Summary
Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.
Abstract
A metástase é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionada ao câncer. A metástase é um processo de várias etapas e, devido à sua complexidade, os processos celulares e moleculares exatos que governam disseminação metastática e crescimento são ainda imperceptíveis. imagens ao vivo permite a visualização das interações dinâmicas e espaciais das células e seu microambiente. Os tumores sólidos geralmente metástases para os pulmões. No entanto, a localização anatômica dos pulmões representa um desafio para imagiologia intravital. Este protocolo fornece um método relativamente simples e rápido para ex vivo imagens ao vivo das interações dinâmicas entre as células tumorais e sua estroma circundante dentro de metástase pulmonar. Usando este método, a motilidade de células cancerosas, bem como as interacções entre as células cancerosas e as células do estroma no seu microambiente podem ser visualizados em tempo real, durante várias horas. Ao utilizar ratinhos transgénicos repórter fluorescentes, uma linha de células fluorescentes, injectável marcado fluorescentementemoléculas e / ou anticorpos, vários componentes do microambiente do pulmão pode ser visualizado, tais como os vasos sanguíneos e células do sistema imunológico. Para imagem os diferentes tipos de células, foi utilizado um disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com rápida, de quatro cores de aquisição de imagem. filmes de lapso de tempo compilados a partir de imagens recolhidas ao longo de várias posições e planos focais mostram interações entre metastático ao vivo e células do sistema imunológico durante pelo menos 4 horas. Esta técnica pode ser também utilizada para testar a quimioterapia ou terapia-alvo. Além disso, este método pode ser adaptado para o estudo de outras patologias relacionadas com o pulmonares que podem afectar o microambiente do pulmão.
Protocol
Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia por parte do Care local Institucional Animal e Comitê de Uso (IACUC).
1. Geração de metástases pulmonares por ex vivo Imagens ao vivo (Transgenic ou veia caudal Injection)
NOTA: As metástases pulmonares pode ser gerado através da utilização de modelos de ratinho geneticamente modificadas ou por injecção intravenosa (iv) a injecção de células cancerosas.
- Gerar metástases pulmonares para a imagem latente do cruzamento de um modelo de rato tumor geneticamente modificado em um rato repórter transgênicos, por exemplo, atravessar o modelo do rato do cancro da mama, rato antígeno do vírus do tumor mamário terminal longa do meio repeat-polioma T (MMTV-PyMT) 11 em ACTB-ECFP modelo do rato 12.
NOTA: O modelo ACTB-ECFP expressa reforçada ciano proteína fluorescente (ECFP) sob a β-actno promotor de modo a que todas as células fluoresce na, canal PCP azul. No entanto, as células cancerosas são, de longe, o mais proeminente e aparecem como uma massa de células eCFP-positiva sob o microscópio. O modelo de rato de MMTV-PyMT desenvolve uma doença progressiva, em que o crescimento do tumor mamário está associada com a difusão de células de cancro para a periferia, especialmente para os pulmões. Em ratinhos MMTV-PyMT no FVB / N fundo, micrometástases pode ser observada cerca de 10-11 semanas de idade. Geralmente, estes progressos para macrometástases em cerca de 14 semanas de idade de 13 anos.
OU - Gerar metástases experimentais utilizando células primárias ou linhas de células singeneicas. Utilização em células de tumor primário in vitro manipulado ou linhas de células (por ex., Transdução), seguido por injecção IV 14.
- Resumidamente, neste protocolo, injetar uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing (+) linha de células MMTV-PyMT em ratos fluorescentes Repórter (ACTB-ECFP) ou ratinhos de tipo selvagem. Depois,visualizar essas células referidas como células VO-PyMT 15 usando o verde, canal de GFP.
NOTA: A linha celular VO-PyMT original foi derivada no Vanderbilt Ortopedia em Nashville, TN. VO significa Vanderbilt Ortopedia. - A seguir à injecção de 10 6 células (em 200 uL), observar o extravasamento de células de cancro imediatamente e até algumas horas após a injecção; observar micrometástases entre 1-3 semanas após a injecção e detectar macrometástases 3 semanas após a injecção 15.
NOTA: menor número de células pode ser injectado para prolongar o tempo de injecção para o crescimento metastático.
- Resumidamente, neste protocolo, injetar uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing (+) linha de células MMTV-PyMT em ratos fluorescentes Repórter (ACTB-ECFP) ou ratinhos de tipo selvagem. Depois,visualizar essas células referidas como células VO-PyMT 15 usando o verde, canal de GFP.
