Protocol
研究伦理的声明 ：所有涉及此详述动物实验是受规则和UNC委员会动物护理的法规和标准NIH为照顾和使用实验动物。
1.准备和游离皮层神经元的电镀
- 通过CO安乐死定时怀孕女2吸入颈椎脱位。从每个半球胚胎天15.5（E15.5）小鼠和microdissect皮质的头骨取下整个大脑。有关胚胎小鼠皮层的显微请Viesselmann 等 8详细说明。
- 放置在1ml解剖媒体的不超过4皮质在无菌1.6毫升微型管。加入120微升10X胰蛋白酶和翻转试管3 - 5次混合。
- 使用血球，细胞计数种子细胞培养皿。注意事项：1半球皮质APPR提供oximately 3000000细胞。
- 对于耐SDS SNARE复合生化检测，每板35mm培养皿6000000细胞，并利用每个条件两道菜。注：这是通过比较多个条件时，使用6孔板简化。
- 为支化测定法，对硝酸板神经元在15万的密度以每35mm培养皿250,000个细胞的密度洗涤圆形盖玻片，对轴突分枝板的DIC成像。这些密度避免拥挤和简化分析。
- 活细胞的TIRF显微镜，悬浮每转2000000神经元在RT核转染溶液。
- 加入100微升细胞悬浮液，以微管，根据制造商协议9含有VAMP2-pHlourin表达质粒电穿孔的10微克带有nucleofector。
- 转染后立即加入500μl胰蛋白酶淬火介质，在书房移除试管和细胞板停牌每35毫米PDL镀膜玻璃底菜400,000个单元格的减到。
- 板上的所有皮层神经元在2毫升无血清培养基。
2. SNARE复合体形成分析
注：耐SDS SNARE复合物加工成最初描述与10下文详述的修改进行分析。为了证实有效的替代抗体，在这里使用的那些，请参阅材料部分。
- E15.5刺激皮层神经元2天体外 （DIV）250毫微克/毫升导蛋白1或假控制裂解前1小时。
- 前处理的样品，凉爽离心机至4℃，并设置水浴温度至37℃，并加热块到100℃。
- 从孵化器中取出细胞的菜肴，置于冰上。
- 从细胞中吸出培养基，替换为约2ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻2次，1 - 每次洗涤2分钟。
- 对于该测定，使用每个COND 2孔银行足球比赛。
- 抽吸PBS从条件的第一阱和替换用250微升匀浆缓冲液。留在冰上5分钟，然后使用细胞升降机，匀化细胞在冰上。
- 从相同的条件下的下一个孔吸出PBS和最近匀浆混合物添加到孔中。这会增加蛋白浓度。重复所有条件。
- 完成后，吸管匀浆溶液到预先冷却1.6毫升微型管在冰上，加入20％的TritonX-100，达到1％的TritonX-100的最终浓度。磨碎，同时尽量减少泡沫与1000微升吸管搅拌了10倍。
- 在冰上孵育管2分钟以溶解的蛋白质。在6,010 RCF在4℃下培养后，离心10分钟以沉淀非溶解材料。移动裂解上清液进入冰冷冻新1.6毫升管。
- 用Bradford法进行11蛋白浓度分析和稀释样品到国际泳联3 L蛋白浓度 - 5毫克/毫升剩余补充有1％的TritonX-100和5×样品缓冲液补充有B-巯基乙醇（BME）的匀浆缓冲液。
- 平均分配每个实验样品放入试管2。在37℃下进行30分钟（SNARE复合物），以及其他的在100℃下进行30分钟（SNARE单体）孵育一个样本。反转管间歇性地将样本保持在溶液中。
- 在-20℃冷冻样品直至准备通过SDS-PAGE分离。前用标准技术通过电泳样品，再沸腾先前煮沸样品在100℃5分钟，但在RT解冻37℃的样品。
