Protocol
הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כפופים לכללים והתקנות של ועדת UNC על טיפול בבעלי חיים בסטנדרטים NIH לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת ציפוי של נוירונים ניתק קורטיקלי
- להרדים נשים בהריון בעיתוי משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. סר המוח כולו מן הגולגולות של 15.5 היום עוברי (E15.5) הקורטקס עכברי microdissect מן אונה כל. לקבלת הוראות מפורטות לגבי microdissection של קליפת עכבר עוברית עיין Viesselmann ואח 8.
- מניחים לא יותר מ -4 הקורטקס ב 1 מ"ל של התקשורת לנתח בתוך microtube 1.6 מ"ל סטרילי. להוסיף 120 μl של 10x טריפסין להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי לערבב.
- באמצעות hemocytometer, לספור תאי זרע מנות תרבית תאים. הערה: 1 בחצי הכדור קליפת המוח מספק approximately שלוש מיליון תאים.
- עבור assay SDS עמיד המלכודת ביוכימיה המורכבת, צלחת שישה מיליון תאים לכל 35 צלחת מ"מ ולנצל שתי מנות לכל מצב. הערה: זו היא פשוטה באמצעות 6 צלחות גם כאשר משווים תנאים מרובים.
- עבור מבחני הסתעפות, נוירונים צלחת על חומצה חנקתית שטף coverslips עגול בצפיפות של 250,000 תאים לכל 35 מ"מ צלחת, הדמיה דסק"ש של צלחת הסתעפות האקסון בצפיפות של 150,000. צפיפויות אלו נמנעות צפיפות ולפשט ניתוח.
- עבור מיקרוסקופיה TIRF תא חי, resuspend שני מיליון נוירונים לכל transfection בתמיסה nucleofection ב RT.
- הוספת 100 μl של ההשעיה התא microtube המכיל 10 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי VAMP2-pHlourin ו electroporate עם Nucleofector פי היצרן פרוטוקול 9.
- לאחר transfections מייד להוסיף 500 μl של תקשורת מרווה טריפסין, להסיר השעיה מתא קובט הצליח ב מאורהצפיפות של 400,000 תאים לכל 35 מ"מ זכוכית PDL מצופה צלחת תחתית.
- פלייט כל נוירונים בקליפת המוח ב 2 מ"ל של תקשורת חופשית בסרום.
2. מלכודת Assay גיבוש Complex
הערה: מתחמי SDS עמידי מלכודת עובדו ונותחו כמתואר במקור 10 בשינויים המפורטים להלן. עבור נוגדנים אלטרנטיבה תוקף לאלה המשמשים כאן, עיין בסעיף חומרים.
- לעורר נוירונים בקליפת המוח E15.5 2 ימים במבחנה (DIV) עם 250 שליטה netrin-1 או אחיזת עיניים ng / ml עבור שעה 1 לפני תמוגה.
- לפני דגימות עיבוד, צנטריפוגות מגניב 4 מעלות צלזיוס, והטמפרטורה באמבט מים מוגדר 37 מעלות צלזיוס, ואת גוש חום עד 100 מעלות צלזיוס.
- הסר מנות תא מן החממה ומניח על קרח.
- התקשורת לשאוב מתאי, להחליף עם ~ 2 בופר פוספט קר מ"ל קרח (PBS) בעדינות 2 פעמים במשך 1 - 2 דקות לכל לשטוף.
- עבור assay זה, השתמש 2 בארות לכל מנצחition.
- לשאוב PBS מן הבאר הראשונה של מצב ולהחליף עם 250 חיץ המגון μl. השאר על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן באמצעות מרים תא, homogenize תא על קרח.
- לשאוב PBS מהבאר הבאה של אותו המצב ומוסיף את התערובת הומוגני לאחרונה אל הבאר. זה יגביר ריכוזי חלבון. חזור על הפעולה עבור כל תנאי.
- בסיום, פיפטה הומוגני פתרון microtube מראש מקורר 1.6 מ"ל על הקרח ולהוסיף 20% TritonX-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 1% TritonX-100. Triturate לערבב 10 פעמים עם 1,000 פיפטה μl תוך מזעור בועות.
- דגירת צינורות על קרח במשך 2 דקות כדי solubilize חלבונים. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 6,010 RCF ב 4 ° C עד גלולת חומר שאינו solubilized. הזז supernatant lysate לתוך צינור 1.6 מ"ל מקורר חדש על הקרח.
