Summary
우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.
Abstract
전이 암 관련 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 전이는 다단계 과정과 그 복잡성으로 인해, 전이성 보급과 성장을 지배하는 정확한 세포 및 분자 프로세스는 여전히 애매하다. 라이브 영상은 세포 및 미세 환경의 동적 및 공간 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다. 고형 종양은 일반적으로 폐에 전이. 그러나, 폐의 해부학 적 위치는 생체 내에 영상에 도전을 포즈. 이 프로토콜은, 종양 세포 및 폐 전이 내에서 주변 기질 간의 동적 상호 작용의 실시간 생체 외 이미징을위한 비교적 간단하고 빠른 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여, 그 미세 암 세포 및 간질 세포와 암세포의 운동과 상호 작용은 몇 시간 동안 실시간으로 시각화 될 수있다. 형질 형광 리포터 생쥐를 사용하여 형광 세포주 주사 형광 표지분자 및 / 또는 항체, 폐 미세 여러 구성 요소는 이러한 혈관 면역 세포로서 가시화 될 수있다. 상이한 세포 유형 이미지를 신속, 4 색 화상 취득 장기 연속 촬영을 허용 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 여러 위치와 초점면을 통해 수집 된 이미지에서 컴파일 시간 경과 영화는 적어도 4 시간 동안 라이브 전이성 및 면역 세포 사이의 상호 작용을 보여줍니다. 이 기술은 또한 화학 요법 또는 치료 대상을 시험 할 수있다. 또한, 본 방법은 폐 미세 환경에 영향을 미칠 수있는 다른 폐 관련된 병리의 연구에 적용 할 수있다.
Protocol
설명하는 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다.
예를위한 폐 전이의 1 세대는 라이브 영상을 생체 내 (형질 전환 또는 꼬리 정맥 주입)
주 : 폐전이 유전자 조작 마우스 모델을 이용하여 암 세포의 정맥 주사에 의해 생성 될 수있다.
- 예를 들면, 유전자 변형 기자 마우스에 유전자 조작 종양 마우스 모델을 교차하여 이미징을위한 폐 전이를 생성, ACTB - ECFP에 유방암 마우스 모델, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복-폴리오 중간에 T 항원 (MMTV-PyMT) (11)를 교차 마우스 모델 (12).
참고 : ACTB - ECFP 모델은 β-행위에서 시안 형광 단백질 (ECFP)를 강화 표현한다프로모터의 모든 세포는 블루, CFP 채널 형광되도록. 그러나 암세포에 의해 지금까지 가장 두드러진이며 현미경 ECFP 양성 세포 대량으로 나타난다. MMTV-PyMT 마우스 모델 유방 종양 성장, 특히 폐, 주변으로 암세포의 보급과 연관되는 진행성 질환을 개발한다. FVB / n를 배경에 MMTV-PyMT 마우스에서 미세 전이 나이 10~11주 주위에 관찰 할 수있다. 일반적으로 13 세의 약 14주에서 macrometastases 이러한 진행.
또는 - 일차 전지 또는 동계 세포주를 사용하여 실험 전이를 생성합니다. IV 주입 (14) 다음에 시험관 조작 차 종양 세포 또는 세포주 (예., 전달)에 사용한다.
- 요약하면,이 프로토콜에서 형광 리포터 생쥐 (ACTB-ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다 또는 야생형 마우스에 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 (+) MMTV-PyMT 세포주를 주입. 그때,녹색 GFP 채널을 이용하여 VO-PyMT 전지 (15)로 지칭 이들 세포를 시각화.
참고 : 원래의 VO-PyMT 세포주는 내쉬빌, TN의 밴더빌트 정형 외과에서 유래되었다. VO는 밴더빌트 정형 외과를 의미합니다. - 주입 후 수 시간 바로 위로 암세포의 혈관 외 유출을 관측 (200 μL)에 10 6 세포 주입 다음; 주사 후 1-3주 사이의 미세 전이를 관찰하고 주입 15 일 이후 macrometastases 3 주 검출한다.
주 : 적은 세포 전이성 성장 주사까지의 시간을 연장 주입 될 수있다.
- 요약하면,이 프로토콜에서 형광 리포터 생쥐 (ACTB-ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다 또는 야생형 마우스에 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 (+) MMTV-PyMT 세포주를 주입. 그때,녹색 GFP 채널을 이용하여 VO-PyMT 전지 (15)로 지칭 이들 세포를 시각화.
전이성 미세 환경에 대한 관심의 구성 요소 2. 라벨 (형질 전환 및 / 또는 주사 가능한)
주 : 라벨은 트랜스 제닉 마우스에 의해 및 / 또는 각종 주사제에 의해 달성 될 수있다. 다양한 세포 유형의 표시에 대해 서로 다른 형광 색상을 사용하십시오.