- 样品的运行重复（30 - 40微克每个样品的蛋白质）在两个8％和15％的凝胶;的8％提供了复杂的理想分离，而15％被用于量化SNARE蛋白单体（SNAP-25〜25kDa，VAMP2〜18kDa，突触-1〜35kDa的）。在70 v使电源直到染料行是通过STAC王露和增加电压90V。运行凝胶，直到染料逃跑。
- 为了保持单体，使用冷转移缓冲液，用20％甲醇（MeOH）加入，在70 V代表45分钟传送在冰上蛋白至0.2μm硝酸纤维素膜上。
- 在盖菜2小时到0干膜/ N在室温（O / N提供了最好的结果）。
- 块SNARE，在10％牛血清白蛋白（BSA）复合膜在RT 1小时。
- 以1:1的稀释度制备一抗（识别特定SNARE复合组件）：1000和探针O / N在4℃的旋转振荡器上。
- 冲洗在Tris缓冲盐水加0.1％吐温20（TBS-T），每次5分钟，3次印迹。
- 以1:1的稀释度制备的荧光第二抗体的解决方案：在TBS-T 20,000在1％BSA和探头1小时，覆盖在RT。 1小时后，重复步骤2.12.1。
- 荧光扫描机的图像印迹配有软件套件和定量两种SNARE蛋白合作mplex（以上40kDa免疫反应条带）和单体谱带（25 kDa的，18kDa的，35kDa的用于SNAP-25，VAMP2免疫反应条带和突触-1，分别地）使用制造商的说明用于绘制矩形的ROI。
3.成像胞吐通过TIRF显微镜活动
注意：此协议需要专门显微镜设备，包括一个环境室，以保持温度，湿度和CO 2，配备有表面荧光照明，高倍率/高数值孔径（NA）的TIRF目标，一个自动XYZ台一个倒置的TIRF显微镜，和敏感电荷耦合器件（CCD）检测器。该协议使用配备了100倍1.49NA TIRF目标固态491 nm激光和电子倍增CCD（EM-CCD）的全自动倒置显微镜。所有设备由成像和激光控制软件控制。此前开始的ENVIR成像协议电源onmental室，舞台，灯，计算机和摄像机。
- 成像软件中选择目标。一旦该目标是到位，拧紧领围绕目标加热器。
- 确认目标是在舞台插槽固定阶段孵化器之前完全降低。倒入蒸馏水注入阶段培养箱入口均匀，以防止溢出。
- 打开孵化系统。打开阀门到CO 2罐和确认的压力是适当的每个制造商的说明该系统。允许腔一些时间来达到5％的CO 2和37℃。之前加入的摄像培养皿，放置一个空盘在孵化器，以避免对目标冷凝水。
- 功率激光源。
- 开阶段培养箱和浸油添加到该透镜。将样品中的孵化器，并与稳定的武器或一盘菜的重量稳定。提高物镜直到油使与样品的底部接触。 SWITCh至透射光照明，并通过目镜发现神经焦平面。
- 启动激光软件并连接到激光控制软件。设置照度广角并选择正在使用的目标（建议100X 1.49 NA TIRF）。样品的设定折射率（细胞〜1.38）。通过取消选中“TTL”为491 nm激光调节激光强度。调整滑块到100，然后把它回落到一个值之间20 - 40％。重新检查“TTL”。
- 在透射光照明再次聚焦样本。转到成像软件，并选择491 nm激光照明和开启快门。细调整天花板上的激光的焦点和中心的点与除去冷凝器闭合场光阑的中心。将聚光光学板凳上倒挂，以免划伤镜头。
- 更换冷凝器和去TIRF软件，并设置穿透深度（PD）到110纳米。从切换广角照度TIRF ILLUM萌发的模式进行成像。
- 查找VAMP2-phluorin采用宽视场落射荧光与啶光源表达通过目镜细胞。
- 调整摄像参数（曝光时间，增益和激光功率），使用最小的曝光时间和激光强度以减少漂白和光毒性（例如最大化信噪比和动态范围：50之间的曝光 - 100毫秒，用15 - 30获得30％的最大激光功率）。
- 每单元设置连续自动对焦。获取图像时光倒流与并购发生的每0.5秒5分钟设置。为的netrin-1刺激的情况下，1的netrin-加入500纳克/毫升的细胞的培养皿在层流罩和盘返回到培养箱中成像前1小时。