- ביצוע ניתוח ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד 11 ו לדלל דגימות פינהריכוז l חלבון של 3 - 5 מ"ג / מ"ל עם הנותרים חיץ המגון בתוספת 1% TritonX-100 לבין חיץ מדגם 5x בתוספת B-Mercaptethanol (BME).
- מחלקים כל מדגם ניסיוני שווה ל -2 צינורות. דגירת מדגם אחד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מתחמי מלכודת), והשני ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מונומרים מלכודת). היפוך צינורות לסירוגין לשמור דגימות בתמיסה.
- להקפיא דגימות ב -20 ° C עד מוכן להפריד באמצעות SDS-PAGE. לפני הפעלת דגימות באמצעות אלקטרופורזה באמצעות טכניקות סטנדרטיות, להרתיח מחדש דגימות מבושלות בעבר במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, אך להפשיר 37 ° C דגימות ב RT.
- כפילויות הפעל של דגימות (30 - 40 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם) משני 8% ו ג'ל 15%; 8% מספקים הפרדה אידיאלית של המתחם, ואילו 15% משמשים לכמת מונומרים חלבון מלכודת (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). לשמור על מקור כוח ב 70 V עד קו הצבע הוא דרך stacהמלך ג'ל ומתח עליה כדי 90V. הפעל ג'לים עד לצבוע בורח.
- כדי לשמר מונומרים, להעביר חלבונים 0.2 מיקרומטר קרום nitrocellulose על הקרח באמצעות חיץ העברת קר עם 20 מתנול% (MeOH) הוסיף, ב 70 V עבור 45 דקות.
- קרום יבש בצלחת מכוסה במשך שעה 2 ל O / N ב RT (O / N מספק את התוצאות הטובות ביותר).
- בלוק המלכודת ממברנות מורכבים ב 10% שור סרום אלבומין (BSA) במשך שעה 1 ב RT.
- כן נוגדנים ראשוניים (הכרת רכיבים מורכבים ספציפיים מלכודת) בדילול של 1: 1,000 ו חללית O / N ב 4 ° C על שייקר רוטרי.
- לשטוף כתמים טריס בופר בתוספת 0.1% Tween-20 (TBS-T) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- הכינו פתרונות נוגדנים משני ניאון בדילול של 1: 20,000 ב BSA 1% ב TBS-T ו- בדיקה עבור שעה 1, מכוסה ב RT. 2.12.1 חזור על שלב אחרי 1 hr.
- כתמי תמונה על במכונת שיקוף פלואורסצנטי מצוידים חבילת תוכנות ולכמת הוא שיתוף חלבון המלכודתmplex (להקות immunoreactive מעל 40kDa) ולהקות מונומר (להקות immunoreactive ב 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa עבור SNAP-25, VAMP2 ו syntaxin-1, בהתאמה) באמצעות הוראות היצרן עבור ציור ROIs מלבני.
3 אירועים הדמיה Exocytic באמצעות מיקרוסקופית TIRF
הערה: פרוטוקול זה דורש ציוד מיקרוסקופיה מיוחד כולל בתא סביבתי כדי לשמור על טמפרטורה, לחות ו- CO 2, מיקרוסקופ TIRF הפוך מצויד תאורת epifluorescent, בהגדלה גבוהה / צמצם מספרי גבוה (NA) מטרת TIRF, שלב XYZ אוטומטי, ו מכשיר תשלום מצמידים רגיש (CCD) גלאי. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ הפוך אוטומטי לחלוטין מצויד 100x 1.49NA TIRF מטרת ליזר מדינת 491 ננומטר מוצק ו CCD הכפלת אלקטרונים (EM-CCD). כל הציוד נשלטת על ידי תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת כוח פרוטוקול הדמיה על envirקאמרית, במת onmental, מנורה, מחשב, ואת המצלמה.
- מטרה בחר בתוך תוכנת הדמיה. ברגע המטרה היא במקום, להדק את דוד המטרה מסביב לצווארון.
- אשר המטרה כי הוא הוריד לגמרי לפני הבטחת החממה הבמה בחריץ הבמה. יוצקי מים מזוקקים לתוך פתחי כניסת חממת הבמה באופן שווה כדי למנוע דליפה.
- הפעל את מערכת הדגירה. פתח את השסתום אל טנק CO 2 ולאשר את הלחץ הוא מתאים למערכת לפי הוראות יצרן. אפשר קאמרי קצת זמן להגיע 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. לפני הוספת מנת ההדמיה, למקם קערה ריקה בחממה כדי למנוע התעבות מים על המטרה.