- 형질 전환 마우스를 사용하여 전이성 미세 환경의 레이블 구성 요소. 전술 한 마우스 종양 모델을 교차 관심 간질 세포 ECFP없는 형광 단백질, 예를 들면., C-FMS-EGFP로 표지 된 형질 전환 마우스 모델에 (예., MMTV-PyMT는 ACTB-ECFP을 X) 4,16.
주 : CFP 채널에서 암세포의 시각화 외에도, 이는 GFP 채널 4에서 골수 세포의 가시화를 가능하게한다.
AND / OR - 형질 전환 형광 기자 마우스 또는 (비 형광) 야생형 마우스에 주사제를 사용하여 전이성 미세 환경의 다양한 구성 요소 레이블.
참고 : 여러 화합물은 전이성 미세 환경, 예를 들어, AF647 - 복합 GR-1 항체가 호중구 레이블을 여기에 사용되며, 일부 단핵구 (13)와 다른 분자량 덱스 트란이 사용되는 다양한 구성 요소 레이블을 주입 할 수있다폐 모세 혈관에 레이블을합니다. 이 주사제의 제조를위한 4 단계를 참조하십시오.
해부하기 전에 재료 3. 준비
- 2 % 아가로 오스
- 아가로 오스 0.2 g을 달아 10ml를 1 × PBS에 추가 할 수 있습니다. 아가로 오스를 분해하는 용액을 가열한다. 아가로 오스는 실온에서 응고 때문에 인플레이션에 사용할 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 그것을 유지합니다.
- CO (2) 및 온도 제어기
- 가습 실에서 DDH 2 O를 확인합니다. 필요한 경우 리필. 온도 스테이지 판 홀더 (기후 실)로 구성 플레이트를 삽입합니다. CO 2 컨트롤러의 전원을 켜고 5 % CO 2로 설정합니다. 공기 흐름 속도가 0.4 N1 개의 / 분으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 공기와 CO 2 밸브를 엽니 다. 온도 조절기의 전원을 켭니다. 기후 챔버의 온도와 뚜껑을 37 ° C로 설정되어 있는지 확인합니다.
- CO 2 미터 공기 압력을 해제합니다. CO 2가 증가 확인, 전자quilibration 30 분까지 걸릴 수 있습니다.
- 회전 디스크 공 초점 현미경
참고 : 현미경 설정의 세부 사항 이전에 4,17을 설명 하였다.- 레이저 (488 nm의 여기 및 고체 405 nm의, 561 nm 내지 640 nm의 레이저에 대한 아르곤 레이저)를 켭니다. 현미경, 카메라, 회전 디스크 제어부 AOTF, 레이저 제어 유닛과 카메라 제어부 켜기.
- 현미경 셔터를 열고 현미경을 실행하는 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 엽니 다.
- 도구 및 해부 플랫폼의 준비.
- 뜨거운 비드 살균기를 켜고는 250 ° C에 도달 할 수 있습니다. 물과 비누로 수술 가위와 집게의 청소 2 쌍. 적어도 30 초 동안 도구를 소독. 도구를 식혀 보자. 해부 플랫폼으로 폴리스티렌 뚜껑을 사용하십시오. 실험실 담그는의 조각으로 그것을 커버.
주사 4. 준비
참고 : 반감기와 선호하는 응답에 따라 분사 형광 표지 항체 및 / 또는 형광 분자 중 동물의 희생 또는 그 이전 일 몇 시간 직전에.
- 이미지 GR1 양성 호중구와 단핵구에, 후드 멸균 PBS 100 ㎕에 스톡 AF647 - 복합 GR-1 항체의 7 μL (1 ㎎ / ㎖)을 주사기를 준비합니다. 주사기에 27 G ½ 바늘을 놓습니다.
- 화상 폐 모세 혈관 (100) 중 70 kD의 로다 민 접합 된 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖)을 10 μL kD의 AF647 접합 된 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖)과 함께 두 번째 및 세 번째 주사기를 준비한다. 주사기에 27 G ½ 바늘을 놓습니다.
- 이전에 폐 '절제에 AF647 - 복합 항체 솔루션 IV 5 시간을 주입한다.
- IV 직전 폐 '절제 하나 또는 둘 덱스 트란 용액을 주입한다.
예를위한 폐 5. 준비 라이브 영상을 생체 내
참고 : 폐 내의 면역 세포의 불필요한 문제를 피하기 위해 가능한 멸균 및주의 일을보십시오.
- IACUC 승인 동물 프로토콜, 예. 허용 마취의 치명적인 과다 복용으로 마우스 복강 내 (IP)을 주입, 2.5 % AVERTIN 1 ㎖. 호흡을 중지하고 유해 자극 (뒷발 핀치)에 완전히 비 반응 할 마우스 기다립니다.
주 : 경추 탈구 이산화탄소 안락사는 유해한 폐 세포 생존에 영향을 미칠 수 있으므로 피해야한다. - 해부 보드에 마우스를 고정하고 70 % 에탄올로 소독 마우스.