- 要在开放的ImageJ图像堆栈通过将文件拖动到窗口或将文件>打开>文件名 （ 图量化每个单元面积和时间归胞吐事件的频率0; 2A插图1）。
- 要除去稳定的荧光信号，不代表囊泡融合事件，创建一个使用图像>栈> Z-项目>投影类型整个堆栈的平均ž预测：平均强度。从每个图像使用过程中的缩时>图像计算器减去这意味着图像> Image1的：你的栈操作：减去IMAGE2新创建的平均ž投影。这强调胞吐事件（ 图2A插图2 - 3）。
- 由伯爵眼外融合的事件。胞吐事件被定义为受衍射限制的荧光信号，从而迅速扩散作为VAMP2-phluorin质膜（ 图2A插图6）内扩散的外观。
- 使用阈值命令用图片来突出第一图像>调整>阈值>直到整个细胞是门槛凸显（ 图2A插图7 - 8）调整滑块。
- 在安娜lyze，选择SetMeasurements和检查区和显示标签。选择使用棒跟踪工具，然后按“M”来衡量（ 图2A插图7 - 8）阈值的蜂窝区。
- 转让双方外融合事件计数，细胞面积测量，并经过成像时间到电子表格来计算（ 图2A插图9）的胞吐事件/毫米2 /次号码。
4.微分干涉对比（DIC）轴突分支的显微缩时
注：完整的协议与示范的一般方法DIC成像可用12。虽然这种协议利用DIC时，也可以使用其它的透射光显微术的方法为相同的目的（例如：相衬）。
- 在2 DIV，包含预热的环境室未转染的神经元发生玻璃底菜成像，以保持潮湿ENV用5％的CO 2和37℃ironment。利用最佳的图像质量和分辨率装有60X计划复消色差透镜的显微镜，1.4的NA DIC物镜和高NA冷凝器。
- 调整焦平面发现通过使用透射光照明目镜神经元。
- 在使用图像软件多区域采集功能，找到并节省至少6个细胞的XYZ位置。阶段的位置，使的视图以取得最佳效果的领域内感兴趣拟合神经元。
- 250纳克刺激/ ml的导蛋白1，然后按“启动多区域获取”。在每个位置顺序地获取图像每20秒24小时，暂停采集和再聚焦是必要的。
- 查看使用应用程序中的图像处理软件图像>查看多维数据>打开的文件名。鉴定稳定轴突分支（20微米长）的成像会议期间的形式。用画线工具来测量一个stableaxon branc从在轴突到尖端的基部小时以确保在20微米长度资格得到满足。
- 在电子表格中，记录帧号的netrin刺激后当膜的突起中时新生的分支达到20微米的长度，其中分支以后形成以及netrin的刺激后的帧号码的区域开始。
- 由20秒乘以突起和分支地层之间的帧的数目来计算每个分支的形成时间。
5.毒素操作和固定细胞免疫荧光
- 在2 DIV，治疗中的实验条件下的神经元用250纳克/毫升的netrin-1和/或10nM的A型肉毒毒素（BONTA），其裂解SNARE蛋白SNAP25和有效地抑制SNARE介导的胞吐13，再加上250纳克/毫升netrin- 1。留下一组神经元未处理作为控制条件的。
注意：BONTA需要用眼和呼吸道的防护的准备和使用时，解决方案。尽快维护所有被污染的材料的生物危险材料和高压灭菌。 - 在3 DIV（24小时后处理）抽吸介质，并立即与至少1毫升PHEM修复（详情见表1）更换加热到37℃。孵育在室温黑暗中20分钟。
- 用PBS冲洗3倍（以备将来使用密封用封口膜和储存在4°C）。
- 在黑暗中，加湿染色室地方盖玻片和透化细胞膜在新鲜稀释的0.2％的TritonX-100的PBS 10分钟（从10％的TritonX-100的库存。制造）。
- 除去透化溶液，并用50微升1×的用PBS冲洗。块，用于在30分钟内约10％牛血清白蛋白的50μl的在PBS（BSA-PBS），或10％在RT水煮驴血清在PBS中。