2. Rotulagem de componentes de interesse na metastático Microenvironment (Transgenic e / ou injetáveis)
NOTA: A rotulagem pode ser conseguida por murganhos transgénicos e / ou por vários injectáveis. Certifique-se usar diferentes cores fluorescentes para a rotulagem dos vários tipos de células.
- Os componentes Label do microambiente metastático utilizando camundongos transgênicos. Cruzar o modelo de tumor de rato anteriormente mencionado (por exemplo., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) em um modelo de rato transgénico, em que as células estromais de interesse são marcados por uma proteína fluorescente que não é ECFP, por exemplo., C-fms-EGFP 4,16.
NOTA: Além de visualização de células cancerosas no canal PCP, este permite a visualização de células mielóides no canal de GFP 4.
E / OU - Rotular vários componentes do microambiente metastático em ratinhos usando injectáveis repórter fluorescente ou transgénicos (não fluorescentes) ratinhos de tipo selvagem.
NOTA: Vários compostos podem ser injectados para marcar vários componentes do microambiente metastático, por exemplo, um anticorpo conjugado AF647-Gr-1 é aqui utilizada para rotular neutrófilos e alguns monócitos e 13 diferentes dextranos de peso molecular são usadospara rotular capilares pulmonares. Para a preparação desses injetáveis consulte a etapa 4.
3. Preparação de Materiais Antes Dissecação
- 2% de agarose
- Pesar 0,2 g de agarose e adicionar 10 ml de 1 x PBS. Aquece-se a solução para dissolver a agarose. Agarose irá solidificar à TA, assim mantê-lo em um banho de água a 37 ° C até ser utilizado para a inflação.
- CO 2 e controlador de temperatura
- Verifique DDH 2 O na câmara de umidificação. Reabastecer quando necessário. Inserir a placa de configuração no suporte da placa de estágio de temperatura (câmara climática). Ligue o controlador de CO 2 e definir de CO 2 a 5%. Certifique-se a taxa de fluxo de ar é fixada em 0,4 Nl / min.
- Abra o ar e o CO 2 válvulas. Ligue o controlador de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da câmara climática e a tampa são definidas a 37 ° C.
- Liberar a pressão do ar no CO 2 metros. Entrada de CO 2 a aumentar, equilibration pode levar até 30 min.
- disco giratório microscópio confocal
NOTA: Os detalhes do microscópio set-up foram previamente descritos 4,17.- Ligue os lasers (o laser de argônio para 488 nm de excitação e de estado sólido 405 nm, 561 nm e 640 nm lasers). Ligue o microscópio, a câmera, a unidade de controle disco giratório, o AOTF, a unidade de controle do laser e o controlador da câmara.
- Abra o obturador microscópio, ligue o computador a executar o microscópio e abrir o software.
- Preparação das ferramentas e plataforma de dissecção.
- Ligue o esterilizador talão quente e deixá-la atingir 250 ° C. Limpos 2 pares de tesouras cirúrgicas e pinças com água e sabão. Esterilizar as ferramentas durante pelo menos 30 seg. Deixe as ferramentas refrescar. Utilize uma tampa de poliestireno como plataforma de dissecção. Cubra-o com um pedaço de imersão laboratório.
4. Preparação de injecções
NOTA: Dependendo da meia-vida ea resposta preferida, injetar fluorescente etiquetado anticorpos e / ou moléculas fluorescentes ou imediatamente antes do sacrifício animal ou um par de horas a dias antes.
- Para neutrófilos imagem Gr1-positivos e monócitos, preparar uma seringa com 7 ul de anticorpo conjugado com AF647-Gr-1 da (1 mg / ml) em 100 ul de PBS estéril sob o capô. Coloque um G ½ agulha 27 na seringa.
- Para capilares pulmonares imagem, preparar uma segunda e terceira seringa com 100 ul de quer 70 kD rodamina conjugada com dextrano (4 mg / ml) ou dextrano 10 kD AF647-conjugado (4 mg / ml). Coloque um G ½ agulha 27 nas seringas.
- Injectar a AF647 conjugado com solução de anticorpo iv 5 horas antes da excisão 'pulmões.
- Injectar uma ou ambas as soluções de dextrano iv imediatamente anteriores à excisão 'pulmões.
5. Preparação de Pulmões por ex vivo Imagens ao vivo
NOTA: Tente trabalhar como estéril e cuidadosa quanto possível para evitar a desnecessária desafios de células imunes dentro dos pulmões.
- Injectar o rato por via intraperitoneal (ip) com uma sobredosagem letal de um anestésico permitida pelo protocolo animais aprovados pelo IACUC, por exemplo., 1 ml de Avertin 2,5%. Aguarde até que o mouse para parar de respirar e ser completamente não-responsivos a estímulos nocivos (pata traseira pitada).