- 먼저 복막을 통해 비슷한 절개 한 다음 피부를 통해 가로 상복부 절개를 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. , 수직으로 절개 보드를 잡고 하행 대동맥을 절단하지 흉강의 복부에 혈액 풀 다운 때문에.
- 에스진공을 해제 다이어프램 작은 개구 닙. 다이어프램을 절제 및 폐 시각 액세스를 얻기 위해 10, 12 늑골을 따라 잘라.
- 흉곽을 통해 기관에 피부를 잘라하지만 그대로 흉곽을 떠나 수술 가위를 사용합니다. 흉곽으로부터 피부를 분리합니다. 기관 자체 (그림 1A)을 손상되지 않도록주의하면서 주변의 결합 조직을 제거하여기도를 노출.
- 작은 구멍을 수 (그림 1B)와 후두에 가까운 연골 고리에 노출 된 기관 평행 직경 약 1mm를 싹둑. 기관을 통해 완전히 절단하지 않도록주의하십시오.
- 20 G 바늘을 가지고 부드럽게 모든 카운터 힘 (그림 1D)이없는 기관에 바늘 4-5mm를 삽입합니다. 바늘의 끝은 기관 (그림 1C)를 통해 볼 수 있어야합니다. 기관에서 바늘을 안정시키기 위해 집게를 사용합니다. 대안 적으로, 봉합사 ARO 묶여있다장소에 바늘을 유지하는 기관 핀클.
주 : 너무 깊이 삽입함으로써, 카리나는 충격되거나 폐의 한쪽 만이 팽창 될 수있다. - (항온조에서 직접 촬영) 37 ° C 2 % 낮은 용융 온도 아가로 오스의 400 μL와 주사기를 입력합니다. 해부 보드가 서 있는지 확인하고 천천히 폐에 바늘을 통해 따뜻한 아가로 오스를 주입, 폐를 팽창 ~ 400 μl를 사용합니다.
참고 : 흉곽 내에서 팽창 폐를보세요. 이 파열되므로 폐를 과다 팽창하지 마십시오. - 폐이 팽창되면, 주사기를 분리하고 누설하는 아가 방지 기관 내부 바늘을 유지 흉곽 ~ ⅔ 충전.
- 설정 고화 폐 내부 아가 있도록 팽창 폐 위에 20 ° C PBS 약 50 mL로 붓는다. 천천히 방지하기 위해 집게와 기관을 바늘을 제거하고 닫습니다 비 응고 아가로 오스 누출. </ 리>
- 흉골 절개술을 수행하여 폐 노출이어서, 폐를 절제. 완전히 기관을 통해 절단하는 동안 폐 절제술의 경우, 기관에 개최합니다. 조심스럽게 폐는 마우스 (그림 1E)에서 분리 될 때까지 흉강에서 폐를 당기면서 결합 조직과 식도를 절단,기도를 당깁니다.
- 과도한 혈액을 씻어 따뜻한 RPMI-1640에 폐를 담가 부드럽게 폐문 (그림 1 층)에서 로브의 주요 줄기 기관지를 잘라 가위와 집게를 사용하여 로브를 분리합니다.
- 24- 웰 플레이트 촬상 (도 1G)의 웰에 촬상면을 최대화하기 위해 아래 평면에, 돌출부를 배치했다. 로브의 상단에 37 ° C RPMI-1640의 100 μl를 추가합니다. 부동 것을 방지하기 위해 로브의 상단에 여러 15mm 원형 현미경 커버 슬라이드를 놓습니다.
- EVAP에서 RPMI-1640 미디어를 방지하기 위해 주변의 우물에 따뜻한 PBS를 붓고orating. 평형 기후 챔버로 24 웰 플레이트를 삽입하고 공기와 5 % CO 2와 37 ° C에서 폐 엽 (叶)을 유지한다. 공 초점 현미경의 무대에서 기후 챔버를 삽입합니다.
주의 : 다른 가스 혼합물 (예를 들어, N이 5 % O 2, 5 % CO 2는 저산소증 / 낮은 산소의 조건으로 세포를 검사하는 동작)도 고려 될 수있다.
라이브 이미징을위한 폐의 준비를위한 그림 1. 프로토콜. 마우스의 준비 후 기관의 (A) 노출. 연골 고리에 노출 기관지 평행 제 (B) 작은 한조각. (C) 20 G 바늘 기관에 4-5mm 삽입. (D) 아가 폐로 400 ㎕의 2 % 저 융점 온도 점적. (E) Inflated 폐 마우스에서 분리. (F) 로브는 인플레이션 후 분리. (G) 24 웰 이미징 플레이트의 웰에 위치 로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 수집 및 이미지 분석
주 : 이미지는 다양한 소프트웨어 프로그램에 의해 지원되는 디스크 공 초점 현미경을 방사 다양한 얻을 수있다. Imaris 영화 편집 및 분석에 사용되는 동안이 프로토콜에서 시판 회전 디스크 공 초점 현미경으로 주문 제작 회전 디스크 공 초점 현미경 선으로 하나 μManager은 이미지 수집에 사용됩니다.