- כוח על מקור לייזר.
- חממה במה פתוחה ולהוסיף שמן טבילה העדשה. מניחים מדגם באינקובטור ולייצב בזרועות יציבות או משקל המנה. הרם את המטרה עד שהשמן הופך במגע עם החלק התחתון של המדגם. switch כדי תאורת אור המועבר ולמצוא מישור מוקד עצבי דרך oculars.
- התחל תוכנה לייזר ולהתחבר תוכנות שליטה לייזר. הגדר תאורה כדי widefield ובחר את המטרה בשימוש (1.49 100X NA TIRF מומלץ). מקדמים שבירת גדר של המדגם (תאים ~ 1.38). התאם עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון "תקשורת" עבור לייזר 491 ננומטר. התאם את המחוון 100 ואז להביא אותה בחזרה למטה לערך בין 20 - 40%. בדוק שוב "TTL".
- פוקוס על מדגם שוב תאורת אור מועברת. עבור אל תוכנת הדמיה ובחר 491 ננומטר תאורה לייזר תריס פתוח. פיין להתאים את נקודת המוקד של לייזר על התקרה ומרכז את הצבע על מרכז הסרעפת שדה סגור עם הקבל הסיר. מניח קבל במהופך על הספסל האופטי, כדי לא עדשה מאפסת.
- חלף קבל וללכת תוכנת TIRF ועומק חדירה להגדיר (PD) ל -110 ננומטר. עבור מ- תאורה widefield כדי TIRF תאורה פנימיתמצב ination הדמיה.
- מצא VAMP2-pHluorin לבטא בתאי דרך oculars באמצעות epifluorescence widefield עם מקור האור epifluorescent.
- להתאים את הפרמטרים הדמיה (זמן חשיפה, רווח וכוח לייזר) על מנת למקסם יחס אות לרעש וטווח דינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלית עוצמת הלייזר כדי להפחית photobleaching ו phototoxicity (למשל: חשיפה בין 50 - 100 msec, עם -15 - 30 רוכש 30% כוח ליזר מרבי).
- פוקוס אוטומטי רציף גדר לכל תא. רכישה לרכוש תמונת timelapse משובצת המתרחשת כל 0.5 שניות למשך 5 דקות. עבור תנאי מגורה-1 netrin, להוסיף 500 netrin-1 ng / ml כדי צלחת של תאים במנדף זרימה למינרית ולהחזיר את התבשיל כדי בחממה במשך שעה 1 לפני הדמיה.
- כדי לכמת את תדירות אירועי exocytic מנורמלים ליחידת שטח תא וזמן, ערימות תמונה פתוחות ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך החלון או מעבר אל הקובץ> פתח> שם קובץ (איור0; 2A הבלעה 1).
- כדי להסיר אותות ניאון יציבה שאינו מייצג אירועי איחוי שלפוחית, ליצור הקרנת z ממוצעת של הערימה כולה באמצעות תמונה> סטאק>-Project ת '> סוג הקרנה: עצמה ממוצעת. הפחת תמונה זה אומר מ לכל תמונה ב- timelapse באמצעות תהליך> מחשבון תמונה> Image1: מבצעת המחסנית שלך: נפחית Image2 הקרנת z ממוצע חדש שנוצרה. זה מדגיש אירועים exocytic (איור 2 א הבלעה 2 - 3).
- רוזן אירועי היתוך exocytic לפי עין. אירועים Exocytic מוגדרים כמו המראה של אות הקרינה מוגבל עקיפה, אשר מפזרת במהירות VAMP2-pHluorin מפזרת בתוך קרום התא (6 איור 2A הבלעה).
- השתמש בפקודת הסף כדי להדגיש את התמונה הראשונה באמצעות תמונה> התאם> סף> להתאים מחוון עד התא כולו הוא הדגיש סף (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
- תחת אנהlyze, לבחור SetMeasurements ולבדוק באזור ותווית התצוגה. בחר את אזור הסלולר thresholded שימוש באפשרות עקיבת שרביט ו 'מ' לחץ כדי למדוד (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
- העברת שני האירועים היתוך exocytic לספור, המדידות שטח התא, והזמן שחלף הדמיה לגיליון אלקטרוני לחשב מספר אירועים exocytic / 2 מ"מ / שעה (איור 2 א הבלעה 9).
4. התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) Timelapse מיקרוסקופית של אקסון מסעף
הערה: פרוטוקול מלא והדגמה עבור גישה כללית ההדמיה דסק"ש זמין 12. בעוד פרוטוקול זה מנצל דסק"ש, שיטות מיקרוסקופיה אור מסורות אחרות עשויות לשמש לאותן מטרות (למשל: לעומת שלב).
- בשעה 2 DIV, צלחת הדמיה תחתית זכוכית המקום המכיל נוירונים untransfected בתא מחומם מראש הסביבה לשמור על env לחironment עם 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. לנצל מיקרוסקופ מצויד עדשה אובייקטיבית 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA דסק"ש קבל NA גבוה עבור איכות תמונה הטובה ביותר ואת הפתרון.
- התאם את מישור המוקד למצוא נוירונים דרך oculars באמצעות תאורת אור מועברת.
- השימוש בפונקצית רכישת שטח רבה על תוכנת הדמיה, למצוא ולשמור את מיקומי XYZ של 6 תאים לפחות. מקם את הבמה כך נוירונים של לנכון עניין בתוך שדה הראייה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
- לגרות עם 250 ng / ml netrin-1 ולחץ על 'להתחיל רכישת שטח רב'. ברצף לרכוש תמונות בכל עמדה כל 20 שניות למשך 24 שעות, משתהה ברכישת refocusing לפי צורך.
- בדוק את התמונות בתוכנת הדמיה באמצעות Apps> סקור Multi נתונים מימדי> שם קובץ פתוח. זהה סניפי האקסון יציבים (20 מיקרומטר ארוך) הטופס כי במהלך פגישת ההדמיה. השתמש בכלי קו תיקו למדוד stableaxon branch מן הבסיס ב האקסון אל קצה על מנת להבטיח את ההסמכה אורך 20 מיקרומטר הוא נפגש.
- בגיליון אלקטרוני, לרשום את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר בליטות קרום ליזום באזורים שבהם סניפים מאוחר יותר ליצור, כמו גם את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר סניפים המתהווה להגיע ל -20 מיקרומטר באורך.
- להכפיל את מספר מסגרות בין בליטת היווצרות ענף ב -20 שניות כדי לחשב את זמן היווצרות לסניף.
5. מניפולציות הרעלן Immunofluoresence סלולרי קבוע
- בשעה 2 DIV, לטפל נוירונים בתנאי ניסוי עם 250 ng / ml netrin-1 ו / או 10 ננומטר בוטולינום טוקסין (BoNTA), אשר וחותך את SNAP25 חלבון המלכודת וביעילות מעכב בתיווך המלכודת exocytosis 13, בתוספת 250 ng / ml netrin- 1. השאר קבוצה אחת של נוירונים לא מטופל כמו מצב שליטה.
זהירות: BoNTA מחייב שימוש עין להגנת נשימה בעת הכנה ושימושפתרונות. שמור את כל חומרים מזוהם כחומר חיטוי ביולוגי מסוכנים בהקדם האפשרי. - בשעה 3 DIV (טיפול פוסט 24 שעות) התקשורת לשאוב, ומיד להחליף עם לפחות 1 מ"ל של תיקון PHEM (ראה טבלה 1 לפרטים נוספים) חימם עד 37 מעלות צלזיוס. דגירה של 20 דקות בחושך ב RT.
- לשטוף 3x עם PBS (עבור חותם לשימוש עתידי עם parafilm ולאחסן ב 4 ° C).
- coverslips מקום בתא מכתים כהה, humidified ו permeabilize קרום התא למשך 10 דקות ב 0.2% TritonX-100 בדילול הטרי PBS (עשויות 10% TritonX-100 מניות).
- הסר פתרון permeabilization ולשטוף עם 50 μl של 1x עם PBS. בלוק למשך 30 דקות ב ~ 50 μl של 10% שור סרום אלבומין PBS (BSA-PBS) או 10% מבושל דונקי סרום PBS ב RT.
- לשטוף עם 1x PBS שוב. דגירת coverslips ב 50 μl של נוגדן ראשוני (1: טובולין βIII 1,000, כדי לאשר את זהות עצבית) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 ב RT, בחושך.
- בצע 3x 5 שטיפות דקות ב PBS. דגירה coverslips ב 50 μl של נוגדנים משני-מובחנת ספקטרלית עבור טובולין (1: 400), ו phalloidin ניאון (משתנה בהתאם עירור: 488 phalloidin ב 1: 400, 647 phalloidin ב 1: 100) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 .
- לשטוף 3x 5 דקות 1x PBS ו הר coverslips על שקופיות במדיה גוברים.