NOTA: deslocamento cervical e os eutanásia dióxido de carbono deve ser evitado, pois pode afectar negativamente a viabilidade das células do pulmão. - Imobilizar o rato em uma placa de dissecção e esterilizar o mouse com 70% de etanol.
- Use tesouras cirúrgicas primeiro fazer uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguido por uma incisão semelhante através do peritoneu. Segure a placa de dissecção na posição vertical e cortou a aorta descendente, de modo que as piscinas de sangue para baixo no abdômen e não na cavidade torácica.
- Sbeliscar uma pequena abertura no diafragma para libertar vácuo. Corte ao longo da nervura 10 e 12 para excisar o diafragma e tenha acesso visual para os pulmões.
- Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele até à traqueia através da caixa torácica, mas deixar a caixa torácica intacta. Separar a pele da caixa torácica. Expor a traqueia através da remoção do tecido conjuntivo circundante, tomando cuidado para não danificar o próprio (Figura 1A) traqueia.
- Cortar uma pequena abertura aproximadamente 1 mm de diâmetro na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos, tão perto quanto possível da laringe (Figura 1B). Tenha cuidado para não cortar completamente através da traquéia.
- Dê uma agulha G 20 e gentilmente inserir a agulha 4-5 mm na traqueia, sem qualquer força contrária (Figura 1D). A extremidade da agulha deverá ser visível através da traqueia (Figura 1C). Use uma pinça para estabilizar a agulha na traqueia. Alternativamente, um fio de sutura pode ser amarrado Around a traqueia para manter a agulha no lugar.
NOTA: Através da inserção muito profunda, a carena pode ser traumatizada ou apenas um lado dos pulmões pode ser insuflado. - Encher uma seringa com 400 ul de 37 ° C de agarose de ponto de fusão de baixa temperatura a 2% (feita directamente a partir de um banho de temperatura constante). Verifique se a placa de dissecção está de pé e, lentamente, incutir a agarose quente através da agulha para os pulmões, usar ~ 400 ul para inflar os pulmões.
NOTA: Assista os pulmões inflar dentro da caixa torácica. Não excesso de inflar o pulmão como ele irá se romper. - Uma vez que os pulmões são inflados, enchendo ~ ⅔ da caixa torácica, retire a seringa e manter a agulha no interior da traqueia para evitar qualquer agarose vazem.
- Pour aproximadamente 50 ml de PBS 20 ° C ao longo dos pulmões inflados para permitir que a agarose dentro dos pulmões para definir e solidificar. retirar a agulha devagar e fechar a traqueia com uma pinça para evitar qualquer não-solidificou agarose vazem. </ Li>
- Expor os pulmões através da realização de uma esternotomia e subsequentemente excisar os pulmões. Para a excisão dos pulmões, segurar a traqueia, enquanto cortando a traqueia completamente. Puxe cuidadosamente a traqueia para cima, cortar o tecido conjuntivo e do esôfago enquanto puxa os pulmões para fora da cavidade torácica, até os pulmões é separado do rato (Figura 1E).
- Mergulhe os pulmões em warm RPMI-1640 para lavar excessiva de sangue e delicadamente separar os lóbulos usando tesouras e pinças para cortar brônquio principal dos lobos na hilo (Figura 1F).
- Colocar os lóbulos, com a superfície plana virada para baixo para maximizar a superfície de imagem, em um poço de uma placa de imagem de 24 poços (Figura 1G). Adicionar 100 ul de 37 ° C, meio RPMI-1640 por cima dos lóbulos. Coloque várias 15 mm tampa desliza microscópio circular em cima dos lóbulos para evitar que ele flutua.
- Despeje quente PBS nos poços ao redor para evitar a mídia RPMI-1640 de evaporating. Inserir a placa de 24 poços na câmara climatizada equilibrada e manter os lobos pulmonares a 37 ° C com ar e 5% de CO 2. Inserir a câmara climatizada na fase do microscópio confocal.
NOTA: Outras misturas de gases (por exemplo, 5% de O2, 5% de CO 2 em N 2 para examinar o comportamento das células sob condições de hipoxia / oxigénio inferior) também poderia ser considerado.
