Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

संयुक्त तरीके का उपयोग एक्जॉन शाखाओं में बंटी और Neuronal Morphogenesis के दौरान के प्लाज्मा झिल्ली प्रसव भूमिका को परिभाषित करने के लिए

Published: March 16, 2016 doi: 10.3791/53743

Protocol

अनुसंधान नैतिकता का कथन: इस के साथ साथ विस्तृत जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों नियमों और पशु की देखभाल पर यूएनसी समिति के नियमों के और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए एनआईएच मानकों के अधीन हैं।

1. तैयारी और Dissociated cortical न्यूरॉन्स के चढ़ाना

  1. सीओ द्वारा समय गर्भवती महिलाओं Euthanize 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया। प्रत्येक गोलार्द्ध से भ्रूण दिन 15.5 (E15.5) चूहों और microdissect cortices की खोपड़ी से पूरे दिमाग निकालें। भ्रूण माउस कॉर्टेक्स के microdissection देखने के लिए कृपया Viesselmann एट अल 8 के बारे में विस्तृत निर्देशों के लिए।
  2. विदारक मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोई अधिक से अधिक 4 cortices एक बाँझ 1.6 मिलीलीटर microtube में रखें। 10x trypsin के 120 μl जोड़ें और ट्यूब 3 पलटना - 5 बार मिश्रण करने के लिए।
  3. एक hemocytometer का उपयोग गिनती कोशिकाओं सेल संस्कृति बर्तन बीज के लिए। नोट: 1 cortical गोलार्द्ध प्रदान करता है approximately तीन लाख कोशिकाओं।
    1. एसडीएस प्रतिरोधी जाल जटिल जैव रसायन परख के लिए, 35 मिमी पकवान प्रति छह लाख कोशिकाओं थाली और शर्त के अनुसार दो व्यंजन का उपयोग। नोट: यह जब कई की स्थिति की तुलना में अच्छी तरह से 6 प्लेट का उपयोग द्वारा सरल है।
    2. शाखाओं में बंटी assays के लिए, नाइट्रिक एसिड पर थाली न्यूरॉन्स परिपत्र coverslips 35 मिमी पकवान प्रति 250,000 कोशिकाओं के घनत्व पर, 150,000 के घनत्व पर धोया अक्षतंतु शाखाओं में थाली के डीआईसी इमेजिंग के लिए। These घनत्व भीड़भाड़ से बचने और विश्लेषण आसान बनाने में।
  4. जीवित कोशिका TIRF माइक्रोस्कोपी के लिए, आरटी पर nucleofection समाधान में अभिकर्मक प्रति दो लाख न्यूरॉन्स resuspend।
    1. निर्माता प्रोटोकॉल 9 के अनुसार एक Nucleofector साथ VAMP2-pHlourin प्लाज्मिड अभिव्यक्ति और electroporate के 10 माइक्रोग्राम से युक्त microtube सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें।
    2. बाद transfections तुरंत trypsin शमन मीडिया के 500 μl जोड़ने के लिए, एक गुफा में क्युवेट और प्लेट कोशिकाओं से निलंबन हटाने35 मिमी पीडीएल लेपित गिलास नीचे पकवान प्रति 400,000 कोशिकाओं की चर्चाएं।
  5. प्लेट सीरम मुक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर में सभी cortical न्यूरॉन्स।

2. जाल जटिल गठन परख

नोट: एसडीएस प्रतिरोधी जाल परिसरों संसाधित और मूल रूप में संशोधनों के नीचे विस्तृत के साथ 10 में वर्णित विश्लेषण किया गया। यहां इस्तेमाल लोगों के लिए मान्य विकल्प एंटीबॉडी के लिए, सामग्री अनुभाग देखें।