- 用1X PBS冲洗一遍。孵育盖玻片在50μl初级抗体（1：1000βIII微管蛋白，以确认神经同一性）在1％BSA-PBS在RT 1小时， 在黑暗中。
- 在PBS进行3次5分钟洗涤。孵育盖玻片在50μl光谱上不同的第二抗体对微管蛋白（1：400），和荧光鬼笔环肽（通过激发而异：488鬼笔环肽在1：400，647鬼笔环肽在1：100），在1％BSA-PBS中1小时。
- 在1X PBS洗涤3次5分钟并安装到盖玻片幻灯片安装介质。
- 从盖玻片和密封用透明指甲油的边缘多余的真空安装介质。
- 在具有40X 1.4NA目标，啶能力和EM-CCD倒置显微镜收集广角落射荧光图像。
- 手动分析使用ImageJ分支。在开放的ImageJ图像堆栈通过将文件拖动到窗口或将文件>打开>文件名 （ 图4A插图1）。
- 使用线>分割线，微量轴突，定义为从体细胞（ 图4A插图2 - 3）延伸的最长的神经突。
- 使用分析>工具>投资回报率经理，保存轴突作为跟踪感兴趣的区域。跟踪和保存每个分支轴突，定义为突起≥20微米长。包括在分析（ 图4A插图3 - 4）只有小学支（副产物从轴突发芽直接）。
- 按“M”来测量感兴趣的保存区域，并且以像素为单位的长度传输到电子表格，计算在微米的长度。
- 划分轴突分支≥20微米长度的次数，通过在微米轴突除以100得到每100μm长度轴突分枝的数目的长度。
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Representative Results
利用体外生物化学技术以测定神经元群体SDS抗性SNARE复合物的量。 图1示出探查SNAP-25，syntaxin1A和VAMP2的耐SDS SNARE复合测定的所得印迹以下完成。
在基底细胞膜TIRF显微镜提供了在单个细胞个体胞吐融合事件的高清晰度的图像。 图2A展示了用于识别VAMP2-phluorin介导的胞吐事件图像分析方法。插图显示作为发生囊泡融合和VAMP2-phluorin质膜内扩散。 图2B示出了在皮层神经元中发生过时间（秒）的胞吐事件的一个例子的单胞吐事件。缩放插图表示胞体，轴突分支，显示spati轴突生长锥此测定的人效用。圆表示单胞吐融合事件，其可以经由TIRF显微镜看到。
的netrin的缩时DIC成像刺激轴突分支揭示的轴突分支形成的定时; 图3示出了以下的netrin刺激轴突分支的实时的形成。白色箭头表示从一个分支站点的初始突出。黑色箭头表示至少20微米从主轴突分支尖端测量的完全形成，稳定分支。轴突分支的Netrin依赖性增加发生在以下外融合导蛋白依赖性增加。
固定细胞免疫与SNARE活性药理抑制组合表明SNARE介导的胞吐作用是皮质轴突分支的必要条件。 图4A，勾勒出一个循序渐进的过程分支描PERFO在Rmed指ImageJ的。 图4B示出了在3DIV皮层神经元的代表性图像。条件如下：未处理的，刺激的250纳克/毫升的netrin，或具有BONTA和250毫微克/毫升的netrin处理24小时。
图1.使用SNARE复合体的SDS阻力SNARE量化的度量一组 体外 。代表性免疫印迹探查SNARE复合体成员VAMP2，Syntaxin1A和SNAP-25和装载控制BIII微管蛋白。这两种SNARE复杂和可识别的单体蛋白质所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
PG“/>