Figura 1. Protocolo para a preparação dos pulmões para geração de imagens ao vivo. (A) A exposição da traquéia após a preparação do mouse. (B) pinas pequena feita na traqueia exposta paralela aos anéis cartilagíneos. (C) 20 G agulha inserida 4-5 mm na traqueia. (D) A instilação de 400 ul de 2% de baixo ponto de fusão à temperatura de agarose para os pulmões. (E) Inflpulmões ated separado do mouse. (F) Lobes separados após a inflação. (G) lóbulos colocado em um poço de uma placa de imagem de 24 poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Aquisição e Análise de Imagens
NOTA: As imagens podem ser adquiridas com uma variedade de fiação de disco microscópios confocal apoiados por vários programas de software. Neste protocolo, quer μManager com um giro de disco microscópio confocal feito por encomenda ou Zen com um disco giratório microscópio confocal comercialmente disponível é utilizada para a aquisição de imagem, enquanto Imaris é usado para edição de filmes e análise.
- Adquirir imagens usando μManager. Um detalhado passo a passo protocolo para a aquisição de imagens usando software μManager é descrito anteriormente 18.
OU - adquirir imagensusando a imagem de software de análise, tais como Zen (ver figura S1).
- Clique na guia 'Localizar', e escolha objetiva (10x ou 20x) no "Caminho de Luz" ferramenta (Figura S1A, caixa vermelha). Posteriormente, clique em 'Eyes - DAPI' olhar para o canal PCP através da ocular (Figura S1A, caixa azul). Localize a amostra manualmente usando o microscópio. Clique em 'All Off'after o tecido é o centro do campo de visão.
- Clique na guia "Aquisição" para definir todos os parâmetros para aquisição de imagem.
- Na ferramenta "canais", clique no botão '+' (Figura S1B, caixa vermelha). Um menu pop-up aparece e procurar o corante (s) presente na amostra no 'Dye banco de dados' (Figura S1B). Selecione o corante e clique em "Adicionar".
NOTA: O programa irá definir todos os filtros de ser otimizado. Um corante pode ser suprimidoselecionando-o seguido, clicando no botão da lixeira (Figura S1B, caixa amarela). - No menu "Modo de Aquisição", set 'Binning' para 5x5. Clique duas vezes no ECFP no menu de canais para a seleccionar. Diminuir a potência do laser para 20% assim que a amostra não será branqueada ao configurar os parâmetros para aquisição de imagem.
- Marque a caixa "Azulejo 'na seção' Experiment Manager 'e a ferramenta de telhas aparece no grupo de ferramentas" Multidimensional Aquisição "(Figura S1C). Clique no botão 'Configuração Avançada' para ver a imagem ao vivo da câmera. Clique no botão "Adicionar" na seção "Posições" para adicionar 4 a 6 posições para o experimento. Para excluir uma posição, selecione a posição e clique no botão de lixeira.
- No grupo de ferramenta "Aquisição Parâmetro ', abra a ferramenta' estratégia de foco ', e selecione' Absolute fixa Z-position 'na lista suspensa.
- Marque a caixa Z-Stack na seção 'Experiment Manager' ea ferramenta Z-Stack aparece no grupo de ferramentas a «Aquisição Multidimensional '(Figura S1D). Clique duas vezes em uma das posições na secção "Posições" e pressione 'Live'. definir manualmente primeiro e definir última posição do campo de imagem. Defina o intervalo para 4 mm.
NOTA: O programa irá determinar o número de fatias para a gama escolhida e do intervalo. Idealmente, 5-7 fatias são convenientes para permitir a visualização suficiente e aquisição de imagem rápida. - Marque a caixa "Série Time 'na seção' Experiment Manager '. Set desejado 'Duração' e os tempos de "intervalo" na ferramenta 'Time Series ", que apareceu no grupo de ferramentas' Multidimensional Aquisição" (Figura S1E).
- No 'AcquisiModo ção 'de menu, defina "Binning' para 2x2. Dê um clique duplo em um fluoróforo no menu de canais para selecioná-lo e aumentar a potência do laser a 100%. Pressione 'Live' e ajuste o 'Tempo de Exposição ". Repita esse procedimento para cada fluoróforo.
- Marque a caixa "Ativar Auto Save". Selecione uma pasta e digite o nome do arquivo. Todas as imagens adquiridas serão salvas automaticamente nesta pasta.
- Clique em 'Start Experiment' na seção 'Experiment Manager' para começar a aquisição de imagem.
- Após a aquisição da imagem, compilar os dados brutos em software Imaris. Converter imagens para .IMS arquivos e ajustes podem ser feitos. Um detalhado passo a passo protocolo para a conversão de arquivos, fazendo ajustes e filmes salvar usando Imaris é descrito anteriormente 18.
- Ao salvar o filme, defina o "Frame Rate" 5 quadros por segundo (fps).
