालांकि सेल गतिशीलता 4 घंटा परे मनाया जाता है (11 मानव संसाधन, मूवी 3 करने के लिए), लंबे समय तक इमेजिंग अध्ययन विशेष प्रकार की कोशिकाओं, शर्तों का इस्तेमाल किया है (जैसे।, कम ऑक्सीजन) पर निर्भर करता है, और एक विशेष प्रायोगिक स्थापना के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, microcirculation की कमी और पोस्टमार्टम के परिवर्तन के संभावित प्रभाव की वजह से या वहाँ के मामले में एक अक्षुण्ण microcirculation की उपस्थिति में परिणाम को सत्यापित करने के लिए एक की जरूरत के लिए एक तर्क है, एक वक्ष सक्शन खिड़की के साथ फेफड़ों के intravital इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह एसटीआई हैकरूँगा एक चुनौती पर्याप्त नकारात्मक दबाव को बनाए रखने में कठिनाइयों के कारण कई दिनों के रूप में मस्तिष्क, स्तन ग्रंथि और पेट अंगों 5 में प्रदर्शन एक इमेजिंग विंडो का उपयोग भर में intravital इमेजिंग फेफड़ों के प्रदर्शन करने के लिए। बरकरार पूर्व vivo फेफड़ों के छिड़काव के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, अलग-थलग-भरकर रखा फेफड़ों विधि पहले से फेफड़े के मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस पद्धति अक्सर बड़े जानवरों के लिए प्रयोग किया जाता है। चूंकि चूहों छोटे वक्ष cavities है, वे प्रभावी छिड़काव 24 के लिए एक असली चुनौती है।

प्रकाश बिखरने के कारण, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की गहराई तक ही सीमित है। एक परिणाम के रूप में, सेल गतिशीलता और सेलुलर बातचीत के दृश्य सतही फेफड़ों मेटास्टेसिस के लिए प्रतिबंधित है। फेफड़े के मेटास्टेसिस फेफड़ों परिधि में समृद्ध कर रहे हैं के बाद से मेटास्टेटिक कोशिकाओं केशिकाओं जो फेफड़ों 1 के बाहरी मार्जिन की ओर आकार में कम से सीमित हैं। इसके अलावा, यह ईए हैकहते फेफड़ों वे मीडिया और ऑक्सीजन के लिए उपयोग पसंद के रूप में की सतह के करीब कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए। फेफड़ों में गहरी दृश्य की अनुमति, फेफड़ों वर्गों के रहते इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, कोशिका मृत्यु की काफी राशि उम्मीद की जानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, multiphoton माइक्रोस्कोपी का आयोजन किया जा सकता है, अधिक से अधिक ऊतक प्रवेश की इजाजत दी। इसके अलावा, multiphoton इमेजिंग जो इस तरह के कोलेजन 1 फाइबर के रूप में बाह्य मैट्रिक्स में गैर Centrosymmetric संरचनाओं, के दृश्य के लिए अनुमति देता है एक आंतरिक ऑप्टिकल संकेत, दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) कहा जाता है, उत्पन्न करता है।

जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है, और फेफड़ों के ट्यूमर मेटास्टेसिस में प्रतिरक्षा सेल व्यवहार का पालन किया और फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों, चालाकी से ट्यूमर कोशिकाओं और fluorescently लेबल ट्रेसर या एंटीबॉडी का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है। इस पद्धति मेटास्टेटिक microenvironment के भीतर अन्य कोशिकाओं और निर्धारकों के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह अंत करने के लिए, वहाँ विभिन्न tr रहे हैंansgenic संवाददाता FSP1-EGFP 4, अल्फा-एसएमए आरएफपी 25 और Col1a1-EGFP 25 या Tie2-GFP 26 के रूप में endothelial कोशिकाओं के रूप में fibroblasts के लिए उन सहित stromal सेल अध्ययन के लिए उपलब्ध चूहों।

लाइव फेफड़ों वर्गों पर सेल धुंधला प्रतिरक्षा सेल आबादी 8 कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। यह धुंधला रणनीति बहु रंग छवि को पकड़ने के लिए एक विकल्प के रूप में अपनाया जा सकता है। हालांकि, मार्कर के बहुमत अक्सर एक अलग सेल की आबादी के बजाय कई सेल आबादी लेबल। इंजेक्टेबल कि विशेष सेल आबादी 4 या अतिरिक्त सेल मार्कर के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी द्वारा लिया जाता है और आगे आबादी के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग के हित के विभिन्न कोशिकाओं लेबल इमेजिंग के लिए पसंद किया जाता है। मामलों में जहां विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग सीमित इमेजिंग Chann के कारण नहीं किया जा सकता है (उदाहरण के लिए।, मेंएल्स), यह रूप में लंबे समय के रूप में वे आसानी से आकार और / या शारीरिक स्थानीयकरण से अलग पहचाना जाता है एक ही फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ छवि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए संभव है।

विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के अलावा, केमोथेरापी के कई वर्गों (जैसे डॉक्सोरूबिसिन के रूप में) कमजोर फ्लोरोसेंट हैं। ये केमोथेरापी सिद्धांत रूप में प्राथमिक ट्यूमर 19 में के रूप में एक समान फैशन में दवा वितरण और फेफड़ों मेटास्टेसिस में वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य लक्षित चिकित्सा विज्ञान है कि fluorescently लेबल किया जा सकता भी पूर्व vivo इमेजिंग फेफड़ों में इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, डेटा फेफड़ों इमेजिंग के साथ हासिल कर ली है जिसके बारे में अधिक सूचनात्मक कोशिकाओं ले अप इन दवाओं और सक्रिय रक्त वाहिकाओं से इन चिकित्सा विज्ञान के परिस्त्राव के अलावा मेटास्टेटिक microenvironment के भीतर अन्य कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत हो सकती है। इस तकनीक को आगे प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर के 27 के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अन्य फेफड़े के अध्ययन के लिए अनुकूलितसंबंधित विकृतियों कि फेफड़ों microenvironment 28,29 प्रभावित कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MMTV-PyMT/FVB mice Jackson Laboratory 2374 Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
FVB mice Jackson Laboratory 1800 Female mice
GFP+ VO-PyMT cells UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D1818 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated Invitrogen D22914 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile  Amresco INC K813-500ML Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform Will be used as dissection board
Fine scissors sharp  Fine Science Tools 14060-11
Forceps Roboz Surgical Store RS-5135
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Air UCSF
Oxygen UCSF
Carbon dioxide UCSF
1 mL syringe without needle  BD 309659
27 G x 1/2 needle   BD 305109 for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel   BD 305178
Low-melting-temperature agarose  Lonza 50111 To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red Life Technologies 11835-030
24 well Imaging plate  E&K scientific EK-42892
Glass cover slides, 15 mm  Fisher Scientific 22-031-144
Digital CO2 and temperature controller Okolab DGTCO2BX http://www.oko-lab.com
Climate chamber Okolab http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head Yokogawa Corporation CSU-10b
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software

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References

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चिकित्सा अंक 108 कर्क, डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी मेटास्टेसिस प्रतिरक्षा कोशिकाओं microenvironment अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल कताई।
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van den Bijgaart, R. J. E., Kong,… More

van den Bijgaart, R. J. E., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J. Vis. Exp. (108), e53741, doi:10.3791/53741 (2016).

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