- μManager을 사용하여 이미지를 획득. μManager 소프트웨어를 사용하여 화상 취득 단계 프로토콜에 의해 상세한 단계 이전에 (18)를 설명한다.
또는 - 이미지 획득이러한 선으로서 사용하는 이미지 분석 소프트웨어 (도 S1 참조).
- '찾기'탭을 클릭하고 '광경'도구 (그림 S1A, 빨간색 상자)에서 (10 배 또는 20 배) 목표를 선택합니다. 접안 렌즈 (그림 S1A, 파란색 상자)를 통해 CFP 채널을보고 - 'DAPI 눈'그 후, 클릭합니다. 수동 현미경을 사용하여 샘플을 현지화. 조직 Off'after 모든 시야의 중심 '을 클릭합니다.
- 이미지 획득을위한 모든 매개 변수를 설정하는 '수집'탭을 클릭합니다.
- '채널'도구에서 '+'버튼 (그림 S1B, 빨간색 상자)을 클릭합니다. 팝업 메뉴가 나타납니다하고 '염료 데이터베이스'(그림 S1B)의 샘플에 존재하는 염료 (들)를 검색합니다. 염료를 선택하고 '추가'를 클릭합니다.
참고 :이 프로그램은 모든 필터가 최적화되도록 설정됩니다. 염료는 삭제 될 수 있습니다선택은 휴지통 버튼 (그림 S1B, 노란색 상자)를 클릭 하였다. - '획득 모드'메뉴에서, 5 × 5에 '비닝 (Binning)'로 설정합니다. 선택하는 채널 메뉴에서 ECFP을 더블 클릭합니다. 샘플 화상 취득을위한 파라미터를 설정하는 동안 표백되지 않도록 20 % 레이저 파워를 낮출.
- '실험 관리자'섹션에서 '타일'확인란을 선택하고 타일 도구는 '다차원 취득'도구 그룹 (그림 S1C)에 나타납니다. 카메라에서 라이브 영상을 볼 수 있습니다 '고급 설정'버튼을 클릭합니다. 실험에 4 ~ 6 위치를 추가하려면 '위치'섹션에서 '추가'버튼을 클릭합니다. 위치를 삭제하려면 해당 위치를 선택하고 휴지통 버튼을 클릭합니다.
- '획득 매개 변수'도구 그룹에서 '앱솔루트을'집중 전략 '도구를 열고 선택전자는 드롭 다운 목록에서 Z-위치를 '수정되었습니다.
- '실험 관리자'섹션과 Z-스택 도구의 Z 스택 상자를 확인은 '다차원 취득'도구 그룹 (그림 S1D)에 나타납니다. '위치'섹션를 눌러 '라이브'의 위치 중 하나를 더블 클릭합니다. 수동으로 제 1 세트의 촬상 영역의 마지막 위치를 설정한다. 4 μm의 간격을 설정합니다.
참고 :이 프로그램은 선택된 범위와 간격 조각의 수를 결정합니다. 이상적으로, 5-7 조각 충분한 시각화와 빠른 영상 획득이 가능하도록 편리합니다. - '실험 관리자'섹션에서 '시계열'확인란을 선택합니다. 설정 원하는 '시간'과 '다차원 취득'도구 그룹 (그림 S1E)에 나타난 '시계열'도구 '간격'시간.
- 'Acquisi에서기 모드 2 × 2로 '비닝 (Binning)'메뉴 설정 '. 채널 메뉴에서 형광을 두 번 클릭을 선택하고 100 %로 레이저 파워를 증가시킵니다. 를 눌러 '라이브'와 '노출 시간'을 조정합니다. 모든 형광에 대해이 작업을 반복합니다.
- '사용 자동 저장'확인란을 선택합니다. 파일의 이름으로 폴더 및 유형을 선택합니다. 모든 획득 된 영상은 자동으로이 폴더에 저장됩니다.
- 이미지 수집을 시작하는 '실험 관리자'섹션에서 '시작 실험'을 클릭합니다.
- 이미지 획득 후 Imaris 소프트웨어의 원시 데이터를 컴파일한다. 파일을 .ims하는 이미지 변환 및 조정을 할 수있다. 파일의 변환, 조정을하고 Imaris를 사용하여 저장하는 영화 단계 프로토콜에 의해 자세한 단계는 이전에 18 설명한다.
- 동영상을 저장할 때, 두 번째 (FPS) 당 5 프레임 '프레임 레이트'를 설정합니다.