- תקשורת הרכבה עודפת אבק מן הקצוות של coverslip ואת החותם עם לק ברור.
- איסוף תמונות epifluorescence widefield על מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה 40X 1.4NA, יכולות epifluorescent ו-CCD EM.
- ידני לנתח הסתעפות באמצעות ImageJ. ערימות פתח את התמונה ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך חלון או מעבר אל קובץ> פתח> שם הקובץ (הבלעה 4A איור 1).
- באמצעות קו> קו מקוטע, להתחקות אחר האקסון, מוגדר neurite הארוך המשתרע סומה (איור 4 א ההבלעה 2 - 3).
- שימוש לנתח> כלים> מנהל ROI, להציל את האקסון התחקות כאזור של עניין. עקבות ולשמור בכל סניף האקסון, המוגדר מיקרומטר neurite ≥20 באורך. כולל את מערך סניפים עיקריים בלבד (בצמחי הנבטה ישירות האקסון) ב (הבלעת 4A איור 3 - 4) ניתוח.
- 'מ' לחץ כדי למדוד את האזורים השמורים של עניין, ולהעביר אורכי בפיקסלים לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את האורך ב מיקרומטר.
- מחלקים את מספר הסניפים האקסון ≥20 מיקרומטר אורך, לפי אורך של האקסון מיקרומטר מחולק 100 כדי לקבל מספר הסניפים האקסון לכל אורך 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניצול טכניקות ביוכימיות במבחנה assay את כמות מתחמי מלכודת עמידה SDS בקרב אוכלוסייה של נוירונים. איור 1 מציג את הכתם מערבי וכתוצאת ההשלמה הבאה של assay SDS העמיד המלכודת המורכבת תרה אחרת SNAP-25, syntaxin1A ו VAMP2.
מיקרוסקופיה TIRF על הממברנה של התאים הבזליים מספקת תמונות ברזולוציה גבוהות של אירועי היתוך exocytic פרט תאים בודדים. איור 2A מדגים את שיטת ניתוח תמונה לזיהוי אירועי exocytic בתיווך VAMP2-pHluorin. מראה הבלעה אירוע בודד exocytic כמו איחוי שלפוחית מתרחשת וכפי VAMP2-pHluorin מפזרת בתוך קרום התא. איור 2B מראה דוגמה של אירוע exocytic המתרחשים לאורך זמן (שניות) ב נוירון בקליפת המוח. ריבועי תקריב לציין סומה, ענף האקסון ו חרוט צמיחה אקסונלית מראה את spatiשירות אל של assay זה. מעגלים לציין אירועי היתוך exocytic יחידים, אשר ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ TIRF.
הדמיה של netrin Timelapse דסק"ש מגורה הסתעפות האקסון מגלה עיתוי היווצרות סניף האקסון. איור 3 מתאר את היווצרות של ענף האקסון בזמן אמת בעקבות גירוי netrin. ראשי חץ לבנים מציינים את הבליטה הראשונית מאתר סניף. ראשי חץ שחור לציין סניף, יציבה נוצר באופן מלא של 20 מיקרו-מטר לפחות מדידת מן האקסון הראשי אל קצה הסניף. Netrin עליות תלויות הסתעפות האקסון מתרחשת לאחר עליות תלויות netrin בתהליך איחוי exocytic.
Immunocytochemistry תא קבוע בשילוב עם עיכוב פרמקולוגי של פעילות המלכודת מראה כי exocytosis בתיווך המלכודת הינה דרישה עבור הסתעפות האקסון קליפת המוח. איור 4 א, מתאר צעד אחר צעד בתהליך של העתקים סניף perfo rmed ImageJ. איור 4B מראה תמונות נציג של נוירונים בקליפת המוח על 3DIV. התנאים הם כדלקמן: מטופל, מגורה עם 250 netrin ng / ml, או שטופלו BoNTA ו -250 netrin ng / ml למשך 24 שעות.