  1. 1 सेल से पहले घंटे के लिए 250 एनजी / एमएल netrin -1 या नकली नियंत्रण के साथ इन विट्रो (DIV) में E15.5 cortical न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित 2 दिन।
  2. प्रसंस्करण के नमूने, 4 डिग्री सेल्सियस तक शांत सेंट्रीफ्यूज, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट नहाने के पानी के तापमान, और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी ब्लॉक करने से पहले।
  3. इनक्यूबेटर से सेल बर्तन निकालें और बर्फ पर जगह है।
    1. धोने के प्रति 2 मिनट - कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया, ~ 2 के साथ मिलीलीटर बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 1 के लिए धीरे 2 बार की जगह।
    2. इस परख के लिए, cond प्रति 2 कुओं का उपयोगition।
    3. एक शर्त के पहले अच्छी तरह से महाप्राण पीबीएस और 250 μl homogenization बफर के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें, और फिर एक सेल चोर का उपयोग कर, बर्फ पर कोशिकाओं homogenize।
    4. एक ही शर्त के अगले अच्छी तरह से पीबीएस Aspirate और अच्छी तरह से करने के लिए हाल ही में homogenized मिश्रण जोड़ें। यह प्रोटीन सांद्रता में वृद्धि होगी। सभी स्थितियों के लिए दोहराएँ।
    5. पूरा होने पर, पिपेट बर्फ पर homogenized एक पूर्व ठंडा 1.6 एमएल microtube का हल और 1% TritonX-100 के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 20% TritonX-100 जोड़ें। 1,000 μl विंदुक के साथ 10 बार मिश्रण Triturate बुलबुले को कम करते हुए।
  4. बर्फ पर ट्यूबों सेते 2 मिनट प्रोटीन solubilize करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 6,010 आरसीएफ में ऊष्मायन, 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज के बाद गैर solubilized सामग्री गोली। बर्फ पर नए ठंडा 1.6 मिलीलीटर ट्यूब में lysate सतह पर तैरनेवाला ले जाएँ।
  5. ब्रैडफोर्ड परख 11 का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता विश्लेषण करते हैं और एक वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं को नमूने पतलाएल 3 के प्रोटीन एकाग्रता - 5 मिलीग्राम / homogenization बफर 1% TritonX-100 और 5x नमूना बफर बी Mercaptethanol (बीएमई) के साथ पूरक के साथ पूरक शेष के साथ मिलीलीटर।
  6. प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना 2 ट्यूबों में समान रूप से विभाजित करते हैं। 30 मिनट (SNARE परिसरों), और 30 मिनट (SNARE monomers) के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर दूसरे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नमूना सेते हैं। ट्यूबों पलटना रहकर समाधान में नमूने रखने के लिए।
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रुक एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग करने के लिए तैयार है जब तक। 100 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मानक तकनीक का उपयोग वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से नमूने चल रहा है, पहले से उबला हुआ नमूने reboil, लेकिन आरटी पर 37 डिग्री सेल्सियस के नमूने पिघलना करने के लिए पहले।
  8. नमूने के चलाने के डुप्लिकेट (30 - 40 माइक्रोग्राम प्रति नमूना प्रोटीन की) दोनों एक 8% और 15% जेल पर; जबकि 15% जाल प्रोटीन मोनोमर (स्नैप-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa) यों इस्तेमाल किया जाता है 8%, परिसर के आदर्श जुदाई प्रदान करता है। 70 वी में शक्ति के स्रोत को बनाए रखने के लिए जब तक डाई लाइन Stac के माध्यम से हैराजा जेल और 90V करने के लिए वृद्धि वोल्टेज। जैल चलाने के लिए जब तक डाई बंद चलाता है।
  9. monomers की रक्षा करने के लिए, 45 मिनट के लिए 20% मेथनॉल (MeOH) के साथ जोड़ा ठंड हस्तांतरण बफर का उपयोग, 70 वी पर बर्फ पर 0.2 माइक्रोन nitrocellulose झिल्ली के लिए प्रोटीन हस्तांतरण।
  10. हे करने के लिए 2 घंटे के लिए एक कवर डिश में सूखी झिल्ली / आरटी पर एन (ओ / एन सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करता है)।
  11. ब्लॉक आरटी पर 1 घंटे के लिए 10% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में जटिल झिल्ली फन्दा।
  12. एक रोटरी प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 और जांच हे / एन: 1 के कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी (विशिष्ट जाल जटिल घटकों को पहचानने) तैयार करें।
    1. Tris खारा बफर प्लस 0.1% बीच 20 (टीबीएस-टी) 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार में दाग कुल्ला।
  13. 1 घंटा, आरटी पर कवर के लिए टीबीएस-टी में 20,000% 1 में बीएसए और जांच: 1 के कमजोर पड़ने पर फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। 1 घंटे के बाद दोहराएँ चरण 2.12.1।
  14. एक फ्लोरोसेंट स्कैनिंग मशीन पर छवि blots सॉफ्टवेयर सूट के साथ सुसज्जित है और दोनों SNARE प्रोटीन सह योंmplex (40kDa ऊपर immunoreactive बैंड) और मोनोमर बैंड (25 केडीए, 18 केडीए, तस्वीर-25, VAMP2 के लिए 35 केडीए पर immunoreactive बैंड और syntaxin -1, क्रमशः) आयताकार ROIs ड्राइंग के लिए निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर।

3. TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग Exocytic आयोजन

नोट: इस प्रोटोकॉल एक पर्यावरण कक्ष के तापमान, आर्द्रता और सीओ 2, एक औंधा TIRF एक epifluorescent रोशनी, एक उच्च वृद्धि / उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) TIRF उद्देश्य, एक स्वचालित XYZ मंच के साथ सुसज्जित खुर्दबीन बनाए रखने के लिए सहित विशेष माइक्रोस्कोपी उपकरणों की आवश्यकता है, और एक संवेदनशील चार्ज कपल्ड डिवाइस (सीसीडी) डिटेक्टर। इस प्रोटोकॉल एक पूरी तरह से स्वचालित उल्टे एक 100x 1.49NA TIRF उद्देश्य के लिए एक ठोस राज्य 491 एनएम लेजर और एक इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी (ईएम सीसीडी) के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है। सभी उपकरण इमेजिंग और लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। पहले शुरुआत करने के लिए वातावरण पर इमेजिंग प्रोटोकॉल बिजलीonmental कक्ष, मंच, दीपक, कंप्यूटर, और कैमरा।

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर उद्देश्य चुनें। एक बार उद्देश्य जगह में है, कॉलर के आसपास उद्देश्य हीटर जकड़ना।
  2. पुष्टि करें कि उद्देश्य चरण स्लॉट में मंच इनक्यूबेटर हासिल करने से पहले पूरी तरह से उतारा है। रिसाव को रोकने के लिए समान रूप से मंच इनक्यूबेटर inlets में आसुत पानी डालो।
  3. ऊष्मायन प्रणाली चालू करें। सीओ 2 की टंकी के लिए वाल्व खोलने और इस बात की पुष्टि दबाव निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिस्टम के लिए उपयुक्त है। चैम्बर कुछ समय 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति दें। इमेजिंग पकवान जोड़ने से पहले, इनक्यूबेटर में एक खाली जगह पकवान उद्देश्य पर पानी संक्षेपण से बचने के लिए।
  4. लेजर स्रोत पर पावर।
  5. खुला मंच इनक्यूबेटर और लेंस को विसर्जन के तेल जोड़ें। इनक्यूबेटर में नमूना प्लेस और स्थिरता हाथ या एक डिश वजन के साथ स्थिर। उद्देश्य उठाएँ जब तक तेल के नमूने के नीचे के साथ संपर्क में आता है। switcप्रेषित प्रकाश रोशनी करने के लिए एच और oculars के माध्यम से न्यूरोनल फोकल हवाई जहाज़ पाते हैं।
  6. लेजर सॉफ्टवेयर शुरू और लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर से कनेक्ट। सेट widefield और चुनें उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा रहा रोशनी (100x 1.49 एनए TIRF सिफारिश की है)। नमूने के अपवर्तनांक सेट (कोशिकाओं ~ 1.38)। 491 एनएम लेजर के लिए "टीटीएल" अनचेक करके लेजर तीव्रता को समायोजित करें। 100 के लिए स्लाइडर को समायोजित करें तो 20 के बीच एक मूल्य वापस करने के लिए इसे नीचे लाने के - 40%। "टीटीएल" पुनः जाँच।
  7. प्रेषित प्रकाश रोशनी में फिर से नमूना पर ध्यान दें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर करने के लिए जाओ और 491 एनएम लेजर रोशनी और खुले शटर का चयन करें। ललित छत पर लेजर का केन्द्र बिन्दु को समायोजित करने और कंडेनसर हटा साथ बंद क्षेत्र डायाफ्राम के केंद्र के बिंदु को केंद्र। कंडेनसर की जगह उल्टा ऑप्टिकल बेंच पर बैठ इतनी के रूप में खरोंच लेंस के लिए नहीं।
  8. कंडेनसर बदलें और 110 एनएम के लिए TIRF सॉफ्टवेयर और सेट प्रवेश गहराई (पीडी) के लिए जाना। widefield रोशनी से TIRF आज में स्विच करेंइमेजिंग के लिए ination मोड।
  9. VAMP2-pHluorin epifluorescent प्रकाश स्रोत के साथ widefield epifluorescence का उपयोग कर oculars के माध्यम से कोशिकाओं को व्यक्त करने लगता है।
    1. 30 - एक 15 के साथ, 100 मिसे - के बीच 50 एक्सपोजर: इमेजिंग मानकों (जोखिम समय, लाभ और लेजर पावर) कम से कम जोखिम समय और लेजर तीव्रता का उपयोग कर photobleaching और phototoxicity (उदाहरण के लिए कम करने के लिए शोर अनुपात और गतिशील रेंज के लिए संकेत अधिकतम करने के लिए समायोजित करें 30% अधिकतम लेजर पावर) में लाभ।
    2. सेल प्रति निरंतर ऑटोफोकस सेट करें। एक timelapse छवि अधिग्रहण के 5 मिनट के लिए हर 0.5 सेकंड होने वाली के साथ सेट मोल। netrin -1 प्रेरित हालत के लिए, एक लामिना का प्रवाह हुड में कोशिकाओं की डिश के लिए 500 एनजी / एमएल netrin -1 जोड़ें और 1 इमेजिंग के लिए पहले घंटे के लिए इनक्यूबेटर पकवान वापसी।
  10. , ImageJ में खुला छवि के ढेर खिड़की में फाइल खींचकर या> ओपन> फाईल का नाम (चित्रा फाइल करने के लिए जा रहा द्वारा सेल क्षेत्र और समय के अनुसार सामान्य exocytic घटनाओं की आवृत्ति यों0; 2A इनसेट 1)।
    1. औसत तीव्रता: स्थिर फ्लोरोसेंट संकेत है कि पुटिका संलयन घटनाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते निकालने के लिए, छवि> ढेर> जेड परियोजना> प्रक्षेपण प्रकार का उपयोग कर पूरे ढेर के एक औसत Z प्रक्षेपण पैदा करते हैं। timelapse प्रक्रिया का उपयोग कर> छवि कैलक्यूलेटर में प्रत्येक छवि से इसका मतलब यह छवि की घटाएँ> Image1: अपने ढेर ऑपरेशन: Image2 घटाएँ नव निर्मित औसत Z प्रक्षेपण। इस exocytic घटनाओं (- 3 चित्रा 2A इनसेट 2) पर जोर दिया।
    2. आंखों से exocytic संलयन घटनाओं गणना। Exocytic घटनाओं एक विवर्तन सीमित प्रतिदीप्ति संकेत है, जो तेजी से VAMP2-pHluorin प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 2A इनसेट 6) के भीतर diffuses के रूप में diffuses की उपस्थिति के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
    3. > छवि का उपयोग कर पहली छवि को उजागर समायोजित> दहलीज> जब तक पूरे सेल दहलीज पर प्रकाश डाला (- 8 चित्रा 2A इनसेट 7) है स्लाइडर को समायोजित करने के लिए सीमा आदेश का उपयोग करें।
    4. एना के तहतLyze, SetMeasurements चुनते हैं और जाँच क्षेत्र और प्रदर्शन लेबल। Thresholded सेलुलर क्षेत्र की छड़ी ट्रेसिंग उपकरण और प्रेस 'एम' का उपयोग को मापने के लिए (- 8 चित्रा 2A इनसेट 7) का चयन करें।
    5. स्थानांतरण दोनों exocytic संलयन घटनाओं गिनती, सेल क्षेत्र माप, और एक स्प्रेडशीट के लिए गुजरे इमेजिंग समय exocytic घटनाओं / 2 मिमी / समय की संख्या (2A चित्रा इनसेट 9) की गणना करने के लिए।

4. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) एक्जॉन शाखाओं में बंटी के Timelapse माइक्रोस्कोपी