图2.活细胞成像和胞吐囊泡融合图像分析步骤大纲皮层神经元胞吐囊泡融合事件的定量。（A）作为步使用ImageJ是手动进行它。 （B）的凹入面板显示单个VAMP2-pHlourin囊泡融合事件，因为它发生在时间。第二面板具有整体皮层神经元在2DIV表达VAMP2-pHlourin的TIRF显微镜图像。虚线框表示如下图所示的感兴趣区域：SOMA，轴突分支，轴突生长锥。与该地区的利益圆表示单个囊泡融合事件。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.长期活细胞DIÇ成像揭示的Netrin-1依赖性轴突分支。DIC活细胞表示轴突分枝的形成一皮层神经元的图像的时序响应于netrin的刺激。白色箭头神经突达到长度为20微米之前表示初始突起的点。黑色箭头表示bonafide分支（长度≥20微米）。时间表示为小时：分钟请点击此处查看该图的放大版本。
再加上胞吐毒素抑制图4.固定细胞免疫可见胞吐需要的Netrin-1相关轴突分支。（A）为轴突的定量跟踪和分析步骤在分支的netrin在大纲刺激3DIV皮层神经元。 （B）在各实验条件3DIV皮层神经元的代表性图像：未处理，用250纳克/毫升的netrin，或用10nM BONTA毒素加250纳克/毫升的netrin治疗刺激。绿色是F-肌动蛋白（鬼笔），红色是βIIItubulin。箭头表示轴突分支点≥20微米长。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 解 | 食谱 |
| 同质化的缓冲区 | 的10mM HEPES-NaOH洗涤的pH 7.4,150毫氯化钠，1mM的EGTA。加上必要的蛋白酶和磷酸酶抑制剂取决于细胞类型 |
| 2个样本缓冲液 | 60毫摩尔Tris-HCl pH值6.75，5％（体积/体积）FI巯基乙醇，2％（重量/体积）SDS，10％（重量/体积）甘油，0.007％（重量/v）的溴酚蓝 |
| PHEM固定液 | 60毫摩尔PIPES pH为7.0，25mM的HEPES pH为7.0，10mM的EGTA pH为8.0，2mM的MgCl 2的，0.12M的蔗糖，4％的PFA |
| 安装媒体 | 的20mM Tris pH值8.0，0.5％的N-丙基没食子酸，90％的高品质的甘油，的MilliQ H 2ö |
| 10X SDS电泳缓冲液 | 溶解30.0克Tris碱的，144.0克甘氨酸，和1000毫升水2 O，pH值8.310.0克SDS的。稀释1倍。 |
| 10X传输缓冲区 | 溶解于250毫米30.3克Tris和在1 LH 2 O 1.92维解决方案144.1克甘氨酸; （对于1升1×缓冲液加入100ml的10倍溶液200毫升MeOH中和700毫升冷的去离子H 2 O） |
| 无血清培养基（SFM） | 50毫升：0.5 ml的L-谷氨酰胺，将1ml B27，48.5毫升的Neurobasal介质 |
| 胰蛋白酶淬火介质（TQM） | 50毫升：0.5 ml的L-谷氨酰胺2.5毫升胎牛血清，47毫升Neurob荒漠和半荒漠媒体 |
| Tris缓冲盐水 | 50毫米的Tris-CL，pH值7.5，150毫米氯化钠1 LH 2 O; （对于TBS-T加入1ml吐温20） |
表1.解决方案
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Acknowledgments
RO1 - GM108970（SLG）和F31-NS087837（CW）：这项工作是由美国国立卫生研究院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
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