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Representative Results
스피닝 디스크 공 초점 현미경, 다양한 마우스 모델 시스템 및 주사제를 사용하여, 미세 전이가 가시화하고 시간을 추적 할 수있다. MMTV-PyMT를 사용하여; ACTB - ECFP; C-FMS-EGFP 트리플 유전자 변형 마우스 모델, 다른 세포 성분이 찬란 (그림 2A, 영화 1) 레이블이 표시됩니다. 폐 실질의 일반적인 구조는 모든 셀 β 액틴 프로모터 하에서 발현 ECFP 때문에 CFP 채널에서 가시화 될 수있다. 이러한 조직 폐 구조 내에서 세포의 대량으로 나타나는 큰 / 다세포 폐 전이가 쉽게 해결됩니다. 골수 세포는 C-FMS를 통해 GFP 채널-EGFP 발현, CSFR-1 (12)에 대한 유전자 인 시각화된다. 골수 세포는 화상 필드에 걸쳐 이주로 매우 동적이다. C-FMS-EGFP 양성 세포가 더 풍부 및 폐 실질의 이동성이다 폐 밀착 것에 비해전이. 골수 세포와 폐 전이과의 상호 작용의 역학은 여러 시간 동안 실시간으로 따라 할 수 있습니다.
전이성 파종과 성장을 조사하기 위해 실험 전이 모델 (그림 2B, 영화 2) 사용됩니다. GFP + VO-PyMT 종양 세포는 야생형 않은 리포터 생쥐에 주입 종자 2 주 동안 성장시켰다. 폐의 구조로 인해 폐 형광도에 GFP 채널에서 명확하게 볼 수있다. 그들은 원형 높은 EGFP 발현 따라서 폐 실질에 비해 밝게 표시해야하기 때문에, VO-PyMT 세포는 여전히 폐 구조로부터 쉽게 구별된다. VO-PyMT 세포의 운동성은 기존의 전이성 병변 내에서 관찰 할 수있다.
폐 미세 전이성 면역 세포와 세포의 상호 작용은 실험 전이 모델을 사용하여 조사 할 수있다. 두 주 후VO-PyMT 세포의 주입은, 형광 GR-1 647 복합 항체는 정맥이 5 시간 전에 폐 절제술 (그림 2C, 영화 3)에 주입되어 표시. 촬상 필드 왼쪽 두 GR-1 + 골수 세포 VO-PyMT 세포와 상호 작용한다. 전이성 병변이 촬상 영역의 우측에 관찰된다. 시간이 지남에 따라, GR-1 + 세포는 전이성 병변을 모집하고 있습니다. 전이성 병변 아래 GR-1 + 1 셀 밀접 VO-PyMT 세포와 상호 작용한다. 결국, VO-PyMT 셀 GR-1 + 세포로부터 이탈,으로 제거 될.
전이 실험 모델 및 면역 세포를 라벨링 주사 항체와 리포터 트랜스 제닉 마우스 모델을 결합하여 삼색 동영상을 산출한다. 일주일 ACTB ECFP-리포터 마우스로 VO-PyMT 세포 주입 후 형광 표지 한 GR-647 복합 항체는 IV는 5 시간 전에 조직 절제 영화 (도 2D에 주입4). 단일 GFP + 전이성 세포 이미징 필드의 중앙에 표시되는 동안 GR-1 + 세포는 시야 내에서 격렬하게 이동한다.
이전 전이성 세포를 주입 하였다 리포터 생쥐로 상이한 형광 덱스 트란을 주입하는 4 색 동영상 (도 2e, 영화 5-6)을 수득 할 수있다. VO-PyMT 세포는 즉시 시각화 및 4 시간 ACTB - ECFP 기자 마우스에 정맥 주사 후 때 전이의 시드의 조기 이벤트는 공부하실 수 있습니다. 647 형광 태그에 결합 로다 민 - 결합, 70 kD의 덱스 트란 10 kD의 덱스 트란의 주입은 폐 모세 혈관의 시각화 할 수 있습니다. 저 분자량 분자가 고 분자량의 것 (19)에 비해 더 빠르게 extravasate 때문에 하부 및 고 분자량 덱스 트란의 사용은 잠재적으로, 폐 모세 혈관의 투과성의 변화를 검출하기 위해 이용 될 수있다. cellul 있지만 AR 이벤트가 여전히 유효 영화 5 티슈 드리프트의 일례이며, 조사 할 수있다. 및 필요한 경우, 조직이 촬상 세션 동안 재배치 할 수 없으면,이 후 화상 취득 분석 중에 보정 될 수있다.
이 시스템은 폐 전이 미세 환경 내에서 다양한 형광 표지 세포 유형을 따라 신속 4 색 연속 화상 획득을 가능하게한다. 이 프로토콜은 또한 설립 전이 싱글 암세포 시드와 관련된 이벤트는 다른 크기의 전이의 시각화를 허용한다. 또한, 종양 세포 및 간질 세포 이동은 혈관과 함께 폐 미세 환경 내에서 시각화 될 수있다. 통상적으로, 셀룰러 이동 촬상 세션 개시로부터 적어도 4 시간 동안 관찰 할 수있다. 같은 폐 조직 내에서 서로 다른 전이 미세 환경의 관찰은 마우스 투 마우스 변동을 방지하는 데 도움이됩니다.