איור 1. באמצעות התנגדות SDS של מכלולי מלכודת כמו במערך של המלכודת לכימות מטרי במבחנה. כתם מערבי נציג חקר לחברי מורכבי מלכודת VAMP2, Syntaxin1A ו SNAP-25 ואת טובולין טעינה מלא BIII. שני מלכודת חלבונים מונומרים מורכבת לזיהוי מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
pg "/>
תא הדמיה איור 2. לגור וכימות של אירועים פיוז'ן Exocytic שלפוחית נוירונים קליפתיים. (א) צעד אחר צעד המתאר של ניתוח התמונה איחוי שלפוחית exocytic כפי שהוא בוצע באופן ידני באמצעות ImageJ. (ב) לוחות הבלעה להראות אירוע איחוי שלפוחית אחת VAMP2-pHlourin כפי שהוא מתרחש לאורך זמן. הפאנל השני שמציעות תמונת מיקרוסקופ TIRF של נוירון קורטיקלי כולה להביע VAMP2-pHlourin ב 2DIV. תיבות קו מקווקוות מציינות את האזורים של עניין, כפי שמוצגים להלן: סומה, סניף האקסון, וכן חרוט צמיחה אקסונלית. מעגליים עם האזורים של עניין לציין אירועי איחוי שלפוחית יחידים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. לטווח ארוך DI תא חיC הדמיה חושף עיתוי Netrin-1 Dependent אקסון מסעף. DIC תמונות תא חי של נוירון קורטיקלי מראה את היווצרות של סניפים האקסון בתגובה לגירוי netrin. ראשי חץ לבן מציינים נקודות של בליטה הראשונית לפני neurite לכת 20 מיקרומטר באורך. ראשי חץ שחור לציין סניפים bonafide (אורך ≥20 מיקרומטר). זמן מסומן כמו שעה:. דקות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. קבוע סלולרי Immunofluorescence יחד עם רעלן עיכוב של Exocytosis מראה כי Exocytosis נדרש Netrin-1 Dependent אקסון מסעף. (א) מתאר את הצעדים מעקב וניתוח כימות של האקסון הסתעפות בתוך netrin מגורה נוירון קורטיקלי ב 3DIV. (ב) נציג תמונות של נוירונים בקליפת המוח על 3DIV של כל תנאי הניסוי: מטופל, מגורה עם 250 ננוגרם / מ"ל netrin, או מטופלים עם 10 רעלן ננומטר BoNTA בתוספת 250 netrin ng / ml. גרין הוא F-אקטין (phalloidin), אדום הוא βIIItubulin. חצים לציין נקודות סניפים האקסון ≥20 מיקרומטר באורך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פִּתָרוֹן | מַתכּוֹן |
חיץ המגון | 10 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.4,150 מ"מ NaCI, 1 מ"מ EGTA. פלוס פרוטאז ו phosphatase הכרחי מעכבי תלוי בסוג התא |
חיץ מדגם 2x | 60 מ"מ טריס-HCI pH 6.75, 5% (v / v) FI-mercaptoethanol, 2% (w / v) SDS, 10% (w / v) גליצרול, 0.007% (w /נ) כחול bromophenol |
מקבע PHEM | 60 צינורות מ"מ pH 7.0, 25mm HEPES pH 7.0, 10mm EGTA pH 8.0, 2 מ"מ MgCl 2, 0.12 סוכרוז M, 4% PFA |
תקשורת הרכבה | 20 מ"מ טריס pH 8.0, 0.5% N-Propyl-gallate, 90% גליצרול באיכות גבוהה, MilliQ H 2 O |
10X SDS הפעיל מאגר | ממיסים 30.0 גרם של בסיס טריס, 144.0 גרם של גליצין, ו -10.0 גרם של SDS ב -1,000 מ"ל של H 2 O, pH 8.3. לדלל את 1x. |
מאגר העברת 10X | ממיסים טריס 30.3 גרם במשך 250 מ"מ ו 144.1 גרם גליצין עבור 1.92 M פתרון 1 LH 2 O; (עבור 1 L חיץ 1x להוסיף פתרון 10x 100 מ"ל כדי MeOH 200 מ"ל ו 700 מ"ל קר DI H 2 O) |
סרום חינם מדיה (SFM) | 50 מ"ל: 0.5 מ"ל L-Glutamine, 1 מ"ל B27, 48.5 מ"ל מדיה Neurobasal |
טריפסין מרווה מדיה (TQM) | 50 מ"ל: 0.5 מ"ל L-Glutamine, 2.5 FBS מ"ל, 47 מ"ל Neurobמדיה ASAL |
טריס בופר | 50 מ"מ טריס-Cl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl ב 1 LH 2 O; (לקבלת TBS-T להוסיף 1 מ"ל-20 Tween) |
לוח 1. פתרונות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות: RO1-GM108970 (SLG) ו F31-NS087837 (CW).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
10x trypsin | Sigma | 59427C | |
HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alternative Validated Antibodies | |||
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
- Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
- Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).