नोट: एक पूरा प्रोटोकॉल और डीआईसी इमेजिंग के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण के लिए प्रदर्शन उपलब्ध 12 है। हालांकि इस प्रोटोकॉल डीआईसी का इस्तेमाल करता है, अन्य प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तरीकों (उदाहरण के लिए: चरण विपरीत) एक ही उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 2 DIV में जगह गिलास नीचे इमेजिंग पूर्व गर्म पर्यावरण कक्ष में untransfected न्यूरॉन्स युक्त पकवान एक उमस भरे वातावरण बनाए रखने के लिए5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस के साथ ironment। सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता और संकल्प के लिए एक खुर्दबीन एक 60x योजना Apochromat के साथ सुसज्जित, 1.4 एनए डीआईसी उद्देश्य लेंस और उच्च एनए कंडेनसर का उपयोग।
  2. प्रेषित प्रकाश रोशनी का उपयोग oculars के माध्यम से न्यूरॉन्स को खोजने के फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित करें।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर बहु ​​क्षेत्र अधिग्रहण समारोह का उपयोग करना, खोजने के लिए और कम से कम 6 कोशिकाओं के xyz स्थानों को बचाने। चरण की स्थिति तो यह है कि अच्छे परिणाम के लिए देखने के क्षेत्र के भीतर ब्याज फिट के न्यूरॉन्स।
    1. 250 एनजी के साथ उत्तेजित / मिलीलीटर netrin -1 और प्रेस 'आरंभ बहु क्षेत्र अधिग्रहण'। क्रमिक रूप से 24 घंटे के लिए हर 20 सेकंड प्रत्येक स्थिति में छवियों को प्राप्त, आवश्यक के रूप में अधिग्रहण और refocusing रोक।
  4. Apps का उपयोग इमेजिंग सॉफ्टवेयर में छवियों की समीक्षा> समीक्षा बहु आयामी डेटा> खुले फ़ाइल नाम। स्थिर अक्षतंतु शाखाओं (20 माइक्रोन लंबे) इमेजिंग सत्र के दौरान उस रूप को पहचानें। एक stableaxon branc को मापने के लिए लाइन ड्रा उपकरण का उपयोग करेंटिप करने के लिए अक्षतंतु पर बेस से ज सुनिश्चित करने के लिए 20 माइक्रोन लंबाई योग्यता पूरा किया जाता है।
    1. एक स्प्रेडशीट में, netrin उत्तेजना के बाद फ्रेम संख्या रिकॉर्ड जब झिल्ली उभार ऐसे क्षेत्र हैं जहां शाखाओं बाद में करने के साथ ही netrin उत्तेजना के बाद फ्रेम संख्या में फार्म जब नवजात शाखाओं लंबाई में 20 माइक्रोन तक पहुंचने में आरंभ।
    2. शाखा प्रति गठन के समय की गणना करने के लिए 20 सेकंड से फलाव और शाखा गठन के बीच तख्ते की संख्या को गुणा करें।

5. विष जोड़तोड़ और निश्चित सेल Immunofluoresence

  1. 2 DIV में 250 एनजी के साथ प्रयोगात्मक शर्तों में न्यूरॉन्स का इलाज / एमएल netrin -1 और / या 10 एनएम बोटुलिनम विष (Bonta), जो cleaves जाल प्रोटीन SNAP25 और प्रभावी ढंग से रोकता है SNARE मध्यस्थता exocytosis 13, प्लस 250 एनजी / एमएल netrin- 1। नियंत्रण शर्त के रूप में इलाज न्यूरॉन्स के एक सेट छोड़ दें।
    चेतावनी: Bonta आंख और सांस की सुरक्षा के उपयोग जब तैयार करने और उपयोग करने की आवश्यकतासमाधान की। जितनी जल्दी हो सके biohazardous सामग्री और आटोक्लेव के रूप में सभी दूषित सामग्री को बनाए रखें।