NT를 "FO : 유지-together.within 페이지 ="항상 ">
라이브 영상에 인수 영화에서 그림 2. 대표 이미지. 폐 실질 (빨간색 삽입)와 연관된 대 폐 전이 (노란색 삽입)와 관련된 골수 세포를 보여주는 영화 1에서 병합 된 Z 스택의 (A) 스냅 샷. 영화 2에서 병합 된 Z 스택의 (B) 스냅 샷은 실험 전이 모델에서 GFP + 전이성 세포를 게재합니다. 화살촉은 운동성이 전이성 세포를 가리 킵니다. 영화 3에서 Z 스택의 (C) 스냅 샷은 647 태그 (빨간색 화살표)에 접합 GR-1 항체에 의해 시각화 GFP + 전이 및 GR-1 + 세포에서 형광 신호의 공동 현지화을 표시합니다. 전이성 벌크에서 빠질 수 GFP + 전이성 세포에 녹색 화살표 포인트. 운동성 GFP + VO-PyMT 세포와 상호 작용 GR-1 + 셀에 흰색 화살표 포인트. 의 (D) 스냅 샷ACTB - ECFP 마우스에 GFP + VO-PyMT 세포를 보여주는 영화 4에서 병합 된 Z 스택. 하나의 VO-PyMT 셀 중심 (녹색 화살표)에서 볼 수 있습니다. 동물 GR-647 1 접합 항체를 주사 하였다. (E) 마우스의 폐 혈관을 나타내는 동영상 (5) 및 (6)의 대표 Z-스택 GFP + VO-PyMT 세포 (녹색)과 함께 70 가와사끼 로다 덱스 트란 (적색 화살표)의 주입 직후 희생. 스케일 바는 100 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1. 화면 이미지 획득을위한 ZEN 카메라 소프트웨어의 샷. (A) 먼저, '광경'도구에서 오른쪽 목적은 (빨간색 상자)을 선택해야하고 일전자의 조직을 현미경 지역화 될 수있다. (B) '채널'도구 채널을 삭제할 수 있습니다 (빨간색 상자)에, 이미지 수집을위한 채널을 구성하거나 추가 (노란색 상자). '타일'도구에서 (C)의 상이한 위치들은 실험에 첨가 될 수있다. 'Z 스택'도구에서 (D)는, Z 스택이 설정 될 수 있으며, 슬라이스의 두께는 조절 될 수있다. '시계열'도구에서 (E), 지속 시간 및 간격을 설정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1. (오른쪽 다운로드 클릭). 상호 작용을 폐 전이 및 쉬르 사이. 유전자 변형 기자 마우스를 사용하여 면역 세포를 반올림이 영화는 트리플 유전자 변형 MMTV-PyMT의 폐 전이를 보여줍니다; ACTB - ECFP; C-FMS-EGFP 마우스의 모든 세포가 ECFP 및 골수 세포로 표지 된이 EGFP으로 표시됩니다. 전이는 정상적인 폐 구조에 대비 블루 세포 대량으로 관찰 할 수있다. C-FMS + 골수 세포는 전체 촬상 영역에 걸쳐 이동한다. 이 영화는 2 시간 1 분 인수입니다.
영화 2. (오른쪽 다운로드 클릭). 암 세포의 운동성을 실험 전이 모델.이 영화는 야생형, 비 기자, 마우스에 GFP + VO-PyMT (녹색) 세포의 정맥 주사에 의해 생성 된 폐 전이를 보여줍니다. 폐 2 주 VO 주입 후에 수확-PyMT 세포. GFP + 세포는 전이성 벌크 내에서 이동하고 있습니다. 이 영화는 4 시간 40 분 긴 획득이다.
영화 3. (오른쪽 다운로드 클릭). 모집을 실험적으로 전이를 설립하기 위해 형광 접합 된 항체에 의해 시각화 면역 세포.이 영화는 야생형에 GFP + VO-PyMT 세포 (녹색)의 정맥 주사에 의해 생성 된 폐 전이를 보여줍니다, 비 기자, 마우스. VO-PyMT 세포를 주입 한 후 폐 2 주 수확했다. GR-1 + 세포 GR-1 (647)로 표지 된 항체 컨쥬 게이트 및 근적외선 채널 (흰색)으로 관찰된다. GR-1 세포가 GFP + 전이를 모집합니다. 이 영화는 장기 획득, 11 시간 27 분의 총의 일례이다.
영화 4. (오른쪽 다운로드 클릭). 운동성을 전이성 세포를 주입 유전자 변형 기자 마우스에서 찬란 - 복합 항체에 의해 시각화 면역 세포.이 영화는 VO-의 정맥 주사에 의해 생성 된 폐의 단일 GFP + VO-PyMT 셀을 보여줍니다 ACTB - ECFP 마우스로 PyMT 세포 (녹색). VO-PyMT 세포를 주입 한 후 1 주일 폐를 수거 하였다. GR-1 + 세포 GR-1 (647)로 표지 된 항체 컨쥬 게이트 및 근적외선 채널 (흰색)으로 관찰된다. 이 영화는 2 시간 40 분 긴 획득이다.