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Representative Results
Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, vários sistemas modelo rato e injectáveis, o microambiente metastático pode ser visualizado e rastreada ao longo do tempo. Usando um MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; modelo de ratinho transgénico triplo EGFP c-fms, diferentes componentes celulares são marcado de forma fluorescente (Figura 2A, um filme). A estrutura típica do parênquima pulmonar pode ser visualizado no canal PCP uma vez que todas as células expressam ECFP sob o promotor β-actina. Maiores metástases pulmonares / multicelulares são facilmente resolvidos como eles aparecem como uma massa de células dentro da estrutura do pulmão organizado. Células mielóides são visualizados no canal de GFP por meio de c-fms -EGFP expressão, que é o transgene para RFCE-1 12. Células mielóides são muito dinâmicas à medida que migram ao longo do campo de imagem. C-fms células -EGFP-positivos são mais abundantes e migratória no parênquima pulmonar em comparação com aqueles em contato próximo com o pulmãometástase. A dinâmica de células mielóides e as suas interacções com metástases pulmonares pode ser seguido em tempo real, durante várias horas.
Para examinar a sementeira metastática e o crescimento, um modelo de metástase experimental é utilizado (Figura 2B, Filme 2). As células tumorais GFP + VO-PyMT foram injectadas num tipo selvagem, rato não-repórter e deixado sobre as sementes e crescer durante 2 semanas. A estrutura do pulmão é claramente visível no canal de GFP devido a autofluorescência dos pulmões. No entanto, as células VO-PyMT ainda são facilmente distinguíveis a partir da estrutura de pulmão, uma vez que tem uma forma redonda e uma maior expressão EGFP assim parecer mais brilhante, em comparação com o parênquima pulmonar. VO-PyMT motilidade celular pode ser observado no interior da lesão metastática estabelecida.
interacções celulares entre metastática e as células imunitárias no microambiente pulmonar também pode ser examinada utilizando o modelo de metástase experimental. Duas semanas depoisinjecção de células VO-PyMT, marcado por fluorescência Gr-1 647 anticorpos conjugados são injectados IV 5 h antes da excisão do pulmão (Figura 2C, filme 3). No lado esquerdo do campo de imagem, duas Gr-1 + células mielóides estão interagindo com uma célula VO-PyMT. Uma lesão metastática é observada do lado direito do campo de imagem. Ao longo do tempo, as células Gr-1 + são recrutados para a lesão metastática. A seguir a lesão metastática, uma das células Gr-1 + interage com uma célula de perto VO-PyMT. Eventualmente, a célula VO-PyMT desaloja, desengatar a partir do + celular Gr-1.
Combinando modelos de ratos transgênicos repórter com o modelo de metástase experimental e anticorpos injetáveis rotulagem células do sistema imunológico produz um filme de três cores. Uma semana após a injecção de células-VO PyMT num murganho repórter ACTB-ECFP, 647 anticorpos conjugados marcados fluorescentemente Gr-1 são injectados IV 5 h antes da excisão do tecido (Figura 2D, filme4). células Gr-1 + vigorosamente migrar dentro do campo de visão, enquanto um único GFP + células metastática é visível no centro do campo de imagem.
Injetando diferentes dextranos fluorescentes em ratos repórter, que anteriormente eram injetados com células metastáticas, pode render um filme de quatro cores (Figura 2E, Filmes 5-6). Eventos precoces no semeadura de metástase pode ser estudada quando as células VO-PyMT são visualizados imediatamente e quatro horas após a injecção iv em ratinhos repórter ACTB-eCFP. A injecção do conjugado com rodamina, 70 kD e 10 kD de dextrano dextrano conjugado com um marcador fluorescente 647 permite a visualização dos capilares pulmonares. A utilização de dextranos de peso molecular mais baixo e mais elevadas podem potencialmente ser utilizados para detectar alterações da permeabilidade dos capilares dos pulmões, uma vez que as moléculas de baixo peso molecular extravasar mais rápido em comparação com os de alta peso molecular 19. embora Cellul eventos Ar pode ainda ser eficaz estudada, do filme 5 é um exemplo de uma deriva de tecido. Se necessário e, no caso o tecido não pode ser reposicionada durante a sessão de imagens, isso poderia ser corrigido durante analisa a aquisição de imagem post.
Este sistema permite que um, quatro cores de aquisição de imagem contínua rápida a seguir tipos diferentes de células marcadas por fluorescência dentro do microambiente do pulmão metastático. Este protocolo também permite a visualização de metástase de tamanhos diferentes, de eventos relacionados com a semeadura de células cancerosas individuais a metástases estabelecidas. Além disso, células tumorais e de células do estroma movimento pode ser visualizada dentro do microambiente do pulmão, juntamente com os vasos sanguíneos. Tipicamente, movimento celular pode ser observado durante pelo menos 4 horas a partir do início da sessão de imagem. A observação de diferentes microambientes metastáticos dentro do mesmo tecido pulmonar ajuda a evitar a variabilidade rato-a-rato.