  2. 3 DIV (24 घंटे बाद उपचार) महाप्राण मीडिया, और तुरंत PHEM तय (विवरण के लिए 1 टेबल देखें) के कम से कम 1 मिलीलीटर के साथ की जगह पर 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम। आरटी पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. (4 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और दुकान के साथ भविष्य में उपयोग के लिए सील) पीबीएस के साथ 3x कुल्ला।
  4. अंधेरा, humidified धुंधला कक्ष में रखें coverslips और पीबीएस में हौसले से पतला 0.2% TritonX-100 में 10 मिनट (10% TritonX-100 स्टॉक से बना) के लिए कोशिका झिल्ली permeabilize।
  5. permeabilization समाधान निकालें और पीबीएस के साथ 1x के 50 μl से कुल्ला। में 30 मिनट के लिए ब्लॉक ~ पीबीएस (बीएसए पीबीएस) में 10% गोजातीय सीरम albumin के 50 μl या 10% आरटी पर पीबीएस में गधा सीरम उबला हुआ।
  6. फिर 1x पीबीएस के साथ कुल्ला। आरटी पर 1 घंटे के लिए 1% बीएसए पीबीएस में: (1,000 βIII ट्यूबिलिन, न्यूरोनल पहचान की पुष्टि करने के लिए 1) प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μl में coverslips सेते, अंधेरे में।
  7. पीबीएस में 3x 5 मिनट washes प्रदर्शन करना। tubulin (1: 400) के लिए प्रेतसंबंधी-अलग माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 μl में coverslips सेते हैं, और फ्लोरोसेंट phalloidin (उत्तेजना से भिन्न होता है: 100 1 में 488 phalloidin: 400, 647 1 में phalloidin) 1 घंटे के लिए 1% बीएसए पीबीएस में ।
  8. 1x पीबीएस में धो 3x 5 मिनट और बढ़ते मीडिया में स्लाइड पर coverslips माउंट।
  9. coverslip और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील के किनारों से वैक्यूम अतिरिक्त बढ़ते मीडिया।
  10. एक 40x 1.4NA उद्देश्य, epifluorescent क्षमताओं और ईएम सीसीडी के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर widefield epifluorescence छवियों को ले लीजिए।
    1. मैन्युअल ImageJ का उपयोग शाखाओं में बंटी का विश्लेषण। खिड़की में फाइल खींचकर या फ़ाइल> ओपन> फाईल का नाम (चित्रा -4 ए इनसेट 1) जा रहा द्वारा ImageJ में ओपन छवि के ढेर।
    2. लाइन> खंडों लाइन का उपयोग करना, अक्षतंतु, सबसे लंबे समय तक neurite सोमा (- 3 चित्रा -4 ए इनसेट 2) से देने के रूप में परिभाषित का पता लगा।
    3. विश्लेषण> उपकरण> रॉय प्रबंधक का उपयोग करना, अक्षतंतु ब्याज की एक क्षेत्र के रूप में अनुरेखण बचाने के लिए। ट्रेस और प्रत्येक अक्षतंतु शाखा, लंबाई में एक neurite ≥20 माइक्रोन के रूप में परिभाषित बचाने के लिए। केवल प्राथमिक शाखाओं (outgrowths सीधे अक्षतंतु से अंकुरण) विश्लेषण (- 4 चित्रा -4 ए इनसेट 3) में शामिल करें।
    4. प्रेस 'एम' रुचि बचाया क्षेत्रों को मापने के लिए, और एक स्प्रेडशीट के लिए पिक्सल में लंबाई हस्तांतरण माइक्रोन में लंबाई की गणना करने के लिए।
    5. अक्षतंतु शाखाओं लंबाई में ≥20 माइक्रोन की संख्या में विभाजित, माइक्रोन में अक्षतंतु 100 से विभाजित प्रति 100 माइक्रोन लंबाई अक्षतंतु शाखाओं की संख्या प्राप्त करने की लंबाई से।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