영화 5. (오른쪽 카릭) 다운로드 케이. 바로 유전자 변형 기자 마우스에 정맥 주사 후 형광 덱스 트란 시각화 전이성 세포와 모세 혈관을.이 영화는 함께 ACTB - ECFP 마우스에 GFP + VO-PyMT 세포 (녹색)의 정맥 주사에 의해 생성 된 실험 전이를 보여줍니다 647 형광 태그 (흰색)에 결합 로다 민 - 결합, 70 kD의 덱스 트란 (적색), 10 kD의 덱스 트란, 주사는 혈관을 표시합니다. 이 영화는 조직 드리프트의 예이며, 18 분 긴 획득이다.
영화 6. (오른쪽 다운로드 클릭). 몇 시간 유전자 변형 기자 마우스에 정맥 주사 후 형광 덱스 트란 시각화 전이성 세포와 모세 혈관을.이 영화는 실험 전이 생성 보여줍니다로다 민 - 복합, 70 kD의 덱스 트란 (적색)과 647 형광 태그 (흰색)에 접합 10 kD의 덱스 트란의 주입과 함께 ACTB - ECFP 마우스에 GFP + VO-PyMT 세포 (녹색)의 정맥 주사에 의한 D, 표시하기 혈관. 폐는 VO-PyMT 세포의 주입 후 4 시간을 검색했다. 이 영화는 19 분 긴 획득이다.
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Discussion
이 원고는 전이의 마우스 모델에서 폐 전이의 생체 라이브 영상에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 촬상 프로토콜 폐 미세 환경 내에서 동적 공간 종양 세포 - 기질 상호 작용의 직접적인 시각화를 제공한다. 적어도 4 시간 동안 폐전이 신뢰성있게 이미징 비교적 쉽고 빠른 방법이다. 이 실험에서 얻은 동영상 세포 운동성 및 셀룰러 상호 동적 프로세스를 추적 할 수있다.
폐 전이 발생하는 두 가지 방법을 설명 하였다 : 유전자 변형 마우스 모델 조작 세포주의 사용. MMTV-PyMT 마우스 모델은 유방암 진행 자발적인 폐전이 되풀이되었습니다. 전이성 확산을 요점을 되풀이 다른 기술도 사용할 수 있습니다 예를 들어., 유선 (20)의 셀 동 소성 이식. 정맥 주사 VO-PyMT의 C엘 라인 시드 유방암 전이 생장을 모방하기 위해 사용된다. VO-PyMT 세포 부산물의 시간 수당은 폐 전이 단계의 실험 환경에 따라 달라집니다. 주입 된 세포의 수에 따라 미세 전이는 VO-PyMT 세포 주입 후 이주 며칠 이내에 관찰 할 수있다.
최적의 폐 영상의 경우, 큰 관심은 폐의 팽창시주의해야합니다. 적절한 인플레이션, 바늘은 기관에 4-5mm를 삽입해야합니다. 바늘 깊은 삽입 폐 부분 일방적 팽창 될 수있다. 또한, 폐 조직이 손상 될 수 있습니다 오버 인플레이션을 방지하기 위해 실제 인플레이션 동안 시청해야합니다. 또한, 폐의 면역 세포가 도전되지 않도록 가능한 멸균 폐를 유지하는 것이 중요하다.
각 실시간 이미징 실험 데이터 수집 및 일의 양 사이의 최적의 균형과도한 레이저 노광에 의한 조직 손상의 전자 전위는 고려 될 필요가있다. 이는 파일럿 실험을 실행하여 화상 취득을위한 설정을 최적화하는 것이 중요하다. 또한,이보기의 최적의 필드를 검색하는 동안 레이저 파워를 유지하는 것이 좋습니다 및 / 또는 이미지가 획득되지 않을 때 셔터를 유지합니다.
암 및 / 또는 관심의 면역 세포의 운동성 세포의 활력을위한 지표 중 하나입니다. 운동성은 온도, 산소 농도, 및 광독성 7 민감하다. 그러나 운동의 억제 또는 부족은 이미징 조건이나 기술적 인 문제가 아니라 생물학적으로 관련되지 않을 수 있습니다. 운동의 억제는 특정 치료 효과 또는 직전 폐의 미세 혈관 내에서 증식 및 폐 실질 (21, 22)에 자신의 혈관 외 유출에 전이성 세포의 체포 발생할 수 있습니다. 따라서, 추가하여 이러한 데이터를 확증하는 데 중요 할 수있다23 (2D 문화 마이그레이션 분석 등) 기술.