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Figura 2. Imagens representativas de filmes adquiridos por imagens ao vivo. (A) Instantâneo de uma pilha Z resultante da fusão de filme 1 mostrando células mielóides associadas a uma metástase pulmonar (insert amarelo) versus aqueles associados com o parênquima pulmonar (insert vermelho). (B) Instantâneo de uma pilha Z resultante da fusão de filme 2 mostrando GFP + células metastático em um modelo de metástase experimental. A seta aponta para uma célula metastático móveis. (C) Instantâneo de uma pilha de Z a partir de filme 3, que mostra a co-localização dos sinais fluorescentes a partir de um GFP + metástase e Gr-1 + células visualizados por um anticorpo Gr-1 conjugado com uma marca 647 (seta vermelha). Verdes seta aponta para a GFP + células metastático que desalojado do volume metastático. Branca seta aponta para a Gr-1 + célula que interagiram com a célula GFP + VO-PyMT móveis. (D) Instantâneo deuma pilha incorporada Z do filme 4 mostrando células GFP + VO-PyMT, no rato ACTB-ECFP. Uma única célula VO-PyMT é visível no centro (seta verde). O animal foi injectado com o anticorpo conjugado com Gr-1 647. (E) representativas Z-pilha de filmes 5 e 6, que mostra os vasos sanguíneos no pulmão de ratos sacrificados imediatamente após a injecção de 70 kD rodamina-dextrano (seta vermelha) juntamente com as células GFP + VO-PyMT (verde). Barras de escala são 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementares Figura 1. As capturas de tela de software da câmera ZEN para aquisição de imagens. (A) Em primeiro lugar, na ferramenta 'Path Light' o objetivo direito deve ser escolhido (caixa vermelha) e the tecido ser localizada no microscópio. Adicionado (caixa amarela) (B) Configurar canais para aquisição de imagem, na (caixa vermelha) canais de ferramentas "canais" podem ser excluídos ou. (C) Na ferramenta 'azulejos, posições diferentes podem ser adicionados para o experimento. (D) Na ferramenta 'Z-Pilha', o Z-pilha pode ser ajustada e a espessura das fatias pode ser ajustada. (E) A ferramenta 'Série Time', a duração eo intervalo pode ser definido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. (Clique direito a download). Interações entre uma metástase pulmonar e sur. arredondamento células imunes utilizando ratinhos transgénicos repórter Este filme apresenta uma metástase no pulmão de um triplo transgénica MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP rato em que todas as células são marcadas com ECFP e células mielóides são rotulados com EGFP. A metástase pode ser observado como uma massa de células em azul em contraste com a arquitectura pulmonar normal. C-fms + células mielóides migrar ao longo de todo o campo de imagem. Este filme é um 2 horas 1 min aquisição.
Filme 2. (clique com o botão direito para baixar). Motilidade celular Câncer, em um modelo de metástase experimental. Este filme mostra uma metástase pulmonar gerada pela injeção intravenosa de células GFP + VO-PyMT (verde) em um tipo selvagem, não-repórter, mouse. Os pulmões foram colhidas duas semanas após a injecção de VOcélulas -PyMT. células GFP + estão se movendo dentro da massa metastática. Este filme é um 4 h 40 min tempo de aquisição.
Filme 3. (Clique direito a download). O recrutamento de células do sistema imunológico visualizadas por anticorpos fluorescente conjugado com estabelecida experimentalmente metástase. Este filme mostra uma metástase pulmonar gerada pela injeção intravenosa de células GFP + VO-PyMT (verde) em um tipo selvagem, não repórter, mouse. Os pulmões foram colhidas duas semanas após as células VO-PyMT foram injectados. Gr-1 + células são marcadas com anticorpo conjugado com Gr-1 647 e observado no canal de infravermelho próximo (branco). Note-se que as células Gr-1 são recrutados para a metástase GFP +. Este filme é um exemplo de uma aquisição a longo prazo, de um total de 11 h 27 min.
Filme 4. (clique com o botão direito para baixar). Motilidade das células imunes visualizadas por anticorpos fluorescente-conjugados em um rato transgénico repórter injectados com células metastáticas. Este filme mostra uma única célula GFP + VO-PyMT no pulmão gerado pela injeção intravenosa de VO- células PyMT (verde) em um rato ACTB-ECFP. Os pulmões foram retirados uma semana após células VO-PyMT foram injectados. Gr-1 + células são marcadas com anticorpo conjugado com Gr-1 647 e observado no canal de infravermelho próximo (branco). Este filme é um 2 h 40 min tempo de aquisição.