उपयोग में इन विट्रो जैव रासायनिक तकनीक न्यूरॉन्स की आबादी में एसडीएस प्रतिरोधी जाल परिसरों की राशि की परख के लिए। चित्रा 1 परिणामस्वरूप पश्चिमी धब्बा स्नैप-25, syntaxin1A और VAMP2 के लिए जांच एसडीएस प्रतिरोधी जाल जटिल परख के पूरा होने के बाद पता चलता है।

बेसल कोशिका झिल्ली पर TIRF माइक्रोस्कोपी एकल कक्षों में अलग-अलग exocytic संलयन घटनाओं की उच्च संकल्प छवियों प्रदान करता है। चित्रा 2A को दर्शाता है VAMP2-pHluorin मध्यस्थता exocytic घटनाओं की पहचान करने के लिए छवि विश्लेषण पद्धति। के रूप में पुटिका संलयन होता है और के रूप में VAMP2-pHluorin प्लाज्मा झिल्ली के भीतर diffuses। चित्रा 2 बी एक cortical न्यूरॉन में (सेकंड) समय के साथ होने वाली एक exocytic घटना का एक उदाहरण दिखाता इनसेट एक भी exocytic घटना से पता चलता है। जूम insets सोमा, एक अक्षतंतु शाखा और एक axonal विकास spati दिखा कोन निरूपितइस परख के अल उपयोगिता। सर्किलों एकल exocytic संलयन घटनाओं, TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा जा सकता है जो निरूपित।

Netrin की Timelapse डीआईसी इमेजिंग प्रेरित अक्षतंतु शाखाओं अक्षतंतु शाखा के गठन के समय का पता चलता है। चित्रा 3 netrin उत्तेजना के बाद वास्तविक समय में एक अक्षतंतु शाखा के गठन को दर्शाया गया है। व्हाइट तीर एक शाखा साइट से प्रारंभिक फलाव निरूपित। काला तीर कम से कम शाखा टिप करने के लिए मुख्य अक्षतंतु से मापने 20μm की एक पूरी तरह का गठन, स्थिर शाखा निरूपित। अक्षतंतु शाखाओं में netrin निर्भर बढ़ जाती है exocytic संलयन में netrin निर्भर बढ़ जाती निम्नलिखित होता है।