또한,이 생체 폐 촬상 방법은 폐 미세 필요없는 단기 연구에 충분하다. 이 방법을 사용하여, 암 및 / 또는 면역 세포의 이동은 적어도 4 시간 동안 관찰된다. 화상 획득하기에 앞서 취득 위치를 찾기 위해 폐 30-60 분을 준비하는 데 약 30 분 걸린다. 세포 운동성은 4 시간 이상이 관찰되지만 (11 시간, 영화 3까지), 장시간 촬상 공부 특정 세포 유형, 이용 조건 (예를 들면., 산소 감소)에 의존하고, 특히 실험 구성에 대해 결정되어야한다. 또한 의한 미세 부족 및 사후 변경 가능한 충격 또는 경우에 그대로 미세의 존재 하에서 결과를 검증 할 필요에 대한 근거가, 흉부 흡입 창 폐 생체 내에 촬상 이용할 수있다. 그러나, STI 인LL 문제는 충분한 음압을 유지 때문에 어려움 뇌, 유선 및 복부 장기 (5) 수행 등의 이미지 창을 사용하여 여러 날에 걸쳐 생체 내에 폐 이미징을 수행 할 수 있습니다. 본래 생체 폐 혈류의 대체 방법으로서, 절연 관류 폐있어서 이전 폐전을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나,이 방법은 종종 큰 동물들에 사용된다. 마우스는 작은 흉부 충치를 가지고 있기 때문에, 그들은 효과적인 관류 (24)에 대한 진정한 도전을 제기.
광 산란에 의해, 회전 디스크 공 촛점 현미경 촬상 깊이는 제한된다. 결과적으로, 셀 역학 및 셀룰러 상호 작용 가시화 표면 폐전이 제한된다. 전이성 세포 폐암 (1)의 외측 가장자리를 향해 크기 감소 모세관에 의해 한정되기 때문에 폐 전이는 폐 주변부 농축된다. 또한, EA는SIER 가까이들은 미디어 및 산소에 대한 액세스를 원하는대로 폐의 표면에 세포의 생존력을 유지한다. 폐로 깊은 시각화 할 수 있도록, 폐 구간의 라이브 영상을 행할 수있다. 그러나, 세포 사멸의 상당량이 기대되어야한다. 대안 적으로, 다 광자 현미경은 큰 조직 침투를 허용 수행 될 수있다. 또한, 다 광자가 촬상 한 콜라겐 섬유 등의 세포 외 기질의 비 중심 대칭 구조의 시각화를 허용 차 고조파 발생 (SHG)이라는 고유의 광 신호를 생성한다.
본 연구에서 나타난 바와 같이, 폐 전이 종양 및 면역 세포의 동작은 다음과 형광 리포터 생쥐 종양 세포 조작 및 형광 표지 된 트레이서 또는 항체를 사용하여 분석 될 수있다. 이 방법은 전이성 미세 환경 내에서 다른 세포와 결정의 연구를 위해 수정할 수 있습니다. 이를 위해, 다양한 TR 존재FSP1-EGFP 4, 알파 - SMA-RFP (25)와 Col1a1-EGFP 25 Tie2의-GFP (26) 등의 내피 세포와 같은 섬유 아세포에 대한 포함 기질 세포 연구에 사용할 수 ansgenic 기자 마우스.
라이브 폐 섹션에 세포 얼룩은 면역 세포 인구 8을 시각화하기 위해 수행되었다. 염색이 전략은 멀티 컬러 촬상 용의 대안으로 채용 할 수있다. 그러나 마커의 대부분은 종종 대신 별개의 세포 인구의 여러 세포 집단 레이블을 붙입니다. 특정 세포 집단 4 또는 추가적인 세포 마커에 대한 형광 표지 된 항체에 의해 흡수되는 주사제는 상기 집단 구별하는데 사용될 수있다. 관심의 다양한 세포를 라벨 서로 다른 형광 색상의 사용은 이미지 바람직하다. 다른 형광 염료의 사용이 (수행 할 수없는 등. 인해 제한된 촬상 chann 경우에ELS는) 그것만큼 그들은 모양 및 / 또는 해부학 적 위치 파악하여 쉽게 구별로 같은 형광 기자들과 이미지를 다른 세포 유형에 가능하다.
다양한 유형의 세포를 연구 이외에도, 화학 요법의 여러 클래스 (예컨대 독소루비신) 약한 형광이다. 이러한 화학 요법은 원칙적 원발 종양 19와 유사한 방식으로 약물 전달 및 폐 전이에서의 분포를 가시화 할 수있다. 형광 표지 된 표적 될 수있는 다른 치료제는 생체 폐 촬상에 사용될 수있다. 특히, 폐 촬상하여 취득한 데이터는 셀이 권취되는 대해 이러한 약물 활성 혈관에서 이러한 치료의 혈관 외 유출 이외에 전이 미세 내의 다른 세포와의 상호 작용이 더 유익 할 수있다. 이 기술은 상기 기본 폐암 (27)의 조사에 사용되는 다른 폐 연구에 적용 할 수있다폐 미세 환경 (28, 29)에 영향을 미칠 수 있습니다 - 관련 병리.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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