Filme 5. (clic direitok para download). células metastáticas e capilares visualizados por dextranos fluorescentes imediatamente após a injecção iv em um rato repórter transgênicos. Este filme mostra a metástase experimental gerado pela injeção intravenosa de células GFP + VO-PyMT (verde) em um rato ACTB-ECFP juntamente com o injecção de conjugado com rodamina, 70 kD dextrano (vermelho) e de 10 kD de dextrano conjugado com um marcador fluorescente 647 (branco), para marcar os vasos sanguíneos. Este filme é um exemplo de uma deriva de tecidos e é um tempo de aquisição de 18 min.
Filme 6. (Clique direito a download). Células metastáticas e capilares visualizados por dextranos fluorescentes várias horas após a injecção iv em um rato transgénico repórter. Este filme mostra a metástase experimental gerard por injecção IV das células GFP + VO-PyMT (verde) num murganho ACTB-ECFP, juntamente com a injecção de rodamina conjugada, 70 kD dextrano (vermelho) e de 10 kD de dextrano conjugado com um marcador fluorescente 647 (branco), para marcar vasos sanguineos. Os pulmões foram obtidos 4 h após a injecção das células VO-PyMT. Este filme é uma longa aquisição 19 min.
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Discussion
Este manuscrito descreve um método detalhado para ex vivo imagens ao vivo da metástase pulmonar em modelos de ratos com metástases. Este protocolo de imagem fornece uma visualização direta das interações tumor de células-estroma dinâmicas e espaciais dentro do microambiente do pulmão. É um método relativamente fácil e rápido que permite imagens de confiança de metástases do pulmão durante pelo menos 4 h. Filmes adquiridos a partir destas experiências pode ser utilizada para controlar processos dinâmicos como a motilidade celular e interacções celulares.
Dois métodos para a geração de metástases pulmonares foram descritos: um modelo de rato geneticamente e a utilização de uma linha celular manipulada. O modelo do rato MMTV-PyMT recapitula a progressão do câncer de mama e metástase pulmonar espontânea. Outras técnicas que recapitulam disseminação metastática também estão disponíveis, por exemplo., O transplante ortotópico de células na glândula mamaria de 20. Uma via intravenosa injetada VO-PyMT clinha de ell é usado para imitar a semeadura e crescimento de metástases do cancro da mama. O subsídio de tempo para crescimento celular VO-PyMT depende da preferência experimental para o estágio de metástase pulmonar. Dependendo do número de células injectadas, micrometástases pode ser observado no prazo de vários dias a 2 semanas após a injecção das células VO-PyMT.
Para imagens de pulmão ideal, muito cuidado deve ser tomado durante a inflação dos pulmões. Para a inflação adequada, a agulha só deve ser inserida 4-5 mm na traqueia. Mais profundo inserção da agulha pode resultar em inflação parcial, de um lado dos pulmões. Além disso, os pulmões devem ser observados durante a inflação real para evitar o excesso de inflação que pode resultar em danos nos tecidos. Além disso, é crucial manter o pulmão como estéril quanto possível de modo a que as células imunes do pulmão não será posta em causa.
Para cada experimento imagens ao vivo, o melhor equilíbrio entre a quantidade de aquisição de dados e the potencial de danos nos tecidos causados pela exposição excessiva do laser tem de ser considerado. É importante para otimizar as configurações para aquisição de imagem, executando experiências-piloto. Além disso, recomenda-se manter a potência do laser para baixo enquanto procura por campos ideais de vista e / ou manter o obturador off quando as imagens não são adquiridos.
A motilidade do cancro e / ou células imunes de interesse é um dos principais indicadores para a vitalidade das células. Motilidade é sensível à temperatura, níveis de oxigênio e fototoxicidade 7. No entanto, a inibição ou ausência de motilidade não pode ser relacionado com as condições de imagiologia ou problemas técnicos, mas biológica. A inibição da motilidade pode resultar de um determinado efeito terapêutico ou de detenção de células metastáticas imediatamente antes da sua proliferação na microvasculatura pulmonar e do seu extravasamento para o parênquima pulmonar 21,22. Por conseguinte, pode ser importante para corroborar tais dados usando adicionaltécnicas (como ensaios de migração na cultura 2D) 23.
Além disso, este método de imagiologia ex vivo pulmonar é suficiente para um estudo de curta duração que não requerem a microcirculação pulmonar. Usando este método, o movimento de cancro e / ou células do sistema imunológico é observada durante pelo menos quatro horas. Antes da aquisição da imagem, leva cerca de 30 minutos para preparar os pulmões e 30-60 min para encontrar posições para aquisição. Embora a motilidade celular é observado para além de quatro horas (até 11 horas, filme 3), imagiologia prolongada depende dos tipos de células particulares estudadas, as condições utilizadas (por exemplo., A redução de oxigénio), e deve ser determinado para uma montagem experimental particular. Além disso, devido à falta de microcirculação e o eventual impacto das alterações pós-morte ou no caso de haver uma razão para a necessidade de verificar os resultados, na presença de uma microcirculação intacta, a imagiologia intravital pulmão com uma janela de aspiração torácica pode ser utilizada. No entanto, é still um desafio realizar imagem de pulmão intravital em vários dias, utilizando uma janela de imagem como foi executado no cérebro, glândula mamária e órgãos abdominais 5 devido a dificuldades na manutenção da pressão negativa suficiente. Como um método alternativo para a perfusão de pulmões intactos ex vivo, o método de pulmão isolado-perfundido foi anteriormente utilizada para estudar a metástase pulmonar. No entanto, este método é usado frequentemente para animais maiores. Desde os ratos têm menores cavidades torácica, que representam um verdadeiro desafio para perfusão efetiva 24.
Devido à dispersão da luz, a profundidade da imagem do microscópio confocal de disco rotativo é limitado. Como consequência, a visualização dinâmica de células e interacções celulares é restrita a metástase pulmonar superficial. As metástases pulmonares são enriquecidos na periferia dos pulmões já que as células metastáticas está confinado pelos capilares que diminuem de tamanho para as margens exteriores do pulmão 1. Além disso, é eASier para manter a viabilidade das células mais perto da superfície do pulmão como eles têm preferido o acesso a meios de comunicação e de oxigénio. Para permitir a visualização mais profundamente nos pulmões, imagens ao vivo de secções de pulmão pode ser realizada. No entanto, deve ser esperado quantidade considerável de morte celular. Alternativamente, microscopia multifotônica pode ser conduzida, permitindo uma maior penetração nos tecidos. Além disso, a imagem latente multifotônica gera um sinal óptico intrínseca, chamada segunda geração-harmónica (SHG), que permite a visualização das estruturas não-centrossimétricos na matriz extracelular, tais como o colagénio 1 fibras.
Como se mostra neste estudo, o tumor e o comportamento de células imunes em metástases do pulmão pode ser seguido e analisados utilizando ratinhos repórter fluorescentes, as células de tumor manipuladas e marcadores ou anticorpos marcados com fluorescência. Esta metodologia pode ser modificada para o estudo de outras células e determinantes dentro do microambiente metastático. Para este fim, existem vários trratinhos repórter ansgenic disponíveis para estudo de células do estroma incluindo aqueles para os fibroblastos como FSP1-EGFP 4, alfa-SMA-RFP 25 e COL1A1-EGFP 25 ou células endoteliais como Tie2-GFP 26.
A coloração celular em secções de pulmão ao vivo foi realizada para visualizar populações de células imunes 8. Esta estratégia coloração pode ser adotado como uma alternativa para multi-color captura de imagem. No entanto, a maioria dos marcadores frequentemente rotular várias populações de células, em vez de uma população celular distinta. Os injectáveis que são absorvidos pelas populações de células específicas 4 ou anticorpos marcados fluorescentemente contra marcadores celulares adicionais podem ser usadas para diferenciar ainda mais entre as populações. A utilização de diferentes cores fluorescentes para marcar as várias células de interesse é o preferido para a imagiologia. Nos casos em que o uso de diferentes corantes fluorescentes não pode ser realizada (por exemplo., Devido a elá imagiologia limitadoELS), é possível para a imagem de diferentes tipos de células repórteres fluorescentes com os mesmos, desde que eles são facilmente distinguíveis pela forma e / ou localização anatómica.
Além de estudar vários tipos de células, várias classes de agentes quimioterapêuticos são fracamente fluorescente (tal como doxorrubicina). Estes agentes quimioterapêuticos podem, em princípio, ser utilizado para visualizar a entrega de drogas e de distribuição em metástases do pulmão de um modo semelhante como no tumor primário 19. Outros agentes terapêuticos que podem ser alvejados marcados com fluorescência também pode ser utilizado em imagiologia ex vivo pulmão. Nomeadamente, os dados adquiridos com a imagiologia de pulmão pode ser mais informativo sobre o qual células tomam-se estas drogas e a sua interacção com outras células, no microambiente metastático em adição ao extravasamento desses agentes terapêuticos a partir de vasos sanguíneos activos. Esta técnica pode ser também utilizada para o estudo de cancro primário do pulmão ou 27 adaptada para o estudo de outro pulmãopatologias relacionados com que podem afetar o microambiente do pulmão 28,29.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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