निश्चित सेल SNARE गतिविधि के औषधीय निषेध के साथ संयुक्त immunocytochemistry पता चलता है कि SNARE मध्यस्थता exocytosis cortical अक्षतंतु शाखाओं में बंटी के लिए एक शर्त है। चित्रा -4 ए, कदम प्रक्रिया की शाखा ट्रेसिंग perfo द्वारा एक कदम की रूपरेखा में rmed ImageJ। चित्रा 4 बी 3DIV पर cortical न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता। 250 एनजी / एमएल netrin के साथ प्रेरित, या Bonta और 24 घंटे के लिए 250 एनजी / एमएल netrin के साथ इलाज इलाज, शर्तों की इस प्रकार हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. इन विट्रो में एक जाल की quantifiable मीट्रिक गठन के रूप में जाल परिसर के एसडीएस प्रतिरोध का उपयोग। एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा जाल जटिल सदस्यों VAMP2, Syntaxin1A और तस्वीर 25 और लोडिंग नियंत्रण BIII tubulin के लिए जांच की। दोनों फन्दा जटिल और पहचान योग्य monomers में प्रोटीन दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीजी "/>
चित्रा 2. लाइव सेल इमेजिंग और cortical न्यूरॉन्स में Exocytic पुटिका संलयन घटनाओं की मात्रा। (ए) exocytic पुटिका संलयन छवि विश्लेषण के कदम से कदम रूपरेखा के रूप में यह मैन्युअल ImageJ का उपयोग किया गया था। (बी) इनसेट पैनलों एक भी VAMP2-pHlourin पुटिका संलयन घटना दिखाने के रूप में यह समय के साथ होता है। दूसरी एक पूरी cortical न्यूरॉन 2DIV पर VAMP2-pHlourin व्यक्त करने का एक TIRF माइक्रोस्कोपी छवि की विशेषता पैनल। सोमा, अक्षतंतु शाखा है, और एक axonal विकास शंकु के रूप में नीचे दिखाया गया बिंदीदार रेखा बक्से हित के क्षेत्रों को निरूपित। हित के क्षेत्रों के साथ हलकों एकल पुटिका संलयन घटनाओं निरूपित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. लॉन्ग टर्म लाइव सेल डिसी इमेजिंग netrin उत्तेजना के जवाब में netrin -1 निर्भर एक्जॉन शाखाओं में बंटी। डीआईसी जीवित कोशिका एक cortical अक्षतंतु शाखाओं के गठन दिखा न्यूरॉन की छवियों के समय का पता चलता है। व्हाइट तीर neurite लंबाई में 20 माइक्रोन तक पहुँचने से पहले प्रारंभिक फलाव के अंक निरूपित। काला तीर वास्तविक शाखाओं (लंबाई ≥20 माइक्रोन) निरूपित। समय घंटे के रूप में चिह्नित:। मिन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. फिक्स्ड सेल इम्यूनोफ्लोरेसेंस exocytosis के विष निषेध के साथ युग्मित पता चलता है कि exocytosis के लिए आवश्यक है netrin -1 निर्भर एक्जॉन शाखाओं में बंटी। (ए) एक netrin में शाखाओं में बंटी अक्षतंतु की मात्रा का ठहराव के लिए ट्रेसिंग और विश्लेषण कदम की रूपरेखा 3DIV पर cortical न्यूरॉन को प्रेरित किया। (ख) प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के 3DIV पर cortical न्यूरॉन्स की छवियों प्रतिनिधि: अनुपचारित, 250 एनजी / एमएल netrin, या 10 एनएम Bonta विष प्लस 250 एनजी / एमएल netrin के साथ इलाज के साथ प्रेरित। ग्रीन एफ actin (phalloidin), लाल βIIItubulin है। तीर अक्षतंतु शाखाओं के अंक निरूपित लंबाई में ≥20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उपाय विधि
homogenization बफर 10 मिमी HEPES-NaOH पीएच 7.4,150 मिमी NACI, 1 मिमी EGTA। प्लस आवश्यक प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों सेल प्रकार पर निर्भर
2x नमूना बफर 60 मिमी Tris-एचसीआई पीएच 6.75, 5% (वी / वी) FI-mercaptoethanol, 2% (w / v) एसडीएस, 10% (w / v) ग्लिसरॉल, 0.007% (डब्ल्यू /v) bromophenol नीले
PHEM लगानेवाला 60 मिमी पाइप पीएच 7.0, 25mm HEPES पीएच 7.0, 10mm EGTA पीएच 8.0, 2 मिमी 2 MgCl, 0.12 एम सुक्रोज, 4% पीएफए
बढ़ते मीडिया 20 मिमी Tris पीएच 8.0, 0.5% N-propyl-gallate, 90% उच्च गुणवत्ता ग्लिसरॉल, MilliQ एच 2
10X एसडीएस चल बफर Tris आधार का 30.0 जी, ग्लाइसिन के 144.0 जी, और एच 2 ओ के 1000 मिलीलीटर, पीएच 8.3 में एसडीएस के 10.0 ग्राम भंग। 1x करने के लिए पतला।
10X स्थानांतरण बफर 250 मिमी के लिए 30.3 छ Tris और 1 एलएच 2 हे में 1.92 एम समाधान के लिए 144.1 छ ग्लाइसिन भंग; (1 एल के लिए 1x बफर ठंड डि एच 2 ओ 200 एमएल MeOH और 700 मिलीलीटर के लिए 100 एमएल 10x समाधान जोड़)
सीरम मुक्त मीडिया (SFM) 50 मिलीलीटर: 0.5 मिलीलीटर एल Glutamine, 1 मिलीलीटर B27, 48.5 मिलीलीटर Neurobasal मीडिया
Trypsin शमन मीडिया (टीक्यूएम) 50 मिलीलीटर: 0.5 मिलीलीटर एल Glutamine, 2.5 मिलीलीटर FBS, 47 मिलीलीटर Neurobasal मीडिया
TRIS खारा बफर 50 मिमी Tris-सीएल, पीएच 7.5, 1 एलएच 2 ओ में 150 मिमी NaCl; (टीबीएस-T के लिए जोड़ने के 1 मिलीलीटर बीच 20)

तालिका 1. समाधान

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

RO1-GM108970 (SLG) और F31-NS087837 (सीडब्ल्यू): इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture treated plates Olympus Plastics 25-105
glass coverslips Fisher scientific 12-545-81 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution Lonza VPG-1001 100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator Lonza program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes Matek Corporation p356-1.5-14-C must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope Olympus
Lambda LS xenon lamp Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective Olympus
Andor iXon EM-CCD Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System LI-COR Odyssey CL-X Used for scanning blots
Image studio software suite LI-COR Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus Molecular devices, LLC version 7.7.6.0 Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software Olympus Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J) NIH ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective Olympus
Neurobasal media GIBCO 21103-049 Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27 GIBCO 17504-044 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine 35050-061 1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin Bio Basic Incorporated 9048-46-8 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin Sigma 59427C
HEPES CELLGRO 25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg Corning 21-030-cm
Fetal bovine serum Corning/CELLGRO 35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning/CELLGRO 20-021-CV
NaCl Fisher scientific BP358-10
EGTA Fisher scientific CAS67-42-5
MgCl2 Fisher scientific BP214-500
TRIS HCl Sigma T5941-500
TRIS base Fisher scientific BP152-5
N-Propyl Gallate MP Biomedicals 102747
Glycerol Photometric grade Acros Organics 18469-5000
Glycerol (non optics grade) Fisher scientific CAS56-81-5
B-mercaptoethonal Fisher scientific BP176-100
SDS Fisher scientific BP166-500
Distilled Water  GIBCO 152340-147
Poly-D-Lysine Sigma p-7886 Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA List Biological Laboratories 128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2 Cell signaling 11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A Santa Cruz Biotechnology sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25 Santa Cruz Biotechnology sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin  Covance MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies LI-COR P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane Biorad 9004-70-0
Tween-20 Fisher scientific BP337-500
Methanol Fisher scientific S25426A
Bromphenol Blue Sigma B5525-5G
Sucrose Fisher scientific S6-212
Paraformaldehyde Fisher scientific O-4042-500
Triton-X100 Fisher scientific BP151-500
TEMED Fisher scientific BP150-20
40% Bis-Acrylimide Fisher scientific BP1408-1
Name Company Catalog Number Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone Sigma Aldrich S0664
 Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) Synaptic Systems 104-211
Mouse Monoclonal SNAP25 Synaptic Systems 111-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 109 TIRF माइक्रोस्कोपी डीआईसी timelapse exocytosis एक्जॉन शाखाओं में बंटी immunocytochemistry बोटुलिनम
संयुक्त तरीके का उपयोग एक्जॉन शाखाओं में बंटी और Neuronal Morphogenesis के दौरान के प्लाज्मा झिल्ली प्रसव भूमिका को परिभाषित करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkle, C. C., Hanlin, C. C.,More

Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (109), e53743, doi:10.3791/53743 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter